Etichettando geneticamente singole cellule con proteine fluorescenti e seguendo quelle cellule nel tempo, il Topo Coriandoli ha permesso ai ricercatori di rivelare nuove intuizioni su molti processi biologici. Il nostro protocollo riduce al minimo i tempi di ritardo tra la raccolta dei tessuti e l'imaging, può essere applicato a qualsiasi tessuto mineralizzato o non mineralizzato e preserva la fluorescenza per diversi anni. Questo metodo è molto utile per tutte le aree della medicina rigenerativa e della biologia dello sviluppo perché può essere applicato a diverse popolazioni cellulari per studiare il loro destino e la loro cinetica purché sia disponibile una linea Cre adatta.
Le nostre istruzioni dettagliate dimostreranno il passo più impegnativo per distinguere la differenza di segnali fluorescenti emessi da diverse proteine fluorescenti. Inizia preparando il tessuto del topo per l'imaging. Per i tessuti molli e le tibiae mineralizzate e la femora da topi fino a 45 giorni, fissare il tessuto in PBS formaldeide preraffreddato al 3,7% e incubarlo a 4 gradi Celsius per sei ore mentre si rotola delicatamente su un rotatore.
Per i tessuti mineralizzati come tibiae e femora da topi di età superiore ai 45 giorni, preparare un litro di soluzione EDTA al 10% con il pH regolato a 8,05 con idrossido di sodio e diluire la formaldeide al 3,7% utilizzando questa soluzione. Fissare il tessuto mantenendolo in PBS di formaldeide al 3,7% durante la notte a 4 gradi Celsius. Il giorno successivo, posizionarlo nella soluzione EDTA di formaldeide preraffreddata e incubarlo a 4 gradi Celsius mentre si ruota per 48 ore, assicurandosi di sostituire la soluzione tre volte durante l'incubazione.
Quindi posizionare il tessuto in saccarosio preraffreddato al 30%, assicurandosi di riempire il contenitore fino all'orlo, e ruotarlo delicatamente durante la notte a quattro gradi Celsius. Al mattino, utilizzare le forcelle per rimuovere il tessuto dalla soluzione di saccarosio e risciacquarlo in cinque millilitri di composto ottimale della temperatura di taglio, o OCT, per alcuni secondi. Riempire un cryomold pre-etichettato con OCT e posizionare il tessuto sul fondo, lavorando rapidamente per evitare che il campione sia seduto a temperatura ambiente per troppo tempo.
Incorporare il campione posizionando lo stampo sul ghiaccio secco e aspettando che lo Strumento di personalizzazione di Office si solidifichiamo. Se i campioni non vengono utilizzati immediatamente, possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius. Rimuovere il blocco dallo stampo.
Applicare lo Strumento di personalizzazione di Office tra la parte superiore del blocco e il mandrino e raffreddarlo nel criostato per almeno cinque minuti o fino a quando lo Strumento di personalizzazione di Office non si solidifica completamente. Preraffreddare il portacampioni e il supporto della lama a meno 20 gradi Celsius, quindi posizionare il campione nel supporto del mandrino e la lama nel supporto della lama e consentire loro di equilibrare per diversi minuti. Per l'analisi postnatale delle lastre di crescita, preparare sezioni da 30 a 160 micrometri.
Utilizzare il criostato per tagliare il blocco e tagliare le sezioni di tessuto a uno spessore adeguato e raccoglierle su diapositive. Quindi asciugare all'aria gli scivoli a temperatura ambiente fino a quando non sono completamente asciutti e conservarli a meno 20 gradi Celsius per un massimo di 36 mesi. Quando si è pronti per l'uso della diapositiva, rimuoverla dal congelatore e portarla a temperatura ambiente in un porta scorrevole.
Per rimuovere lo Strumento di personalizzazione di Office, applicare delicatamente PBS sullo scivolo con la pipetta Pasteur. Per sezioni spesse 160 micrometri, incubare il vetrino per 15 minuti, rimuovere il liquido e applicare PBS fresco per altri cinque minuti. Montare i vetrini in una soluzione di tiodietanolo al 75% a temperatura ambiente con coperchi lunghi 60 millimetri.
Per prima cosa, selezionare il canale RFP facendo clic su di esso nella scheda canali, in modo che i dettagli del canale siano visualizzati nella scheda percorso luce. Quindi fare clic sulla casella di spunta accanto a T-PMT. Posizionare lo scivolo nel supporto dello scivolo e posizionare il tessuto di interesse direttamente tra il percorso della luce e l'obiettivo.
Per localizzare il tessuto, deselezionare le caselle YFP e CFP sotto l'intestazione delle tracce della scheda canali. Selezionare il canale T-PMT nell'intestazione delle tracce, quindi fare clic dal vivo nella scheda di acquisizione e aumentare il guadagno per il canale T-PMT per visualizzare la selezione dei tessuti sullo schermo. Regolare la posizione della diapositiva per individuare l'area di interesse e messa a fuoco utilizzando la manopola del microscopio appropriata.
Quindi fare clic su Interrompi nella scheda acquisizione per disattivare l'esposizione laser. Definire i parametri di imaging in base alle istruzioni del manoscritto e regolare la dimensione del foro stenopeico, se necessario. Controllare la configurazione per assicurarsi che i segnali registrati non si sovrappongano, quindi selezionare tutti e tre i canali nella scheda canali e premere il pulsante di aggancio.
Scorrere tra i canali di visualizzazione nell'immagine risultante facendo clic sulle caselle evidenziate blu sopra ogni canale nella scheda dimensioni e verificare manualmente la sovrapposizione tra i canali sullo schermo. Se i segnali si sovrappongono, riregolare i parametri fino a quando non possono essere distinti l'uno dall'altro. Questo protocollo è stato usato per etichettare i condrociti nella cartilagine epifisica e visualizzare la loro espansione clonale con l'età.
La sezione centrale è stata determinata visualizzando il legamento crociato e sono stati immaginati cloni nella piastra di crescita tibiale prossimale. Le singole cellule che erano col2 positive e sono state etichettate con proteine fluorescenti Confetti al momento della somministrazione di tamoxifene, hanno subito un'espansione clonale e successivamente sono rimaste nella piastra di crescita. Il segnale fluorescente può essere visualizzato dopo la memorizzazione a lungo termine.
Alcune sezioni sono state conservate per oltre tre anni prima della preparazione e dell'imaging. La ricostruzione tridimensionale è stata condotta automaticamente con software di analisi delle immagini ed esportata come video. Una sezione interrotta durante la fase di criosezione contiene un'area con un livello di ricombinazione così elevato da impedire l'analisi clonale, dimostrando uno dei problemi comuni incontrati con questo protocollo.
A seconda della domanda di ricerca, l'utilizzo di una linea Cre che etichetta specificamente le celle di interesse potrebbe essere molto importante. Pertanto, si consiglia di controllare la fluorescenza in quelle cellule poco dopo la ricombinazione. L'uso di linee Cre inducibili è essenziale perché la ricombinazione continua del DNA in linee Cre non inducibili può alterare il profilo fluorescente delle cellule diluite, impedendo così l'analisi clonale.
Questo protocollo può essere combinato con perturbazioni funzionali come ceppi geneticamente manipolati, trattamenti farmacologici, interventi chirurgici, nonché colorazione immuno fluorescenza di sezioni preparate.
