La tecnica di tracciamento descritta in questo protocollo ci aiuta a studiare la morfogenesi neuronale e a spezzare la connettività nel sistema dei motoneuroni della Drosophila. Il colorante lipofilo può diffondersi rapidamente in ogni parte della membrana cellulare ad altissima densità. Questo è il motivo per cui il nostro protocollo si risolve in modo efficiente per trovare strutture di un neurone etichettato.
Se un terminale di assone è accessibile con una micropipetta di iniezione, questa tecnica potrebbe essere applicata a qualsiasi neurone negli stadi larvale e adulto delle mosche o in altri organismi. Se non si ha esperienza di sezionare o utilizzare un microiniettore preciso l'operazione sul campione, può essere impegnativo. Comprendere l'anatomia dell'embrione, aiuterà con la guida a una corretta porzione di strumenti per eseguire la dissezione o una dinjection.
Per iniziare, preparare e impaginazione di tutti i materiali di raccolta degli embrioni. Preparare l'apparato di filtrazione tagliando un tubo da 50 millilitri e tagliando aprire un foro nel cappuccio. Quindi impostare un filtro a rete con pori da 100 micrometri tra il tubo e il cappuccio.
Preparare la micropipetta di iniezione di colorante e l'ago di dissezione dallo stesso tubo capillare con un diametro interno di 1,2 millimetri. Tirare il tubo con una micropipetta, tirare al 7% da 170 volt di uscita massima per creare un ago affilato con un cono di circa 0,4 centimetri di lunghezza. Per preparare la micropipetta di iniezione di colorante, immergere la smerigliatrice con un agente bagnante e posizionare l'ago sul morsetto della micropipetta a 25-30 gradi.
Quindi abbassare la punta su due terzi del raggio dal centro della superficie smussata. Macinare l'ago mentre una siringa con tubi spinge l'aria in esso. Contrassegnare la micropipetta con un marcatore permanente a punta fine per indicare la posizione dell'apertura sulla punta dopo la smussatura perché può essere difficile individuare l'apertura stretta che si forma ad angolo.
Consentire alle mosche di deporre le uova durante la notte a temperatura ambiente e raccogliere il tubo con le uova al mattino. Per raccogliere gli embrioni, declorinare le uova sul piatto con il 50% di candeggina per cinque minuti. Una volta che i cloruri sono stati cancellati, versare il contenuto della piastra attraverso l'apparato di filtrazione o il filtro cellulare per isolare gli embrioni.
Utilizzare una bottiglia d'acqua spremuta per diluire la candeggina lasciata sul piatto e raccogliere il maggior numero possibile di embrioni decantando la miscela nel filtro. Lavare gli embrioni da tre a quattro volte con acqua fino a quando l'odore di candeggina si dissipa. Rimuovere il filtro dall'apparecchio e lavarlo su un'altra piastra pulita con acqua.
Quindi decantare l'acqua dal nuovo piatto su cui si trovano gli embrioni. Utilizzare forcep fini per selezionare da cinque a 10 embrioni a 15 ore dalla deposizione delle uova e posizionarli su nastro a doppia mano con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Aggiungere la suoneria degli insetti al pool di dissezione per proteggere gli embrioni dall'essiccazione.
Utilizzare un ago di vetro al microscopio a dissezione per trascinare l'embrione dalla membrana di metà del nastro sul vetro, facendo attenzione a non danneggiare i tessuti interni dell'embrione. Quindi tagliare attraverso la linea media di un singolo embrione sulla sua superficie dalla sua estremità posteriore a anteriore. Capovolgere i tessuti epiteliali dal centro e attaccare il bordo epidermico sulla superficie dello scivolo di vetro.
Utilizzare un ago collegato a tubo con un'apertura della punta di circa 300 micrometri per aspirare o soffiare aria per rimuovere i tronchi tracheali longitudinali dorsali e le eventuali viscere rimanenti. Utilizzare 4%PFA e PBS per fissare gli embrioni per cinque minuti a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Quindi lavarli tre volte con PBS.
Macchiare gli embrioni con un microlitro di anticorpo anti rafano perossidasi coniugato con colorante cianina3 e 200 microlitri di PBS per un'ora sullo shaker orbitale. E ripetere i lavaggi in PBS. Per riempire la micropipetta di iniezione, posizionarla nel supporto capillare.
Posizionare quindi lo scivolo di tintura sul palco e utilizzare il micromanipolatore per posizionarlo sullo scivolo. Quindi regolare il palco per posizionare la micropipetta sul colorante. Raccogliere il colorante nella micropipetta impostando la pressione di iniezione tra 200 e 500 ettopascal, il tempo di iniezione tra 0,1 e 0,5 secondi e la pressione di compensazione a zero per cinque minuti.
Una volta raccolto il colorante, rimuovere lo scivolo di tintura e posizionare il campione sullo stadio del microscopio. Quindi aumentare la pressione di compensazione a un intervallo da 30 a 60 ettopascal e abbassare la micropipetta nel campione. Utilizzare la lente 10 volte obiettiva per localizzare l'embrione e allineare la micropipetta con l'embrione.
Cambia l'obiettivo in un'immersione in acqua 40 volte l'obiettivo. E immergere l'obiettivo nel PBS. Utilizzare la microscopia a fluorescenza per controllare la morfologia neuronale contrassegnata dall'anti-HRP Cy3 e determinare il sito di iniezione.
Quando l'embrione è a fuoco cambiare la posizione della micropipetta per fare un contatto delicato con la punta dell'assone di interesse. Quindi utilizzare la microscopia a campo luminoso durante l'iniezione per vedere la goccia di colorante. Far cadere il colorante nell'emisegmento addominale destro alla giunzione neuromuscolare di aCC o RP3 con DiD o DiO.
Utilizzare il controllo della mano per rilasciare il colorante e rimuovere la micropipetta. Quindi passare al sito di iniezione successivo. Incubare il campione per un'ora a temperatura ambiente su uno shaker orbitale prima dell'imaging.
Utilizzando forcep fini, rimuovere i nastri dal vetrino. Per montare il campione, preparare un coperchio scivolare con una piccola quantità di grasso sottovuoto ai quattro angoli. Posizionato con cura sul campione, assicurandosi di evitare bolle d'aria.
Spingere verso il basso lo slittamento del coperchio per regolare lo spazio dal campione per consentire la distanza di lavoro tra l'obiettivo e lo scivolo. Rimuovere il PBS in eccesso con le salviette delle attività. Sigillare completamente i bordi del coperchio scivolare con smalto per unghie.
Immagine a 10 volte e 100 volte l'ingrandimento con un microscopio confocale ed elaborare le immagini, con il software imageJ. Questo protocollo è stato utilizzato per retrogradare etichettare il motoneurone aCC innervating muscle one e il motoneurone RP3 innervating muscles six and seven. I rami dendritici dei motoneuroni ACC e RP3 mostrano una sovrapposizione estesa.
Entrambi i neuroni sono bipolari, stabilendo due diverse popolazioni di dendriti. Per dimostrare le capacità quantitative di questo metodo, il numero totale di punte di dendrite è stato conteggiato in caratteri selvatici e mutanti Dscam1. I dendriti ipsilaterali dell'aCC sono mostrati per il tipo selvaggio, ma sono stati osservati pochi dendriti ipsilaterali per il mutante Dscam1.
Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che la dimensione della goccia di colorante è cruciale, che è di circa 10-20 micrometri. Testare le dimensioni sul nastro a doppia parte e quindi applicarlo al sito di iniezione. Utilizzando questa procedura, possiamo sfruttare la proprietà foto commutabile della sonda DiD per ottenere immagini a super risoluzione della membrana plasmatica.
In questo modo possiamo studiare la caratterizzazione ultra strutturale delle membrane sinaptiche alla giunzione neuromuscolare. Abbiamo fatto il clic. Abbiamo eseguito un'analisi fenotipico dei dendriti aCC nel ceppo mutante e scopriamo che un'iniezione Dscam1-Dock-Pak definisce il sito della crescita della dendrite in aCC.
