Il nostro protocollo ci permette di tracciare la bio-distribuzione e di confermare l'internalizzazione specifica dei tessuti di un peptide di interesse utilizzando due metodologie separate ma complementari. Possiamo utilizzare questo protocollo per massimizzare i dati ottenuti da un singolo animale e per acquisire dati quantitativi di imaging a fluorescenza assiale. Inoltre, possiamo ottenere immagini al microscopio qualitativo.
Dopo aver acquisito c-terminale amide sintetizzato in fase solida, i C-terminale amide CAP con un N-terminale etichettato con Cy5.5 da un impianto di sintesi peptidica, fare una o 10 millimolare soluzione di soluzione stock di CTP in solfossido di dimetile per lo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius protetto dalla luce. Il giorno dell'esperimento, caricare una dose di 10 milligrammi per chilogrammo di CTP Cy5.5 in 200 microlitri di PBS in una siringa per insulina. Pesare un mouse e consegnare per via endovenosa il peptide nel mouse CD1 femmina di sei settimane anestetizzato.
Lasciare circolare il peptide per il periodo di tempo sperimentale pre-specificato prima di eutanasia del mouse utilizzando una camera di CO2 ad alto flusso e usando forbici per aprire la cavità toracica e fare un piccolo graffio nella parete libera laterale dell'atrio destro. Utilizzare una siringa da cinque millilitri dotata di un ago calibro 26 per perfondere tre millilitri di fosfato di formalina tamponato al 10% attraverso l'apice ventricolare sinistro per fissare i tessuti e stanare eventuali globuli rossi. Quindi raccogliere il cuore, il polmone, il fegato, i reni, la milza, l'intestino grande e tenue, la vescica, le ovaie o i teste e il cervello in singoli pozzi di una piastra da 12 pozzetti per l'imaging ottico ex vivo.
Per l'imaging in vivo delle immagini trasdutte CTP, avviare il software di acquisizione delle immagini e fare clic su Inizializza per preparare il sistema per l'imaging. Aprire l'Imaging Wizard e selezionare Fluorescenza e Coppia filtro. Fate clic su Nomi(Names), Coloranti (Dyes), Cianuro (Cianuro) e Cy5 per impostare i parametri di eccitazione ed emissione.
Quindi fare clic su Impostazioni manuali per impostare l'esposizione su un secondo, il binning su piccolo, l'F/Stop su otto e il campo visivo su 15 centimetri. Fare clic su Acquisisci e impostare la cartella in cui salvare gli esempi. Aggiungere le informazioni sperimentali appropriate nella finestra modifica etichette immagine e fare clic su OK. Apparirà l'immagine acquisita.
Impostare le unità sull'efficienza radiante. Fare doppio clic sull'immagine e scegliere Correzioni e Sottrazione di sfondo fluorescente adattiva. Regolare la soglia per coprire solo gli organi di interesse con viola.
In alternativa, fate clic con il pulsante destro del mouse e selezionate Area ritaglia (Crop Area) per disegnare una casella contenente tutti i campioni di interesse. Una volta acquisite tutte le immagini, trasferire i campioni in flaconcini a scintillazione contenenti fosfato di formalina tamponato al 10% in un volume almeno 20 volte superiore a quello del tessuto e conservare i tessuti a temperatura ambiente protetti dalla luce per almeno 48 ore. Per quantificare le immagini, impostare le unità sull'efficienza radiante e sulla regione di interesse a quattro per tre.
Regolare la casella area di interesse per coprire uniformemente tutti i pozzi e fare clic su Misura aree di interesse. Quindi fare clic su Misure area di interesse griglia per abbinare le celle dell'area di interesse e fare clic su Esporta per salvare i dati in un file di testo o CSV. Quando gli organi sono sufficientemente fissati dopo un minimo di 48 ore, trasferire i campioni in cassette di lavorazione e incorporamento dei tessuti e caricare le cassette in una macchina per la lavorazione dei tessuti.
Impostare il processore per disidratare il tessuto con etanolo come indicato, seguito da compensazione con due trattamenti in xilene di 30 minuti e infusione di paraffina con quattro trattamenti di paraffina di 30 minuti. Dopo l'ultimo trattamento con paraffina, rimuovere i tessuti dalla macchina di lavorazione. Posizionare i tessuti in singoli stampi metallici e allineare ogni stampo con paraffina fusa.
Posizionare gli stampi su una piastra fredda. Mentre la paraffina nella parte inferiore dello stampo inizia a solidificarsi, posizionare gli organi nella paraffina. Quando tutti gli organi sono stati posizionati, posizionare una cassetta etichettata sopra lo stampo come supporto e riempire e riempire es eccessivo gli stampi con paraffina fusa.
Lasciare raffreddare la paraffina fino a quando non è solida prima di conservare i blocchi a meno 20 gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, impostare un microtomo con un angolo della lama di sei gradi e uno spessore di sezione di 10 micrometri e montare i blocchi di tessuto nel microtomo. Iniziare a tagliare fino a ottenere sezioni contenenti il tessuto e posizionare i blocchi a faccia in giù in un bagno d'acqua distillato di 38 gradi Celsius per cinque minuti o fino a quando il tessuto non ha assorbito un po 'di umidità.
Quando nel blocco appare un sottile contorno bianco del tessuto, posizionare il tessuto su un blocco di ghiaccio piatto per 10 minuti prima di restituirlo al microtomo nello stesso orientamento in cui è stato appena caricato. Iniziare a ottenere sezioni che consentono alle sezioni troncate di formare nastri lunghi da sei a 10 sezioni ciascuno. Per garantire un'acquisizione riuscita della sezione tissutale, mantenere il blocco idratato.
Riportare il blocco sul ghiaccio se la qualità della sezione è scarsa o inizia a diminuire. Scartare nastri di paraffina non ottimale fino a quando non viene prodotto un nastro di alta qualità di lunghezza sufficiente per coprire una diapositiva. Utilizzare un bordo smussato per trasferire nastri di qualità in un bagno d'acqua di 38 gradi Celsius e lasciare che le sezioni si siedano sulla superficie dell'acqua distillata fino a quando non si levigano.
Galleggiare le sezioni appiattite sulla superficie di uno scivolo di vetro pulito e sciogliere la cera in un forno a 65 gradi Celsius per 30 minuti. Per deparaffinizzare le diapositive, trattare i campioni tre volte con xilene per 10 minuti per trattamento. Dopo l'ultimo trattamento con xilene, reidratare i tessuti con immersioni di etanolo decrescente di cinque minuti come indicato, seguito da un'immersione di cinque minuti nella soluzione salina tris-tamponata.
Dopo aver permesso agli scivoli di asciugarsi durante la notte, montare le sezioni con coverlips e 125 microlitri di supporto integrati con DAPI e asciugare i vetrini durante la notte protetti dalla luce prima dell'imaging mediante microscopia a fluorescenza. Dopo la fissazione, il cuore, i polmoni, il fegato, i reni, la milza e il cervello degli animali sperimentali e di controllo sono disposti in una piastra da 12 porri per l'imaging fluorescente ottico ex vivo. Dopo la conversione dei conteggi in efficienza radiante, i dati di fluorescenza possono essere quantificati per ogni insieme di organi.
È importante notare che diversi organi dimostrano autofluorescenza in risposta a diverse lunghezze d'onda di eccitazione. Lunghezze d'onda di eccitazione più corte come la proteina fluorescente verde migliorata sono associate a livelli più elevati di autofluorescenza specialmente nel fegato e nel cervello rispetto alle lunghezze d'onda di eccitazione rosso o vicino all'infrarosso. La fissazione della formalina e l'incorporamento di paraffina di sezioni tissutali da ciascun organo consentono l'analisi immunofluorochimica dei marcatori cellulari di interesse, nonché la quantificazione delle cellule immunitarie o stromali di interesse all'interno di ciascun tessuto.
Regolare le impostazioni di imaging per evitare la saturazione e tenere traccia delle impostazioni, quindi applicare le stesse impostazioni di acquisizione ad altri campioni nello stesso esperimento per coerenza e precisione. L'immunoistochimica può anche essere eseguita sulle sezioni tissutali se un peptide che penetra nelle cellule candidate si co-localizza con una struttura o una proteina di interesse.
