Questo lavoro è stato in parte supportato da Kansas INBRE, P20GM103418 a Li e Zinovyeva e R35GM124828 a Zinovyeva. Ringraziamo Min Han per aver generosamente condiviso l'anticorpo anti-AIN-1. Alcuni dei ceppi utilizzati nel corso di questo lavoro sono stati forniti dal Caenorhabditis Genetics Center (CGC), finanziato dall'Ufficio dei programmi di infrastruttura di ricerca del NIH (P40 OD010440).

1. Raccolta di campioni di worm
<ol><li>Seme a stadio misto osincronizzato 13 vermi su piastre solide NGM alla temperatura richiesta e consentire ai vermi di crescere fino allo stadio desiderato. Per la crescita e la manutenzione di base di C. elegans, si prega divedere Stiernagle et al.</li>
	<li>Raccogliere i vermi in un tubo di centrifuga conica da 15 ml lavando le piastre del verme con tampone M9.</li>
	<li>Pelletare i vermi centrifugando a 400 x g a temperatura ambiente (RT) per 2 minuti e scartare il supernatante. NOTA: La dimensione del pellet di verme per la preparazione dell'estratto è compresa tra 100 μL e 500 μL. Un pellet da 300 μL di vermi imballati è raccomandato per esperimenti di immunoprecipitazione a valle e in genere produce ~ 4,5 mg di proteine totali, mentre un pellet da 500 μL produrrà ~ 7,5 mg di proteine totali.</li>
	<li>Eseguire ulteriori lavaggi da 3 a 5 con buffer M9 (vedere tabella 1) o fino a quando il supernatante non è più torbido.</li>
	<li>Eseguire un lavaggio finale con ddH2O.</li>
	<li>Spostare il pellet di verme sciolto su un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml e girare verso il basso a 400 x g a RT per 2 min. Scartare il supernatante rimanente per ottenere un pellet di verme imballato e procedere all'estrazione della preparazione. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. I pellet di verme possono essere immediatamente congelati in azoto liquido e conservati a -80 °C o in azoto liquido. Si prega di notare che i pellet di vermi possono essere scongelati una sola volta e non possono essere refrozen.</li>
</ol>2. Estrarre la preparazione del pellet di verme
NOTA: La preparazione dell'estratto deve essere eseguita su ghiaccio o a 4 °C.
<ol><li>Se congelato, scongelare il pellet di verme sul ghiaccio. NOTA: Se la dimensione del pellet di verme imballato desiderata di 300 μL non è stata ottenuta durante la raccolta del campione, è possibile formare più pellet più piccoli fino a quando non è presente materiale sufficiente per un'ulteriore estrazione.</li>
	<li>Aggiungere un volume uguale di tampone di lisi ghiacciato 2x (60 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM cloruro di potassio, 0,1% Tritone X, 4 mM cloruro di magnesio, 10% glicerolo, 2 mM DTT con inibitore della RNasi, inibitore della proteasi e inibitori della fosfatasi; vedi tabella 1) e vortice o pipetta su e giù per mescolare. Ruotare il tubo o i tubi verso il basso per raccogliere la miscela nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Spostare la miscela in un tubo privo di RNasi da 1,5 ml contenente perline metalliche (vedi Tabella dei materiali)e mettere il campione nell'omogeneizzatore del mulino perline (vedi Tabella dei materiali)a 4 °C. Assicurarsi che i tappi del tubo siano serrati e che i campioni siano bilanciati all'interno dell'omogeneizzatore.</li>
	<li>Omogeneizzare il campione alla massima velocità (impostando 12) per 4 minuti.</li>
	<li>Rimuovere il campione dalle perline e posizionarlo in un nuovo tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. In alternativa, un magnete fornito con l'omogeneizzatore può essere utilizzato per rimuovere le perline dal campione.</li>
	<li>Spin verso il basso l'estratto a 19.000 x g per 20 min a 4 °C per chiarire l'estratto proteico.</li>
	<li>Trasferire il supernatante in un tubo fresco da 1,5 ml sul ghiaccio, evitando il riporto del precipitato bianco e torbido che si forma sopra il campione. Il supernatante è ora l'estratto chiarito. NOTA: Salvare 10 μL dell'estratto chiarificato per determinare la concentrazione totale di proteine.</li>
	<li>Utilizzare immediatamente l'estratto per i seguenti esperimenti o congelare l'estratto in azoto liquido e conservare a -80 °C. NOTA: il protocollo potrebbe essere messo in pausa qui. Gli estratti possono essere conservati a temperatura ultra bassa (congelatore a -80 °C o azoto liquido per ~ 6 mesi). Gli estratti congelati possono essere scongelati una volta e non possono essere refrozen.</li>
	<li>Determinare la concentrazione totale di proteine dell'estratto utilizzando un kit di dosaggio della concentrazione proteica compatibile con i detergenti (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.</li>
</ol>3. Immunoprecipitazione
NOTA: Tutte le fasi di immunoprecipitazione per la preparazione dell'estratto devono essere eseguite sul ghiaccio o a 4 °C. Si raccomanda di utilizzare 2 mg di proteine totali per ogni immunoprecipitazione. Tuttavia, sono state eseguite immunoprecipitazioni di successo con 0,8-1 mg di proteine totali. Utilizzare sempre estratti proteici freschi o appena scongelati. Il seguente protocollo è delineato per eseguire l'immunoprecipitazione da 2 mg di proteine totali, o un singolo esperimento di immunoprecipitazione. La quantità di perline e anticorpi può essere aumentata o diminuita di conseguenza per più campioni o se viene utilizzata una diversa quantità di estratto proteico.
<ol><li>Posizionare o scongelare l'estratto proteico sul ghiaccio. Il campione può essere diluito a 10 mg/mL o a 5 mg/mL con tampone di lysis 1x ghiacciato (cfr. tabella 1).</li>
	<li>Rimospendare le perline magnetiche per inversione e trasferire 150 μL della sospensione del 50% delle perline in un tubo da 1,5 ml. Magnetizzare le perline sul ghiaccio contro un supporto magnetico per 1 minuto o fino a quando la soluzione non è chiara. Scartare il supernatante.</li>
	<li>Rimuovere il tubo dal supporto magnetico e lavare le perline in un tampone di lisi 1x utilizzando 2 volumi (cioè 300 μL) di liquami di perline. Ripetere il lavaggio 2 volte per un totale di tre lavaggi.</li>
	<li>Rimescolare le perline in 150 μL di tampone di lysis ghiacciato.</li>
	<li>Trasferire 75 μL del liquame di perline a 2 mg di estratto proteico e incubare a 4 °C per 1 h con delicata agitazione. Salvare la sospensione del tallone rimanente sul ghiaccio per un uso successivo. NOTA: Questo passaggio viene eseguito per ridurre il legame proteico non specifico alle perline durante la fase di immunoprecipitazione.</li>
	<li>Posizionare il tubo con campione sul supporto magnetico sul ghiaccio per 1 minuto o fino a quando le perline non sono completamente magnetizzate e il campione è chiaro. Trasferire il supernatante su un nuovo tubo da 1,5 ml; non disturbare le perline. Questo è il litorato proteico precleato. Risparmia il 10% del campione per l'analisi western delle macchie.</li>
	<li>Aggiungere 20 μg di anticorpo purificato di affinità al lisato precleare e incubare a 4 °C per 1 h con delicata agitazione. NOTA: La quantità di anticorpi utilizzati per l'immunoprecipitazione è specifica dell'anticorpo e della proteina e deve essere determinata empiricamente per garantire un'immunoprecipitazione efficace della proteina bersaglio.</li>
	<li>Aggiungere i restanti 75 μL della sospensione delle perline prelavate (fase 3.5) alla miscela anticorpo/lisato e incubare per 1 h a 4 °C con agitazione delicata.</li>
	<li>Posizionare il tubo nel supporto magnetico sul ghiaccio per 1 minuto o fino a quando le perline non sono completamente magnetizzate e il campione è chiaro. Salvare il supernatante per l'analisi western blot (facoltativo).</li>
	<li>Lavare le perline contenenti l'immunoprecipitato 3x in 450 μL di tampone di lavaggio (30 mM HEPES, pH = 7,4, 100 mM cloruro di potassio, 0,1% Tritone X, 2 mM di cloruro di magnesio, 10% di glicerolo, 1 mM DTT; cfr. tabella 1) sul ghiaccio. NOTA: Ulteriori lavaggi possono essere eseguiti se si preferisce condizioni di lavaggio più rigorose.</li>
	<li>Rimossare il pellet di perline in 20 μL di tampone di carico del gel proteico SDS/BME (vedi Tabella dei materiali)e denaturare bollendo a 95 °C per 5 minuti prima di caricarlo su un gel SDS-PAGE. In alternativa, i campioni denaturati possono essere conservati a -20 °C per diversi mesi. NOTA: Una porzione dell'immunoprecipitato di perline può essere salvata per l'isolamento dell'RNA a valle, se lo si desidera.</li>
</ol>4. Rilevamento western di macchie di campioni IP
<ol><li>Caricare gli esempi IP nel gel SDS-PAGE (vedere Tabella dei materiali). Evitare di trasferire le perline posizionando i tubi IP sul supporto magnetico per 1 minuto prima dell'aspirazione del campione.</li>
	<li>Eseguire l'assorbimentooccidentale 15,16 e la colorazione deglianticorpi 16 con le seguenti modifiche: diluire l'anticorpo ALG-117 1:500 nel 5% di latte secco non grasso (NFDM); diluire l'anticorpoHRPK-1 2 1:1,000 nel 5% NFDM; e diluire l'anticorpoAIN-1 18 1:10.000 nel 5% di NFDM. Gli anticorpi secondari (vedi Tabella dei materiali)sono stati utilizzati secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Rilevare le bande con chemiluminescenza basata su HRP (vedere Tabella dei materiali).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+AP-MS-+and+BioID-compatible+MAC-tag+enables+comprehensive+mapping+of+protein+interactions+and+subcellular+localizations.">An AP-MS- and BioID-compatible MAC-tag enables comprehensive mapping of protein interactions and subcellular localizations.</a> Nature Communications. 9 (1), 1188-1216 (2018).</li><li>Li, L., Veksler-Lublinsky, I., Zinovyeva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HRPK-1,+a+conserved+KH-domain+protein,+modulates+microRNA+activity+during+Caenorhabditis+elegans+development.">HRPK-1, a conserved KH-domain protein, modulates microRNA activity during Caenorhabditis elegans development.</a> PLoS Genetics. 15 (10), 1008067 (2019).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Veksler-Lublinsky, I., Vashisht, A. A., Wohlschlegel, J. A., Ambros, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+ALG-1+antimorphic+mutations+uncover+functions+for+Argonaute+in+microRNA+guide+strand+selection+and+passenger+strand+disposal.">Caenorhabditis elegans ALG-1 antimorphic mutations uncover functions for Argonaute in microRNA guide strand selection and passenger strand disposal.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5271-5280 (2015).</li><li>Hammell, C. M., Lubin, I., Boag, P. R., Blackwell, T. K., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nhl-2+Modulates+microRNA+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">nhl-2 Modulates microRNA activity in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 136 (5), 926-938 (2009).</li><li>Zou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+decline+in+neuronal+regeneration+by+the+progressive+change+of+two+intrinsic+timers.">Developmental decline in neuronal regeneration by the progressive change of two intrinsic timers.</a> Science. 340 (6130), 372-376 (2013).</li><li>Zanin, E., Dumont, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+of+protein+complexes+in+C.+elegans.">Affinity purification of protein complexes in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 289-322 (2011).</li><li>Bhaskaran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+Caenorhabditis+elegans+the+easy+way+using+the+Balch+homogenizer:+an+old+tool+for+a+new+application.">Breaking Caenorhabditis elegans the easy way using the Balch homogenizer: an old tool for a new application.</a> Analytical Biochemistry. 413 (2), 123-132 (2011).</li><li>Kohl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plate-based+Large-scale+Cultivation+of+Caenorhabditis+elegans:+Sample+Preparation+for+the+Study+of+Metabolic+Alterations+in+Diabetes.">Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58117 (2018).</li><li>Larance, M., Bailly, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+nematodes.">Stable-isotope labeling with amino acids in nematodes.</a> Nature Methods. 8 (10), 849-851 (2011).</li><li>Ding, L., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GW182+family+proteins+are+crucial+for+microRNA-mediated+gene+silencing.">GW182 family proteins are crucial for microRNA-mediated gene silencing.</a> Trends in Cell Biology. 17 (8), 411-416 (2007).</li><li>Ding, L., Spencer, A., Morita, K., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Developmental+Timing+Regulator+AIN-1+Interacts+with+miRISCs+and+May+Target+the+Argonaute+Protein+ALG-1+to+Cytoplasmic+P+Bodies+in+C.+elegans.">The Developmental Timing Regulator AIN-1 Interacts with miRISCs and May Target the Argonaute Protein ALG-1 to Cytoplasmic P Bodies in C. elegans.</a> Molecular Cell. 19 (4), 437-447 (2005).</li><li>Jannot, G., Vasquez-Rifo, A., Simard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argonaute+Pull-Down+and+RISC+Analysis+Using+2&#8217;-O-Methylated+Oligonucleotides+Affinity+Matrices.">Argonaute Pull-Down and RISC Analysis Using 2&#8217;-O-Methylated Oligonucleotides Affinity Matrices.</a> Methods in Molecular Biology. 725, 233-249 (2011).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (16), e759 (2008).</li><li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting:+sample+preparation+to+detection.">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).</li><li>Zinovyeva, A. Y., Bouasker, S., Simard, M. J., Hammell, C. M., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+conserved+residues+of+the+C.+elegans+microRNA+Argonaute+ALG-1+identify+separable+functions+in+ALG-1+miRISC+loading+and+target+repression.">Mutations in conserved residues of the C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 identify separable functions in ALG-1 miRISC loading and target repression.</a> PLoS Genetics. 10 (4), 1004286 (2014).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Identification+of+C.+miRISC+Proteins,+miRNAs,+and+mRNA+Targets+by+Their+Interactions+with+GW182+Proteins+AIN-1+and+AIN-2.">Systematic Identification of C. miRISC Proteins, miRNAs, and mRNA Targets by Their Interactions with GW182 Proteins AIN-1 and AIN-2.</a> Molecular Cell. 28 (4), 598-613 (2007).</li><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+Window+into+Biology:+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li><li>Farboud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Genome+Editing+with+Cas9+Ribonucleoprotein+in+Diverse+Cells+and+Organisms.">Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57350 (2018).</li><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering.">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202 (3), 885-901 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

C. elegans è un ottimo modello per lo studio delle questioni fondamentali in biologia cellulare, molecolare e dello sviluppo19. Oltre al suo potere come sistema di modelli genetici, C. elegans è suscettibile di approcci biochimici, tra cui, a titolo considerato, immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione proteica. Un potenziale ostacolo quando si conducono esperimenti di immunoprecipitazione è la mancanza di anticorpi specifici per le proteine di interesse. Se non è disponibile alcun anticorpo, è possibile generare anticorpi policlonali o monoclonali personalizzati. Tuttavia, le recenti innovazioni nella tecnologia di editing del genoma hanno permesso ai ricercatori di introdurre rapidamente mutazioni o taggare geni endogeni C. elegans 20,21, facilitando studi che svelano le interazioni genetiche, funzionali e fisiche tra i geni e le proteine codificate. In particolare, l'etichettatura mediata da CRISPR/Cas9 dei geni C. elegans nei loci endogeni ha ridotto la dipendenza degli esperimenti di immunoprecipitazione dalla disponibilità di anticorpi, rendendo gli esperimenti di co-immunoprecipitazione molto più fattibili. I geni C. elegans possono essere taggati con una varietà di tag che vanno da tag fluorescenti come GFP o mCherry a piccoli tag come FLAG e HA. Gli anticorpi che riconoscono questi tag sono prontamente disponibili commercialmente, facilitando gli studi sulle interazioni proteina-proteina attraverso approcci di immunoprecipitazione.
Il protocollo presentato, descritto nella figura 1, può essere eseguito per un numero limitato di campioni o scalato, consentendo fino a 24 preparati campione alla volta. Mentre le caratterizzazioni iniziali delle interazioni proteina-proteina attraverso l'immunoprecipitazione sono tipicamente fatte in background di tipo selvatico in normali condizioni di crescita, gli studi di follow-up richiedono spesso di testare le interazioni proteina-proteina in una varietà di background genetici o in diverse condizioni di crescita. La capacità di preparare contemporaneamente più estrazioni consente di risparmiare tempo e, cosa importante, garantisce la coerenza della preparazione dell'estrazione tra i diversi campioni. È sempre necessario un controllo negativo, con il controllo ideale che è una mutazione nulla nella codifica genica per la proteina di interesse immunoprecipitata (vedi figura 3 e figura 4 per esempi).
Questo protocollo di estrazione consente una rapida preparazione dell'estratto proteico da campioni di C. elegans ed è paragonabile all'omogeneizzazione a base di perline di zirconio8. L'omogeneizzazione delle perline in generale può essere scalata fino a più preparati simultanei di campioni utilizzando una varietà di omogeneizzatori di mulini perline o apparecchiature simili. Tuttavia, alcuni omogeneizzatori più economici per mulini perline possono ridurre il numero di campioni che possono essere lavorati contemporaneamente. In alternativa, il protocollo di estrazione presentato è compatibile con la preparazione dell'estratto a base di dounce, che rappresenta un'alternativa economica. Mentre diversi omogeneizzatori di mulini di perline non sono stati testati, la maggior parte è probabile che sia compatibile con questo protocollo di estrazione proteica, purché si ottiene una completa interruzione dei campioni di C. elegans.
Come presentato, questo protocollo di preparazione dell'estratto è compatibile con più esperimenti a valle, tra cui l'immunoprecipitazioneproteica 2 e il pull-down di microRNA12 e consente la raccolta a valle di componenti di proteine e RNA. Estrae inoltre in modo efficiente proteine nucleari e citoplasmatiche (Figura 2, Figura 3e Figura 4). Allo stesso modo, il protocollo di immunoprecipitazione presentato consente l'isolamento dell'RNA dagli immunopreciti associati alle proteine. Mentre il protocollo di immunoprecipitazione è stato originariamente sviluppato per identificare gli interattori proteici ALG-1, il metodo può essere adattato per testare le interazioni tra qualsiasi proteina di interesse. Infatti, le condizioni di immunoprecipitazione utilizzate hanno funzionato altrettanto bene per l'immunoprecipitazione di ALG-1 (Figura 3) e HRPK-1(Figura 4). Questo protocollo è un ottimo punto di partenza per l'immunopurificazione delle proteine leganti l'RNA. Va notato, tuttavia, che alcuni cambiamenti nella composizione tampone possono essere necessari per altre proteine di interesse. I cambiamenti possono dipendere dalle proprietà fisiche e biochimiche della proteina di interesse e devono essere attuati caso per caso.
Una volta che la proteina bersaglio (qui, ALG-1 o HRPK-1) è immunoprecipitata, l'blotting occidentale può essere utilizzato per testare il co-immunoprecipitato per specifici interattori proteici.
In alternativa, l'immunoprecipitato copurato può essere sottoposto ad analisi di spettrometria di massa per identificare tutte le proteine putative interagenti. Le interazioni co-immunoprecipitazione confermate possono quindi essere esaminate in una varietà di background genetici o condizioni per identificare la potenziale regolazione dell'interazione specifica. Ad esempio, per determinare se hrpk-1 svolge un ruolo nell'assemblaggio miRISC ALG-1/AIN-1, la coprecipitazione ALG-1-AIN-1 è stata valutata sia in uno sfondo di tipo selvaggio che in assenza di HRPK-1 (Figura 3). hrpk-1 è stato trovato dispensabile per l'interazione ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Inoltre, la tecnologia di editing del genoma CRISPR/Cas9 può essere utilizzata per generare mutazioni del singolo punto o del dominio nelle proteine di interesse. Ritestare la capacità dei mutanti generati di coprecipitate con i loro interattori proteici può rivelare quali domini o residui mediano l'interazione fisica. Tali studi futuri possono fornire informazioni preziose sul meccanismo della funzione e della regolazione delle proteine. Questi approcci, combinati con il potere della genetica C. elegans, possono fornire importanti intuizioni sui processi molecolari fondamentali che governano lo sviluppo animale e la funzione cellulare.

Identificare le interazioni macromolecolari di una proteina di interesse può essere la chiave per saperne di più sulla sua funzione. Gli esperimenti di immunoprecipitazione e co-immunoprecipitazione possono essere utilizzati per identificare l'intero interamome di una proteina attraverso approcci proteomici sularga scala 1 o per testare specificamente la capacità di una proteina di coprecipitate con un interagente ipotizzato. In C. elegans, entrambi i metodi sono stati utilizzati con successo per saperne di più sull'attività di una varietà di proteine, comprese quelle che funzionano strettamente con i microRNA perregolare l'espressione genica 2,3,4. Gli esperimenti di co-immunoprecipitazione hanno il vantaggio di testare le interazioni proteina-proteina nel loro ambiente cellulare nativo, ma la preparazione degli estratti può essere impegnativa e dispendiosa in termini di tempo. È necessaria un'analisi efficiente del campione, ma bisogna fare attenzione a ridurre al minimo l'interruzione delle interazioni proteina-proteina. Metodi come il douncing5, la sonicazione6,l'omogeneizzazione balch7e l'omogeneizzazione delle perline di zirconia8,9 sono stati utilizzati per preparare con successo gli estratti proteici totali di C. elegans. Questi metodi, ad eccezione dell'omogeneizzazione delle perline di zirconia, hanno limitazioni in termini di numero di campioni che possono essere elaborati contemporaneamente. Presentato è un metodo alternativo che può essere facilmente scalato per consentire una preparazione rapida ad alto contenuto di produzione e estratto proteico da campioni di C. elegans seguita da co-immunoprecipitazione. In particolare, il metodo può preparare fino a 24 campioni alla volta, riducendo notevolmente il tempo necessario per la preparazione dell'estratto. Al contrario, ad esempio, il douncing in genere consente una sola preparazione del campione alla volta. Questo metodo di estrazione può essere utilizzato per preparare estratti da qualsiasi stadio di sviluppo di C. elegans.
Descritto è una procedura dettagliata per la raccolta di campioni animali, la preparazione degli estratti, l'immunoprecipitazione e la presentazione dei dati western di soffiatura per confermare il successo del pulldown proteico e il rilevamento della proteina co-immunoprecipitante di interesse. Per dimostrare l'efficacia del protocollo, sono stati eseguiti due esperimenti di co-immunoprecipitazione tra 1) microRNA Argonaute ALG-1 e AIN-1, un omologo GW182; e 2) ALG-1 e HRPK-1, un interagente ALG-1 appena identificato2. ALG-1 e AIN-1 sono proteine fondamentali che comprendono il complesso silenziatore indotto da microRNA (miRISC) e l'interazione tra queste due proteine èben consolidata 10,11. Il protocollo di preparazione dell'estratto è stato efficace nell'esperimento di co-immunoprecipitazione ALG-1-AIN-1. Questo protocollo ha anche confermato con successo l'interazione tra ALG-1 e il suo interagentore appena identificato, HRPK-12.
In sintesi, il manoscritto descrive un protocollo di preparazione dell'estrazione di C. elegans che può essere scalato fino a elaborare simultaneamente 24 campioni insieme a un protocollo di co-immunoprecipitazione che può essere utilizzato per identificare nuove o confermare interazioni ipotizzate tra proteine. Il protocollo di preparazione dell'estratto è compatibile con una serie di esperimenti a valle, tra cui l'immunoprecipitazioneproteica 2 e i pulldown di microRNA12. Inoltre, il protocollo di immunoprecipitazione può essere adattato per testare le interazioni tra due o più proteine endogene, taggate endogenamente o C. elegans sovraespresse in una varietà di background genetici.

<table><tbody><tr><td>15 mL tube</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>STEP 1.2</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRed</td><td>1610737</td><td>STEP 3.11</td></tr><tr><td>4&amp;ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels</td><td>BioRed</td><td>4561096</td><td>STEP 4.1</td></tr><tr><td>anti-AIN-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2, see ref. Zhang et al. 2007</td></tr><tr><td>anti-ALG-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>anti-HRPK-1 monoclonal antibody</td><td>custom generated by PRF&amp;amp;L</td><td>n/a</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Bullet Blender Storm Homogenizer</td><td>MidSci</td><td>BBY24M</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779-5G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td><td>Thermo Fisher</td><td>10002D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td>STEP 3.2</td></tr><tr><td>EDTA-free protease inhibitors</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>GFP antibody (FL)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8334</td><td>Figure 2</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher</td><td>G33-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Secondary Antibody, HRP</td><td>BioRed</td><td>1662408</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP</td><td>Thermo Fisher</td><td>31470</td><td>STEP 4.2</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>LICOR WesternSure PREMIUM Chemiluminescent Substrate, 100 mL Kit</td><td>LI-COR</td><td>926-95000</td><td>STEP 4.3</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate ACS</td><td>VWR</td><td>VWRV0288-500G</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>M65-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td>STEP 1.6</td></tr><tr><td>N2 wild type</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Navy RINO RNA Lysis Kit 50 pack (1.5 mL)</td><td>MidSci</td><td>NAVYR1-RNA</td><td>STEP 2.3</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td><td>Sigma</td><td>P5726-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td><td>Sigma</td><td>P0044-1ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>P217-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Thermo Fisher</td><td>P285-3</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>RC DC Protein Assay Kit I</td><td>BioRed</td><td>5000121</td><td>STEP 2.9</td></tr><tr><td>RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor</td><td>Thermo Fisher</td><td>10777019</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous</td><td>Thermo Fisher</td><td>S374-500</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>TritionX-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td>Table 1</td></tr><tr><td>UY38 hrpk-1(zen17)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT1367 col-19::gfp(maIS105)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VT3841 alg-1(tm492)</td><td>available upon request</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protein extract preparation and co-immunoprecipitation from caenorhabditis elegans

I metodi di co-immunoprecipitazione sono spesso usati per studiare le interazioni proteina-proteina. La conferma delle interazioni proteina-proteina ipotizzate o l'identificazione di nuove possono fornire informazioni inestimabili sulla funzione di una proteina di interesse. Alcuni dei metodi tradizionali per la preparazione degli estratti richiedono spesso tecniche ad alta intensità di manodopera e dispendiose in termini di tempo. Qui, un protocollo di preparazione degli estratti modificato che utilizza un omogeneizzatore per mulini perline e perline metalliche è descritto come una rapida alternativa ai metodi tradizionali di preparazione delle proteine. Questo metodo di preparazione dell'estratto è compatibile con studi di co-immunoprecipitazione a valle. Ad esempio, il metodo è stato utilizzato per co-immunoprecipitato con successo C. elegans microRNA Argonaute ALG-1 e due interattori ALG-1 noti: AIN-1 e HRPK-1. Questo protocollo include descrizioni della raccolta dei campioni animali, della preparazione degli estratti, della chiarificazione dell'estratto e dell'immunoprecipitazione proteica. Il protocollo descritto può essere adattato per testare le interazioni tra due o più proteine endogene, taggate endogenamente o sovraespresse di C. elegans in una varietà di background genetici.

Questo protocollo (schematizzato nella figura 1) è stato utilizzato con successo per ottenere estratti proteici totali di C. elegans (Figura 2) per l'immunoprecipitazione a valle didiverse proteine 2 (figura 3 e figura 4). Il protocollo di omogeneizzatore del mulino perline presentato era paragonabile, nell'estrazione totale delle proteine, ai metodi a base di dounce(figura 2)ed estratti in modo efficiente nucleare (COL-19::GFP(NLS)(figura 2)e proteine citoplasmatiche(figura 3 e figura 4). Più campioni di varie dimensioni sono stati estratti simultaneamente (Figura 2). Le proteine argonaute interagiscono con i membri della famiglia delle proteine GW182, formando i miRISC che si legano agli RRNA messaggero bersaglio e reprimeno la loroespressione 10. La figura 3 mostra una co-immunoprecipitazione riuscita dei componenti miRISC centrali ALG-1 e AIN-1, coerente con le precedentirelazioni 11,17. Più recentemente, sono stati compiuti sforzi per identificare ulteriori interattori proteici di Argonaute ALG-1 3 al fine disaperne di più su come la biogenesi e l'attività del microRNA potrebbero essere regolate da fattori ausiliari. La proteina hrpk-1 legante l'RNA è stata identificata negli immunoprecitiALG-1 3. Questa interazione è stata recentemente confermata in un esperimento di immunoprecipitazione HRPK-1reciproco 2. I protocolli di estrazione e immunoprecipitazione presentati hanno recuperato con successo ALG-1 in co-immunopreciti specifici di HRPK-1 (Figura 4). Inoltre, l'interazione ALG-1-AIN-1 è stata testata in una varietà di background genetici e HRPK-1 si è dimostrato non necessario per l'assemblaggio miRISC ALG-1/AIN-12 (Figura 3). Sono forniti dati supplementari per mostrare l'intera membrana sonanale(Figura supplementare 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig1.jpg"> Figura 1: Schema del flusso di lavoro per C. elegans estrarre la preparazione e l'immunoprecipitazione. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61243/61243fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig2.jpg"> Figura 2: Confronto western di una FPG localizzata nucleare, COL-19::GFP(NLS), livelli in campioni preparati a dounce e omogeneizzati da 250 μL e 100 μL di pellet di verme. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61243/61243fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig3.jpg"> Figura 3: Gw182 omologa AIN-1 co-immunopreciti con ALG-1. Western blotting per proteine ALG-1 e AIN-1 negli immunopreciti ALG-1. La co-immunoprecipitazione ALG-1/AIN-1 non è stata influenzata dall'assenza di hrpk-1. Ingresso = 10% di IP. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61243/61243fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61243/61243fig4.jpg"> Figura 4: Co-immunopreciti ALG-1 con HRPK-1. Viene mostrato l'gonfiore occidentale per HRPK-1 e ALG-1 negli immunopreciti HRPK-1. Ingresso = 10% di IP. * indica la catena pesante degli anticorpi. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61243/61243fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">M9 buffer (1 L)</td>
		</tr>
<tr>
<td>KH2PO4
</td>
			<td>3 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2HPO4
</td>
			<td>6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>fino a 1 L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2x Tampone di lysis (5 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicerolo al 100%</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>fino a 5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aggiungi fresco:</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Inibitore della proteasi senza EDTA</td>
			<td>1 compressa</td>
		</tr>
<tr>
<td>cocktail inibitore della fosfatasi 2</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>cocktail inibitore della fosfatasi 3</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Buffer di lysis</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Diluire il buffer di lysis 2x con un volume uguale di ddH20.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">1x Tampone di lavaggio 10 mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES (pH 7.4)</td>
			<td>300 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 M KCl</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10% TritonX</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgCl2
</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicerolo al 100%</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>ddH2O</td>
			<td>fino a 10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M DTT</td>
			<td>20 μL (aggiungere fresco)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Ricette
Figura supplementare 1. Vengono mostrate le membrane western blot a sondare completo utilizzate per generare figure 2-4. (A) Membrana sondata per la figura 2. Si noti che la membrana è stata tagliata per consentire il sondaggio simultaneo per GFP e Tubulina, riducendo le dimensioni complessive della macchia. (B) Membrana sondata per la figura 3. (C) Membrana sondata per la figura 3. *denota la catena pesante degli anticorpi. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61243/Supplemental_Figure_1.pdf" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

Questo metodo descrive un protocollo per la preparazione di estratti proteici ad alta produttività da campioni di caenorhabditis elegans e successiva co-immunoprecipitazione.

Preparazione dell'estratto proteico e co-immunoprecipitazione da Caenorhabditis elegans

Co-immunoprecipitation methods are frequently used to study protein-protein interactions. Confirmation of hypothesized protein-protein interactions or ...

protein-extract-preparation-co-immunoprecipitation-from

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Protein Extract Preparation and Co-immunoprecipitation from Caenorhabditis elegans

8.8K Views.  Kansas State University. Questo metodo descrive un protocollo per la preparazione di estratti proteici ad alta produttività da campioni di caenorhabditis elegans e successiva co-immunoprecipitazione.

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Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in several diseases including cancer. The free-living nematode C. elegans possesses an evolutionary and functionally conserved EGFR-RAS-ERK MAP signal cascade which is central for the development of the vulva. Gain of function mutations in RAS homolog LET-60 and EGFR homolog LET-23 induce the generation of visible nonfunctional ectopic pseudovulva along the ventral body wall of these worms. Previously, the multivulval (Muv) phenotype in these worms has been shown to be inhibited by small chemical molecules. Here we describe a protocol for using the worm in a liquid-based assay to identify inhibitors that abolish the activities of EGFR and RAS proteins. Using this assay, we show R-fendiline, an indirect inhibitor of K-RAS, suppresses the Muv phenotype expressed in the let-60(n1046) and let-23(sa62) mutant worms. The assay is simple, inexpensive, is not time consuming to setup, and can be used as an initial platform for the discovery of anticancer therapeutics.

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

The genetically tractable nematode Caenorhabditis elegans can be used as a simple and inexpensive model for drug discovery. Described here is a protocol to identify anticancer therapeutics that inhibit the downstream signaling of RAS and EGFR proteins.

Identificazione di inibitori EGFR e RAS utilizzando Caenorhabditis elegans

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

Impronta proteica radicale in vivo Hydroxyl per lo studio delle interazioni proteiche in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Biochimica

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully utilized in the biochemical study of biological reactions using its nuclear extracts such as in vitro transcription and DNA replication. A significant hurdle for using C. elegans in biochemical studies is disrupting the nematode&#39;s thick outer cuticle without sacrificing the activity of the nuclear extract. While several methods are used to break the cuticle, such as Dounce homogenization or sonication, they often lead to protein instability. There are no established protocols for isolating active nuclear proteins from larva or adult C. elegans for in vitro reactions. Here, the protocol describes in detail the homogenization of larval stage 4 C. elegans using a Balch homogenizer. The Balch homogenizer uses pressure to slowly force the animals through a narrow gap breaking the cuticle in the process. The uniform design and precise machining of the Balch homogenizer allow for consistent grinding of animals between experiments. Fractionating the homogenate obtained from the Balch homogenizer yields functionally active nuclear extract that can be used in an in vitro method for assaying transcription activity of C. elegans.

Isolation of Active Caenorhabditis elegans Nuclear Extract and Reconstitution for In Vitro Transcription

Here, we describe a detailed protocol for isolating active nuclear extract from larval stage 4 C. elegans and visualizing transcription activity in an in vitro system.

Isolamento dell'estratto nucleare attivo di Caenorhabditis elegans e ricostituzione per la trascrizione in vitro

Caenorhabditis elegans has been an important model system for biological research since it was introduced in 1963. However, C. elegans has not been fully ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

Prostaglandina estrazione e l&#39;analisi in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Biologia

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

Combinato di nucleotidi e proteina estrazioni in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Purificazione e analisi di Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble proteins over 40% of the time results in an extension of the lifespan in C. elegans, suggesting that many of these proteins are key determinants of the aging process. Isolation and quantitative identification of these insoluble proteins are crucial to understand key biological processes that occur during aging. Here, we present a modified and improved protocol that details how to extract and isolate the SDS-insoluble proteins (insolublome) from C. elegans more efficiently to streamline mass spectrometric workflows via a novel label-free quantitative proteomics analysis. This improved protocol utilizes a highly efficient sonicator for worm lysis that greatly increases efficiency for protein extraction and allows us to use significantly less starting material (approximately 3,000 worms) than in previous protocols (typically using at least 40,000 worms). Subsequent quantitative proteomic analysis of the insolublome was performed using data-dependent acquisition (DDA) for protein discovery and identification and data-independent acquisition (DIA) for comprehensive and more accurate protein quantification. Bioinformatic analysis of quantified proteins provides potential candidates that can be easily followed up with other molecular methods in C. elegans. With this workflow, we routinely identify more than 1000 proteins and quantify more than 500 proteins. This new protocol enables efficient compound screening with C. elegans. Here, we validated and applied this improved protocol to wild-type C. elegans N2-Bristol strain and confirmed that aged day-10 N2 worms showed greater accumulation of the insolublome than day-2 young worms.

<meta charset="utf8"></head><body>Quantificazione dell'aggregazione proteica insolubile in Caenorhabditis elegans durante l'invecchiamento con un nuovo flusso di lavoro di acquisizione indipendente

This novel workflow efficiently extracts and isolates SDS-insoluble proteins (insolublome) from Caenorhabditis elegans with minimal starting material for quantitative differential proteomic analysis. The protocol uses a comprehensive data-independent acquisition mass spectrometry analysis to quantify the insolublome and bioinformatic analysis to gain biological insights into aging mechanisms and pathologies.

Quantificazione dell'aggregazione proteica insolubile in Caenorhabditis elegans durante l'invecchiamento con un nuovo flusso di lavoro di acquisizione indipendente dai dati

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and sequencing. The traditional proteinase K-based methods for genomic DNA extraction from C. elegans take several hours. Commercial extraction kits that effectively break open the C. elegans cuticle and extract genomic DNA are limited. An easy, faster (~15 min), and cost-efficient method of extracting C. elegans genomic DNA that works well for classroom and research applications is reported here. This DNA extraction method is optimized to use single or a few late-larval (L4) or adult nematodes as starting material for obtaining a reliable template to perform PCR. The results indicate that the DNA quality is suitable for amplifying gene targets of different sizes by PCR, permitting genotyping of single or a few animals even at dilutions to one-fiftieth of the genomic DNA from a single adult per reaction. The reported protocols can be reliably used to quickly produce DNA template from a single or a small sample of C. elegans for PCR-based applications.

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Presented here is a description of the straightforward and relatively rapid isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA from one or a few animals using a commercially available tissue kit. The resulting gDNA preparation is a suitable template for PCR.

Estrazione su piccola scala di Caenorhabditis elegans DNA genomico

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Preparazione dell'estratto proteico e co-immunoprecipitazione da Caenorhabditis elegans

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Identificazione di inibitori EGFR e RAS utilizzando Caenorhabditis elegans

Impronta proteica radicale in vivo Hydroxyl per lo studio delle interazioni proteiche in Caenorhabditis elegans

Isolamento dell'estratto nucleare attivo di Caenorhabditis elegans e ricostituzione per la trascrizione in vitro

Prostaglandina estrazione e l'analisi in

Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

Combinato di nucleotidi e proteina estrazioni in Caenorhabditis elegans

Purificazione e analisi di Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Quantificazione dell'aggregazione proteica insolubile in Caenorhabditis elegans durante l'invecchiamento con un nuovo flusso di lavoro di acquisizione indipendente dai dati

Quantificazione dell'aggregazione proteica insolubile in Caenorhabditis elegans durante l'invecchiamento con un nuovo flusso di lavoro di acquisizione indipendente dai dati

Estrazione su piccola scala di Caenorhabditis elegans DNA genomico