Name: fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion
Uploaded: 2020-05-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion at JoVE.com

Questo lavoro è sostenuto finanziariamente da NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) e University of Connecticut.

1. Sintesi dei JBNT
NOTA: Il monomero JBNT è stato preparato come pubblicato in precedenza11.
<ol><li>Sintesi del composto A1<ol>
<li>Preparare una soluzione contenente 8,50 g di acido 2-cianoacetico e 9,80 g di etilcarbamato in 25 mL di toluene e 2,5 mL di N, N-dimetilformamide. Aggiungere 4,90 mL di cloruro di fosforile dropwise. Quindi scaldare la miscela a 70 °C e continuare a mescolare per 1,5 ore.</li>
		<li>Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente e versare 100 g di acqua ghiacciata. Estrarre lo strato acquoso con acetato di etile (3 x 250 mL) e lavare con 100 mL di salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per ottenere un solido giallo pallido.</li>
		<li>Sottosoggettare la cromatografia a colonna flash del solido giallo al gel di silice (3% di metanolo/diclorometano) per produrre 15,61 g di composto A1 come polvere bianca.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A2<ol>
<li>Mescolare 3,12 g di composto A1 e 2,75 g di carbonato di potassio in 50 mL di N, N-dimetilformamide. Mescolare a temperatura ambiente per 2 ore.</li>
		<li>Aggiungere 2,6 mL di disolfuro di carbonio alla sospensione di reazione. Continuare a mescolare per 4 ore.</li>
		<li>Aggiungere l'etanolo assoluto alla miscela di reazione a 0 °C. Filtrare il precipitato giallo e lavare con etere dietile. Asciugare sotto vuoto durante la notte per produrre 6,18 g di composto A2 come solido giallo pallido.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A3<ol>
<li>Aggiungere 2,7 mL di ioduro di metile in 15 mL di acetonitrile. Inoltre, preparare separatamente una soluzione di composto A2 aggiungendo 6,18 g di A2 a 80 mL di acqua / acetonitrile (rapporto 7:3). Mescolare entrambe le soluzioni e mescolare a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
		<li>Scaldare la miscela di reazione a 95 °C e continuare a mescolare per 3 ore.</li>
		<li>Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente, quindi evaporare i volatili sotto vuoto.</li>
		<li>Estrarre il residuo 3x con 100 mL di acetato di etile e lavare con salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per ottenere un solido giallo.</li>
		<li>Sottosoggettare il solido giallo alla cromatografia della colonna flash del gel di silice (30% acetato/esani etilico) per produrre 4,52 g del composto A3 come solido giallo chiaro.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A4<ol>
<li>Preparare la soluzione di alleilamina aggiungendo 925 μL di alleilamina in 20 mL di etanolo. Aggiungere questa soluzione dropwise alla soluzione del composto A3, preparato aggiungendo 3,14 g di A3 in 75 mL di etanolo assoluto, oltre 30 min. Quindi riscaldare la miscela di reazione al reflusso per 16 ore.</li>
		<li>Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente ed evaporare i volatili per dare un solido giallo.</li>
		<li>Sottosoggettare la cromatografia a colonna flash del solido giallo al gel di silice (50% di acetato/esani etilico al 2% di metanolo/diclorometano) per produrre 1,80 g di composto A4 come cristallo bianco.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A5<ol>
<li>Aggiungere 2,05 g di cloridrato di guanidinio e 7,8 mL di etoossido di sodio (21 wt% in etanolo) in 14 mL di etanolo assoluto. Scaldare la miscela a 45 °C per 15 minuti.</li>
		<li>Filtrare il materiale insolubile e aggiungere il filtrato direttamente nella soluzione del composto A4, preparato aggiungendo 2,70 g di A4 in 40 mL di etanolo assoluto. Riscaldare la miscela di reazione al reflusso per 16 ore.</li>
		<li>Filtrare il precipitato per ottenere 2,65 g di composto A5 come solido bianco sconto.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A6<ol>
<li>Aggiungere lentamente 24,9 mL di trietilammina alla miscela di liquami ottenuta aggiungendo 2,11 g di composto A5 e 1,10 g di 4-dimetilaminopiridina in 120 mL di tetraidrofurano oltre 1 min. Mescolare a temperatura ambiente per 2 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 20,7 mL di di-tert-butil dicarbonato dropwise alla miscela di reazione e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 40 h.</li>
		<li>Aggiungere 20 mL di acqua per spegnere la reazione. Evaporare i volatili sotto vuoto.</li>
		<li>Estrarre il residuo viscoso rosso con 500 mL di acetato di etile. Quindi, lavarlo con 250 mL di acqua, 75 mL di acido citrico al 10%, 2x con 200 mL di acqua, 200 mL di bicarbonato di sodio saturo e 200 mL di salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per dare un solido rosso/arancione.</li>
		<li>Sottosoggettare la cromatografia a colonna flash in gel di silice (acetato/esani di etile allo 0-20%) per produrre 3,87 g di composto A6 come schiuma bianca.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A7<ol>
<li>Aggiungere N-metilmorfolina N-ossido (50 wt.% in acqua, 1,64 mL) dropwise alla soluzione di composto A6 (2,93 g) in acetone/acqua (8:1, 58,5 mL) e mescolare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere tetraossido di osmio (soluzione acquosa al 4%) dropwise alla miscela per un periodo di 3 minuti e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 24 ore.</li>
		<li>Spegnere la reazione con solfito di sodio acquoso da 1,0 M fino a quando la soluzione diventa incolore. Rimuovere i volatili sotto vuoto per provocare un liquame bianco in acqua. Estrarre il residuo con 350 mL di diclorometano e quindi lavare con 150 mL di acqua seguito da un lavaggio con 150 mL di salamoia.</li>
		<li>Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per produrre 2,45 g di composto A7 come solido bianco.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A8<ol>
<li>Aggiungere 760 g di perioduro di sodio alla miscela di 1,36 g di composto A7 in 35 mL di diclorometano/acqua (6:1, 35 mL) e mescolare a temperatura ambiente per 42 ore.</li>
		<li>Filtrare il materiale insolubile e concentrare il filtrato sotto vuoto. Estrarre il residuo risultante con 250 mL di diclorometano, quindi lavare con 100 mL di acqua e 100 mL di salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per dare il prodotto grezzo.</li>
		<li>Sottosoggettare il prodotto grezzo alla cromatografia a colonna flash in gel di silice (5-40% acetato/esani etilico, quindi 5% metanolo/diclorometano) per produrre 1,08 g di composto A8.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A9<ol>
<li>Preparare una soluzione di 830 mg di composto A8 in 15 mL di 1,2-dicloroetano. Aggiungere la soluzione di dropwise alla miscela di 6-benzilossicarbonilamino-2-L-acido ammino-esanoico trimetilsilil estere etilico (649,5 mg) e N N-diisopropiletililammina (591 μL) in 24 mL di 1,2-dicloroetano oltre 3 min e mescolare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere 360,3 mg di triacetossiboroidro di sodio alla soluzione e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 24 ore.</li>
		<li>Dissetare la miscela di reazione con 6 mL di acqua. Estrarre la miscela di reazione 3x con 200 mL di diclorometano e lavare con 200 mL di acido citrico 10% in acqua, 2x con 200 mL di acqua, 200 mL di bicarbonato di sodio saturo e 200 mL di salamoia in questo ordine. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per ottenere il prodotto grezzo.</li>
		<li>Sottosoggettare il prodotto grezzo alla cromatografia a colonna flash in gel di silice (acetato/esani etilico al 5-30%) per produrre 885 mg di composto A9.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del monomero JBNT<ol>
<li>Sciogliere 0,54 g di composto A9 (0,54 g) in 10 mL di acido trifluoroacetico/soluzione di tioanisole al 94% e mescolare a temperatura ambiente per 72 ore.</li>
		<li>Aggiungere l'etere dietile (80 mL) alla miscela di reazione e centrifugare il precipitato verso il basso. Versare l'acido trifluoroacetico chiaro contenente supernatante e lavare il precipitato bianco con etere dietile e metanolo per produrre monomero JBNT grezzo da 168,6 mg(File supplementare 1).</li>
		<li>Purificare il monomero JBNT grezzo da una cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con una colonna in fase inversa. Il programma di isolamento è elencato di seguito: SolventE A: 100% acqua; solvente B: acetonitrile al 100%; solvente C: pH=1 soluzione d'acqua HCl; portata: 3 mL/min (cfr. tabella 1).</li>
		<li>Raccogli il picco più grande a circa 7,2 minuti.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fabbricazione per JBNT/FN
<ol><li>Aggiungere 80 μL di soluzione acquosa JBNT da 1 mg/mL a 40 μL di soluzione acquosa FN da 1 mg/mL e pipetta più volte.</li>
	<li>Verificare la presenza di sospensioni solide bianche dopo pipettazione per circa 10 s. NOTA: è stato girato un video per acquisire il processo di auto-assemblaggio di NM (Supplemental File 2).</li>
</ol>3. Osservazione di esemplari lyophilizzati
NOTA: Questo passaggio viene eseguito per mostrare la struttura dell'impalcatura della MN realizzata con JBNT e FN.
<ol><li>Preparare soluzioni FN, JBNT e FN/JBNT NM per l'osservazione dei materiali lyophilizzati. Diluire 10 μL di 100 μg/mL di FN con 40 μL di acqua distillata per fare una soluzione di 20 μg/mL di FN.</li>
	<li>Preparare 100 mg/mL di soluzione di JBNT diluire 5 μL di 1 mg/mL di JBNT in 45 μL di acqua DI.</li>
	<li>Mescolare 10 μL di 100 μg/mL FN e 5 μL di 1 mg/mL di JBNT in 35 μL di acqua DI per formare la soluzione di MN.</li>
	<li>Rivestire tre pozzi di micropiatte inferiori rotonde a 96 ben chiare rispettivamente con la soluzione FN, JBNT e NM. Ogni pozzo riceve 50 μL della soluzione.</li>
	<li>Eseguire la liofilizzazione, come descritto di seguito, per visualizzare la struttura dell'impalcatura della MN.<ol>
<li>Congelare la piastra a -80 °C durante la notte.</li>
		<li>Accendere lo strumento lyophilized e la pompa per vuoto.</li>
		<li>Premere il pulsante di raffreddamento per ridurre la temperatura del sistema a -50 °C.</li>
		<li>Mettere la piastra congelata nello strumento liofilizzato e chiudere tutte le aperture degli strumenti.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante start per ridurre la pressione del sistema a 0,9 mbar.</li>
		<li>Dopo 4 ore, premere il pulsante di aerazione e aprire la valvola per aumentare la pressione del sistema alla pressione atmosferica.</li>
		<li>Estraere il piatto dal lyophilized instrument.</li>
		<li>Utilizzare un microscopio per osservare l'FN, i JBNT e la MN autoassemblata risultante. Scatta diverse fotografie con una fotocamera per i materiali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Misurazione degli spettri di assorbimento
NOTA: utilizzare la modifica degli spettri per FN e JBNT per presentare il JBNT/FN NM12 autoassemblato.
<ol><li>Mescolare 30 μL di 100 μg/mL FN con 15 μL di acqua distillata e 5 μL di 1 mg/mL di JBNT per preparare la soluzione JBNT/FN NM. Le sospensioni solide bianche possono essere viste più volte dopo aver pipettato la soluzione. NOTA: Le concentrazioni finali di JBNT e FN nella soluzione sono rispettivamente di 100 μg/mL e 60 μg/mL. Sono state inoltre preparate come soluzioni di controllo le soluzioni JBNT e FN alla stessa concentrazione a quella utilizzata nella soluzione NM.</li>
	<li>Diluire 5 μL di 1 mg/mL di JBNT con 45 μL di acqua distillata per preparare la soluzione di controllo JBNT.</li>
	<li>Diluire 30 μL di 100 μg/mL FN con 20 μL di acqua distillata per preparare la soluzione di controllo FN.</li>
	<li>Misurare gli spettri di assorbimento UV-vis delle soluzioni FN, JBNT e JBNT/FN NM con lo spettrofotometro (vedi Tabella dei materiali)per caratterizzare l'assemblaggio di NM.<ol>
<li>Fate clic sul pulsante UV-Vis. Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarvi 2 μL di acqua distillata. Misuralo come vuoto da 190-850 nm.</li>
		<li>Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarla 2 μL di soluzione FN. Misurare gli spettri di assorbimento UV-Vis della soluzione FN da 190 nm a 850 nm.</li>
		<li>Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarla 2 μL di soluzione JBNT. Misurare gli spettri di assorbimento della soluzione JBNT da 190 nm a 850 nm.</li>
		<li>Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarla 2 μL di soluzione di NM JBNT/FN. Misurare gli spettri di assorbimento della soluzione di NM JBNT/FN da 190 nm a 850 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Preparazione della MN JBNT/FN per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
<ol><li>Pulire diverse griglie prima della colorazione negativa con un detergente al plasma di base (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Eseguire la colorazione negativa per i campioni seguendo due diversi processi.<ol>
<li>Far cadere 3 μL di 1 mg/mL di soluzione acquosa di JBNT e 3 μL di soluzione di MN JBNT/FN su griglie separate e lasciarlo per 2 min. Quindi sciacquare ogni griglia con soluzione di 100 μL di acetato di uranile (UA) 0,5%. Scolare la soluzione in eccesso con carta da filtro e asciugare all'aria le griglie.</li>
		<li>Mescolare 9 μL di soluzione di NM JBNT/FN con 3 μL di soluzione di UA al 2,0% e pipettarla più volte. Pipettare la soluzione mista sulle griglie e tenerla sulle griglie per 2 minuti. Utilizzare una carta da filtro per rimuovere la soluzione mista dalle griglie e asciugare le griglie a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infine, caratterizzare l'esemplare per JBNT, JBNT/FN NM macchiato con passo 5.2.1 e JBNT/FN NM macchiato con passo 5.2.2 con il TEM.</li>
</ol>6. Saggio di funzione biologica in vitro
<ol><li>Aggiungere 200 μL di controlli negativi (NC, PBS), JBNT, FN e le soluzioni NM JBNT/FN in un unico pozzo di una diapositiva a camera a 8 pozzi, rispettivamente.</li>
	<li>Congelare asciugare il coverglass a camera a 8 elementi con lo strumento liofilizzato per rivestire i materiali sul fondo dei pozzi. Il protocollo per la liofilizzazione è lo stesso del passaggio 3.5.</li>
	<li>Quindi aggiungere 10.000 cellule/pozzi hSPC (Passaggio 3) nei pozzi e incubarli per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, pipettare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi e risciacquare la coltura con soluzione 1x PBS.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL della soluzione fissante ad ogni bene con le cellule e lasciare per 5 minuti. Risciacquare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte.</li>
	<li>Diluire dall'1% Triton-X 100 allo 0,1%. Aggiungere 100 μL dello 0,1% di Tritone-X 100 ad ogni pozzo con le cellule e lasciare per 10 minuti. Risciacquare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte.</li>
	<li>Diluire la rodimina Phalloidin a 1,65 μM. Aggiungere 100 μL di rodimina Phalloidin ad ogni pozzo con cellule e incubare il vetro di copertura a camera tenuto lontano dalla luce a temperatura ambiente per 30 minuti. Risciacquare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte.</li>
	<li>Cattura le immagini cellulari con un microscopio fluorescente.</li>
	<li>Contare i numeri di cella nelle immagini fluorescenti per ogni gruppo. Calcolare la densità di adesione cellulare calcolando in media tre aree casuali in ogni pozzo.</li>
	<li>Presentare tutti i dati come ± deviazione standard (SD). Eseguire analisi statistiche utilizzando un test t a una coda, seguito da un'analisi della varianza (ANOVA) con p<0.05, che è considerata statisticamente significativa.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference.">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li><li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li><li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability.">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li><li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+promotes+higher+adhesion,+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells.">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).</li><li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin.">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li><li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications.">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo.">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089 (2017).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells.">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo.">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li></ol>

Il Dr. Yupeng Chen è co-fondatore di NanoDe Therapeutics, Inc.

In questo studio, abbiamo sviluppato una MN biomimetica auto-assemblata, che è stata formata con JBNT e FN ispirati al DNA. Durante la preparazione della soluzione JBNT, la polvere liofilizzata JBNT deve essere sciolta nell'acqua al posto del PBS perché pbs causerà l'agglomerazione di JBNT, che inibisce il loro assemblaggio. Inoltre, la MN dovrebbe anche essere assemblata in acqua se vogliamo osservare le strutture nano-fibrille della MN, perché il sale in PBS si impacchelerà con le fibre nm, il che può ridurre not...

Le cellule staminali mesenchimali umane (hSPC) hanno mostrato il potenziale di auto-rinnovamento e auto-differenziazione lungo diversi lignaggi mesenchimali, il che aiuta nella rigenerazione e nel mantenimento dei tessuti1. In base al potenziale di differenziazione, gli hMSC sono considerati candidati per lesioni mesenchimali del tessuto e terapia del disturbo ematopoietico2. hSPC hanno dimostrato la capacità di promuovere la guarigione delle ferite aumentando la riparazione dei tessuti, l'angiogenesi e riducendo l'infiammazione3. Tuttavia, senza assistenza biochimica o biomateriale, l'efficienza per gli hMSC di raggiungere un tessuto bersaglio e funzionare nella posizione desiderata è bassa4. Sebbene varie impalcature ingegnerizzate siano state utilizzate per attirare gli HMSC ad aderire alle lesioni, alcuni siti come la frattura della piastra di crescita, nel mezzo di un osso lungo, non sono facilmente accessibili dalle impalcature prefabburate convenzionali, che potrebbero non adattarsi perfettamente a un sito ferito di forma irregolare.
Qui, abbiamo sviluppato un nanomateriale biomimetico che può auto-assemblarsi in situ ed essere iniettato in un'area bersaglio difficile da raggiungere. La bio-impalcatura iniettabile NM è composta da nanotubi di base janus (JBNT) e fibronectina (FN). I JBNT, noti anche come Nanotubi di Rosetta (RTT), derivano da coppie di basi di DNA, in particolare timina e adenina,qui 5,6,7. Come si vede nella Figura 1, i nanotubi si formano quando sei molecole delle coppie di basi di DNA derivate si auto-assemblano tramite legami idrogeno per formare unpiano 6. Sei molecole vengono quindi impilate l'una sull'altra in un piano attraverso una forte interazione di pi-stacking7, che può essere lunga fino a 200-300 μm. I JBNT sono progettati per imitare morfologicamente le fibre di collagene in modo che FN reagisca con loro.
FN è una glicoproteina adesiva ad alto peso molecolare, che può essere trovata nella matrice extracellulare (ECM)9. Questi possono mediare l'attaccamento delle cellule staminali ad altri componenti dell'ECM, in particolarecollagene 10. Abbiamo progettato JBNT per imitare morfologicamente le fibre di collagene in modo che FN possa reagire con loro per formare la MN in pochi secondi attraverso il legame non covalente. Pertanto, la MN è una promettente bio-impalcatura da iniettare in un sito di frattura ossea che non potrebbe essere accessibile dalle impalcature fabbricate convenzionalmente. Qui, la MN iniettabile presenta un'eccellente capacità di migliorare l'ancoraggio hMSC in vitro, esibendo il loro potenziale di servire come impalcatura per la rigenerazione dei tessuti.

<table><tbody><tr><td>1,2-dichloroethane</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>2-cyanoacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimethylaminopyridine</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8 wells Chambered Coverglass</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>absolute ethanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>allylamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>Basic Plasma Cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>citric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>concentrated hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>dichloromethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Di-tert-butyl dicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>ethyl acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>ethylcarbamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>guanidinium hydrochloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>hexanes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>Human mesenchymal stem cells</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>methyl iodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Diisopropylethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-Methylmorpholine N-oxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>phosphoryl chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>potassium carbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>reverse phase column</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>silica gel</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>sodium ethoxide</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>sodium periodide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>sodium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>sodium sulfite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>sodium triacetoxyborohydride</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>spectrophotometer(NanoDrop One/One&lt;sup&gt;c&lt;/sup&gt; UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stem Cell Growth Medium BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>tetrahydrofuran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>thioanisole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>triethylamine</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion

Una MN biomimetica è stata sviluppata per fungere da impalcatura biologica di ingegneria tissutale, che può migliorare l'ancoraggio delle cellule staminali. La MN biomimetica è formata da JBNT e FN attraverso l'auto-assemblaggio in una soluzione acquosa. I JBNT misurano 200-300 μm di lunghezza con canali cavi idrofobici interni e superfici idrofile esterne. I JBNT sono caricati positivamente e le FN sono addebitate negativamente. Pertanto, quando iniettati in una soluzione acquosa neutra, vengono legati insieme tramite incollaggio non covalente per formare i fasci di MN. Il processo di auto-assemblaggio viene completato in pochi secondi senza alcun iniziatore chimico, fonte di calore o luce UV. Quando il pH della soluzione NM è inferiore al punto isoelettrico delle FN (pI 5.5-6.0), i bundle nm si auto-rilasciano a causa della presenza di FN caricato positivamente.
La MN è nota per imitare morfologicamente la matrice extracellulare (ECM) e quindi può essere utilizzata come impalcatura iniettabile, che fornisce un'eccellente piattaforma per migliorare l'adesione hMSC. L'analisi della densità cellulare e gli esperimenti di imaging a fluorescenza hanno indicato che gli NMS hanno aumentato significativamente l'ancoraggio degli HMS rispetto al controllo negativo.

I nostri studi hanno scoperto che la formazione della MN di JBNT e FN è veloce, cosa che è avvenuta in 10 secondi. Come illustrato nella figura 2, il floccule bianco è stato ottenuto quando la soluzione JBNT è stata miscelata con la soluzione FN e pipettata più volte. Il processo di formazione della MN è completamente biomimetico. Non sono necessari stimoli esterni. Il processo di fabbricazione è molto più facile di quello di alcuni biomateriali emergenti, che si basa sulla luce ultr...

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Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

L'obiettivo di questo protocollo è mostrare l'assemblaggio di una nanomatrice biomimetica (NM) con nanotubi di base Janus (JBNT) e fibronectina (FN). Quando sono co-coltivate con cellule staminali mesenchimali umane (hSPC), le TM mostrano un'eccellente bioattività nell'incoraggiare l'adesione degli HMSC.

Fabbricazione di una nanoma matrice biomimetica con nanotubi di base Janus e fibronectina per l'adesione delle cellule staminali

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K Views.  University of Connecticut. L'obiettivo di questo protocollo è mostrare l'assemblaggio di una nanomatrice biomimetica (NM) con nanotubi di base Janus (JBNT) e fibronectina (FN). Quando sono co-coltivate con cellule staminali mesenchimali umane (hSPC), le TM mostrano un'eccellente bioattività nell'incoraggiare l'adesione degli HMSC.

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Preparation of 3D Fibrin Scaffolds for Stem Cell Culture Applications

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells inside of 3D biomaterial scaffolds provides a way to accurately mimic these microenvironments, providing an advantage over traditional 2D culture methods using polystyrene as well as a method for engineering replacement tissues 2. While 2D tissue culture polystrene has been used for the majority of cell culture experiments, 3D biomaterial scaffolds can more closely replicate the microenvironments found in vivo by enabling more accurate establishment of cell polarity in the environment and possessing biochemical and mechanical properties similar to soft tissue.3 A variety of naturally derived and synthetic biomaterial scaffolds have been investigated as 3D environments for supporting stem cell growth. While synthetic scaffolds can be synthesized to have a greater range of mechanical and chemical properties and often have greater reproducibility, natural biomaterials are often composed of proteins and polysaccharides found in the extracelluar matrix and as a result contain binding sites for cell adhesion and readily support cell culture. Fibrin scaffolds, produced by polymerizing the protein fibrinogen obtained from plasma, have been widely investigated for a variety of tissue engineering applications both in vitro and in vivo 4. Such scaffolds can be modified using a variety of methods to incorporate controlled release systems for delivering therapeutic factors 5. Previous work has shown that such scaffolds can be used to successfully culture embryonic stem cells and this scaffold-based culture system can be used to screen the effects of various growth factors on the differentiation of the stem cells seeded inside 6,7.
 This protocol details the process of polymerizing fibrin scaffolds from fibrinogen solutions using the enzymatic activity of thrombin. The process takes 2 days to complete, including an overnight dialysis step for the fibrinogen solution to remove citrates that inhibit polymerization. These detailed methods rely on fibrinogen concentrations determined to be optimal for embryonic and induced pluripotent stem cell culture. Other groups have further investigated fibrin scaffolds for a wide range of cell types and applications - demonstrating the versatility of this approach 8-12.

This work details the preparation of 3D fibrin scaffolds for culturing and differentiating plutipotent stem cells. Such scaffolds can be used to screen the effects of various biological compounds on stem cell behavior as well as modified to contain drug delivery systems.

Preparazione del 3D fibrina ponteggi per le applicazioni delle cellule staminali Cultura

Stem cells are found in naturally occurring 3D microenvironments in vivo, which are often referred to as the stem cell niche 1. Culturing stem cells ...

Ricerca

Bioingegneria

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber diameter, composition and organization. In addition to providing structural support, the physical and chemical properties of the ECM play an important role in multiple cellular processes including adhesion, differentiation, and apoptosis. In vivo, the ECM is assembled by exposing cryptic self-assembly (fibrillogenesis) sites within proteins. This process varies for different proteins, but fibronectin (FN) fibrillogenesis is well-characterized and serves as a model system for cell-mediated ECM assembly. Specifically, cells use integrin receptors on the cell membrane to bind FN dimers and actomyosin-generated contractile forces to unfold and expose binding sites for assembly into insoluble fibers. This receptor-mediated process enables cells to assemble and organize the ECM from the cellular to tissue scales. Here, we present a method termed surface-initiated assembly (SIA), which recapitulates cell-mediated matrix assembly using protein-surface interactions to unfold ECM proteins and assemble them into insoluble fibers. First, ECM proteins are adsorbed onto a hydrophobic polydimethylsiloxane (PDMS) surface where they partially denature (unfold) and expose cryptic binding domains. The unfolded proteins are then transferred in well-defined micro- and nanopatterns through microcontact printing onto a thermally responsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) surface. Thermally-triggered dissolution of the PIPAAm leads to final assembly and release of insoluble ECM protein nanofibers and nanostructures with well-defined geometries. Complex architectures are possible by engineering defined patterns on the PDMS stamps used for microcontact printing. In addition to FN, the SIA process can be used with laminin, fibrinogen and collagens type I and IV to create multi-component ECM nanostructures. Thus, SIA can be used to engineer ECM protein-based materials with precise control over the protein composition, fiber geometry and scaffold architecture in order to recapitulate the structure and composition of the ECM in vivo.

A method to obtain nanofibers and complex nanostructures from single or multiple extracellular matrix proteins is described. This method uses protein-surface interactions to create free-standing protein-based materials with tunable composition and architecture for use in a variety of tissue engineering and biotechnology applications.

Nanofibre ECM proteine ​​e Nanostrutture Engineered Uso Assembly-Surface avviato

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Elettrofilate nanofibre Ponteggi con gradazioni Organizzazione Fiber

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Espansione nanostrutturati Substrati utilizzando la tecnica del punto per Nanotopographical Modulazione di Cell Comportamento

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations having a major effect. Here we present a method to obtain large-scale uneven nanopatterns of arginine-glycine-aspartic acid (RGD)-functionalized dendrimers that permit the nanoscale control of local RGD surface density. Nanopatterns are formed by surface adsorption of dendrimers from solutions at different initial concentrations and are characterized by water contact angle (CA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), and scanning probe microscopy techniques such as scanning tunneling microscopy (STM) and atomic force microscopy (AFM). The local surface density of RGD is measured using AFM images by means of probability contour maps of minimum interparticle distances and then correlated with cell adhesion response and differentiation. The nanopatterning method presented here is a simple procedure that can be scaled up in a straightforward manner to large surface areas. It is thus fully compatible with cell culture protocols and can be applied to other ligands that exert concentration-dependent effects on cells.

A method to obtain dendrimer-based uneven nanopatterns that permit the nanoscale control of local arginine-glycine-aspartic acid (RGD) surface density is described and applied for the study of cell adhesion and chondrogenic differentiation.

Basato su Dendrimero Nanopatterns irregolare alla localmente adesività di superficie di controllo: un metodo per dirigere la differenziazione Chondrogenic

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3D-stampato

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Fabbricazione di GNSM gradiente termico Nanoimprinting tecnica e Screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo uses. The addition of growth factors into these biomaterial scaffolds is generally done to provide an optimal cell culture environment, mediating cell differentiation and its subsequent functions. However, the growth factors in a conventional biomaterial scaffold are typically designed to be released upon implantation, which could result in unintended side effects on surrounding tissue or cells. Here, the DNA-inspired Janus base nano-matrix (JBNm) has successfully achieved a highly localized microenvironment with a layer-by-layer structure for self-sustainable cartilage tissue constructs. JBNms are self-assembled from Janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3, and transforming growth factor beta-1 (TGF-&#946;1) via bioaffinity. The JBNm was assembled at a TGF-&#946;1:matrilin-3:JBNt ratio of 1:4:10, as this has been the determined ratio at which proper assembly into the layer-by-layer structure could occur. First, the TGF-&#946;1 solution was added to the matrilin-3 solution. Then, this mixture was pipetted several times to ensure sufficient homogeneity before the addition of the JBNt solution. This formed the layer-by-layer JBNm, after pipetting several times again. A variety of experiments were performed to characterize the layer-by-layer JBNm structure, JBNts alone, matrilin-3 alone, and TGF-&#946;1 alone. The formation of JBNm was studied with UV-Vis absorption spectra, and the structure of the JBNm was observed with transmission electron microscopy (TEM). As the innovative layer-by-layer JBNm scaffold is formed on a molecular scale, the fluorescent dye-labeled JBNm could be observed. The TGF-&#946;1 is confined within the inner layer of the injectable JBNm, which can prevent the release of growth factors to surrounding areas, promote localized chondrogenesis, and promote an anti-hypertrophic microenvironment.

This protocol describes the assembly of a layer-by-layer Janus base nano-matrix (JBNm) scaffold by adding Janus base nanotubes (JBNts), matrilin-3, and Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-&#946;1) sequentially. The JBNm was fabricated and characterized; additionally, it displayed excellent bioactivity, encouraging cell functions such as adhesion, proliferation, and differentiation.

Fabbricazione e caratterizzazione di nano-matrice di base Janus strato per strato per promuovere la rigenerazione della cartilagine

Various biomaterial scaffolds have been developed to guide cell adhesion and proliferation in hopes to promote specific functions for in vitro and in vivo ...

Fabricating Engineered Nanofibrillar Collagen with Directed Patterning

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are designed to emulate the biophysical properties of native tissue, providing cellular phenotypic and morphological guidance that contributes to the restoration of the regenerative tissue niche. Collagen, a prevalent extracellular matrix protein, is a common component of these regenerative biomaterials due to its biocompatibility and other favorable properties. The current study describes a novel and straightforward method for the fabrication of engineered nanofibrillar collagen with directed fibril patterning. Through the manipulation of shear stress, temperature, and pH, collagen fibrillogenesis and alignment are precisely controlled without requiring specialized equipment. This approach allows for the creation of nanofibrillar collagen biomaterials that mimic the native structure of tissues exhibiting either anisotropic or isotropic characteristics. The flexibility in collagen nanofibril patterning not only facilitates the study of nanoscale patterning on cell behavior but also offers diverse possibilities for patterned tissue engineering applications.

The following protocol presents a shear-based extrusion method for the fabrication of collagen hydrogels with nanoscale patterned fibrils, which can be applied to a broad range of tissue engineering applications.

Regenerative biomaterials are designed to facilitate cell-material interactions to guide the repair of damaged tissues and organs. These materials are ...

Fabbricazione di una nanoma matrice biomimetica con nanotubi di base Janus e fibronectina per l'adesione delle cellule staminali

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Preparazione del 3D fibrina ponteggi per le applicazioni delle cellule staminali Cultura

Capillare Forza litografia per Cardiac Tissue Engineering

Nanofibre ECM proteine e Nanostrutture Engineered Uso Assembly-Surface avviato

Elettrofilate nanofibre Ponteggi con gradazioni Organizzazione Fiber

Espansione nanostrutturati Substrati utilizzando la tecnica del punto per Nanotopographical Modulazione di Cell Comportamento

Basato su Dendrimero Nanopatterns irregolare alla localmente adesività di superficie di controllo: un metodo per dirigere la differenziazione Chondrogenic

Fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3D-stampato

Fabbricazione di GNSM gradiente termico Nanoimprinting tecnica e Screening della risposta delle cellule endoteliali umane formanti colonie

Fabbricazione e caratterizzazione di nano-matrice di base Janus strato per strato per promuovere la rigenerazione della cartilagine

Production of Nanofibrillar Patterned Collagen for Tissue Engineering

Fabbricazione di una nanoma matrice biomimetica con nanotubi di base Janus e fibronectina per l'adesione delle cellule staminali

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