Questo metodo può essere facilmente adattato per osservare segnali provenienti da altre proteine fluorescenti o può essere utilizzato per immaginare assoni in altri adulti Il vantaggio principale di questa tecnica facilita un'eccellente ricostruzione tridimensionale e la visualizzazione degli assoni e dei loro pergolati terminali. Iniziare riempiendo il numero appropriato di pozzi in una piastra multi-pozzo di vetro con 70%etanolo. Utilizzare un pennello per aggiungere da 15 a 20 mosche anestetizzate di anidride carbonica di qualsiasi età o sesso a ciascun pozzo e tamponare delicatamente le mosche nell'etanolo fino a quando non sono completamente sommerse.
Dopo non più di un minuto, sciacquare le mosche tre volte con una soluzione detergente tensioattiva non ionica allo 0,3% in salina tamponata con fosfato per almeno 10 minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare le forcelle per rimuovere la testa e l'addome di ogni mosca senza danneggiare il segmento toracico o le gambe e utilizzare la punta di un paio di forcelle fini per applicare delicatamente ma saldamente pressione alla giunzione coxa-torace per staccare una gamba dal segmento toracico. Posizionare le gambe in un pozzo di una nuova piastra multi-pozzo contenente paraformaldeide al 4% preparata al momento sul ghiaccio per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius.
È importante spingere delicatamente le gambe nel tampone di fissazione senza lasciarle galleggiare per ottenere gambe ben fissate. Il giorno successivo, lavare le gambe cinque volte in una soluzione di detersivo tensioattivo fresco allo 0,3% non ionico per 20 minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il detergente con il mezzo di montaggio e mantenere le gambe nel mezzo di montaggio per almeno 24 ore.
Il giorno successivo, aggiungere circa 20 microlitri di glicerolo al 70% accanto all'estremità rivestita dello scivolo del microscopio di vetro e coprire il glicerolo con un coverslip da 22 x 22 millimetri. Successivamente, aggiungere circa 10 microliter di mezzo di montaggio a destra del coverslip e applicare una seconda linea di 30 microliter di mezzo di montaggio a destra della linea da 10 microliter. Utilizzando forcep fini, trasferire una gamba dalla piastra multi-pozzo in una goccia di media alla striscia di 10 microliter del mezzo di montaggio in un lato esterno verso l'alto o verso il basso.
Ripetere fino a quando da sei a otto gambe sono state montate e allineate e posizionare una seconda coverlip sopra le gambe in modo che il secondo coverslip poggia leggermente sul primo copripasci. Quindi utilizzare lo smalto per unghie in ogni angolo dei copripasci per fissarli in posizione. Per immagini le gambe, utilizzare il laser da 488 nanometri e due rivelatori contemporaneamente per impostare la prima traccia per ottenere sia la fluorescenza automatica GFP che la cuticola.
Selezionare un obiettivo di immersione dell'olio da 20 a 25X e impostare la risoluzione su 1024 per 1024 pixel con una profondità di 12 bit e impostare la spaziatura z su un micrometro. Caricare lo scivolo sullo stadio del microscopio e utilizzare la stessa potenza laser per entrambi i rivelatori, regolare il guadagno del primo rivelatore per ottenere un segnale GFP luminoso e regolare il secondo rilevatore per garantire che alcune aree con un segnale cuticolare elevato producano un segnale saturo in questo rilevatore. Quindi immagini le gambe usando le opzioni di piastrella o posizione per catturare l'intera gamba se una gamba è estesa o troppo grande per essere immagine in un'unica cornice.
Per l'elaborazione delle immagini, apri lo stack confocale in ImageJ Fiji e usa il plug-in Bio-Formats per aprire tutte le immagini che non sono in formato TIFF. Per dividere i canali, selezionate Immagine, Colore e Dividi canali. Per sottrarre il segnale della cuticola dal segnale GFP, aprire Calcolatore processo e immagine e selezionare la pila dal rilevatore uno come immagine uno.
Nella finestra di funzionamento, selezionare sottrai e seleziona la traccia dal rivelatore due come immagine due in modo che venga ottenuto solo il segnale GFP endogeno. Utilizzare Image, Stacks, Z Protect per generare la proiezione di intensità massima per il segnale GFP endogeno. Utilizzare i controlli nella finestra di controllo della luminosità per regolare la luminosità e il contrasto.
Quindi genera un'intensità media per la cuticola, seguita da Immagine, Colore e Unisci canali per unire lo stack GFP con lo stack solo cuticola acquisito dal rivelatore due. Ciò si tradurrà in un'immagine RGB composta dal segnale GFP specifico del tessuto e dal segnale della cuticola per aiutare a identificare gli arbori dell'assone all'interno dei segmenti delle gambe. Per utilizzare la macro, aprire lo stack confocale e fare clic su Immagine, Regola e Luminosità/Contrasto.
Quindi fare clic su Plug-in ed Esecuzione macro per eseguire la macro e seguire le istruzioni. Quando viene chiesto di specificare l'operazione nella finestra della calcolatrice dell'immagine, selezionare l'immagine uno come pila uno. Nella finestra dell'operazione selezionare sottrai.
Selezionare l'immagine due come pila due. Quando viene chiesto di regolare il contrasto, utilizzare i controlli nella finestra di controllo della luminosità per regolare il contrasto di luminosità dell'immagine di proiezione massima di GFP e della proiezione media della cuticola per generare un'immagine unita RGB di entrambi i segnali che mostrano il GFP in verde e la cuticola in grigio. Quindi unire i risultati dello stack uno e impilarne due per generare una GFP combinata e una pila di cuticola che possono essere utilizzate nella fase successiva.
Per visualizzare le gambe in tre dimensioni, apri lo stack RGB in un programma software 3D appropriato. Nella finestra di dialogo popup, selezionare tutti i canali nella sezione di conversione della modalità e immettere le dimensioni di un voxel ottenuto dall'analisi precedente. Nel modulo canale uno fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Visualizza e Volren.
Quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul modulo Volren. Nella sezione Proprietà fare clic con il pulsante sinistro del mouse su Avanzate e scegliere DDR. Quindi regolare il valore gamma per visualizzare lo sfondo della cuticola.
Nel modulo canale due fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere Visualizza volren. Quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul modulo Volren, modificare e selezionare volrenGreen.col. Utilizzando questa procedura, il segnale della cuticola può essere combinato con il segnale GFP per identificare il posizionamento degli assoni all'interno delle gambe.
È di fondamentale importanza ottenere gambe ben fissate. Nelle gambe correttamente fisse, le strutture interne all'interno delle gambe sono di un colore uniforme e le trachee, che sono scure, sono visibili. Nelle gambe mal fissate, il materiale scuro è presente nel tarso e nella tibia e il sistema tracheale non è chiaramente visibile nel femore e nella coxa.
La procedura che abbiamo descritto qui supera la sfida di rilevare l'espressione fluorescente negli assoni dei motoneuroni attraverso una cuticola fluorescente spessa e auto ad alta risoluzione. Quindi il segnale fluorescente pulito e dettagliato ottenuto ci permette di visualizzare e quantificare la caratteristica tridimensionale degli arbori dell'assone utilizzando programmi di imaging 3D. Quindi questa tecnica ci permetterà di utilizzare la Drosophila adulta come modello non solo per studiare lo sviluppo del motoneurone, ma anche per studiare, per comprendere l'impatto di malattie degenerative come l'ERAS sul sistema locomotore integrato.
