Questo protocollo consente di vedere diversi tipi di culture e osservare le loro interazioni con la matrice extracellulare. Il vantaggio principale di questo metodo è che la matrice che si ottiene viene rigenerata da fibroblasti e sarà abbastanza simile a quelle generate in vivo. Crediamo che questa malattia sia irrilevante quando si utilizza il fibroblasto ottenuto dai piatti da forno.
Stabilire una matrice da queste cellule potrebbe illuminarci come può avere effetto, ad esempio, sulla situazione persistente. Questi metodi possono anche essere applicati, ad esempio, agli studi fisici ai sopravvissuti delle proprietà della matrice. Visualizzazione di questo protocollo è importante osservare una tecnica di pipettazione dei passaggi che è necessario reggente.
Quando si provano questi metodi per la prima volta, probabilmente ci vorra' più tempo del previsto. Il nostro consiglio è di prepararti il più possibile in anticipo e utilizzare periodi di durata per prepararti per i prossimi passi. Inizia preparando lo 0,2% di gelatina, l'1% di glutaraldeide e una soluzione di etanolammina molare secondo le indicazioni del manoscritto.
Assicurarsi di eseguire ogni soluzione tramite un filtro da 0,22 micrometri prima dell'uso. Quindi, preparare l'acido ascorbico e il tampone dilisi. Diluire lo streptocoppo PBS come descritto nel manoscritto e preparare DMEM con il 10%FBS.
Preparare il 2%BSA denaturato termicamente aggiungendo 2 grammi di BSA a 100 millilitri di acqua sterile e riscaldarlo in un bagno d'acqua bollente per sette minuti. Quindi, integrare FBS con penicillina, streptomicina, gentamicina e anfotericina B.I telomeri ricombinanti della cultura hanno trasfettato fibroblasti di fronte all'uomo immortalati e DMEM con 10%FBS e li hanno mantenuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Per stabilire la coltura primaria di fibroblasti, tagliare i campioni di tessuto in piccoli pezzi di circa due o tre millilitri a cubetti e seminarli in FPS con un'alta concentrazione di antibiotici.
Quando compaiono i primi fibroblasti, sostituire il mezzo con il mezzo FBM per la manutenzione cellulare. Aggiungere due millilitri di soluzione di gelatina allo 0,2% a ciascun pozzo di un piatto di sei potte e incubarlo per un'ora per 37 gradi Celsius o durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aspirare la gelatina e lavarlo bene con due millilitri di PBS.
Aggiungere due millilitri dell'1% di glutaraldeide ad ogni pozzo e incubare la piastra a temperatura ambiente per trenta minuti che collegherà la gelatina. Aspirare la glutaraldeide e lavare i pozzi in due millilitri di PBS per cinque minuti. Per bloccare la glutaraldeide rimanente, aggiungere due millilitri di un'etanolammina molare e incubare la piastra a temperatura ambiente per trenta minuti.
Aspirare l'etanolammina e ripetere i lavaggi con PBS. Aggiungere un millilitro di DMEM con 10%FPS. Se il mezzo diventa immediatamente rosa, rimuoverlo, lavare i pozzetti una volta con due millilitri di PBS e aggiungere un altro millilitro di DMEM.
Seminare un millilitro di sospensione da fibroblasti con 5 x 10 alla quinta colonna in ogni pozzo e colturare le cellule fino a raggiungere il 100% di confluenza. Quindi rimuovere il mezzo e sostituirlo con DMEM con 10%FBS e 50 microgrammi per millilitro acido ascorbico. Sostituire il supporto ogni due giorni per sei giorni.
Due giorni dopo l'ultimo trattamento con acido ascorbico rimuovere il mezzo e lavare i pozzi con due millilitri di PBS. Dopo i lavaggi, aggiungere lentamente un millilitro di tampone di lisi preriscaldata e incubare la piastra a temperatura ambiente per cinque o dieci minuti fino a quando i fibroblasti non vengono lisciviati. Senza rimuovere il tampone di lisi, aggiungere con cura due millilitri di PBS ad ogni pozzo e quindi aspirare circa 2,5 millilitri.
Ripetere questo processo due volte per un totale di tre lavaggi. Dopo il lavaggio finale, aggiungere due millilitri di PBS con pen-strep. Sigillare il piatto con pellicola e tenerlo a quattro gradi Celsius per un massimo di tre mesi.
Far crescere le celle HUVEC e L'EMB-2 con 2%FBS fino alla massima confluenza. Quindi sostituire il mezzo con EBM-2 senza FBS per otto ore. Per preparare le matrici per la semina cellulare, rimuoverle dal frigorifero e lasciarle a temperatura ambiente per un'ora.
Bloccare le matrici sommando due millilitri di BSA denaturato termicamente e incubandoli a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, aspirare il BSA e lavarli con due millilitri di PBS. Seme 2 x 10 alla quinta cellule HUVEC in ogni pozzo della piastra rivestita con matrici derivate da fibroblasti.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 16 ore, quindi esaminare le strutture simili a tubi sotto un microscopio a campo luminoso standard con ingrandimento 20-40x. Questo protocollo è stato utilizzato per esaminare gli effetti del trattamento PDGF sulla formazione di matrici derivate da fibroblasti. I tre fibroblasti BGH che sono stati incubati con PDGF hanno mostrato una distribuzione cellulare più allineata nelle matrici rispetto a quelli incubati senza PDGF.
L'espressione del collagene 1 e della proteina fibronectina è stata aumentata in matrici derivate da fibroblasti stimolati dal PDGF e di conseguenza lo spessore della matrice è stato aumentato. Inoltre, gli istogrammi direzionali dimostrano che collagene 1 e fibronecina mostrano modelli paralleli. Quando le cellule HUVEC sono state sezionate su matrici decellularizzate derivate da fibroblasti stimolati dal PDGF hanno sviluppato strutture più capillari che in nessuna condizione stimolata.
Confermando che le matrici derivate da fibroblasti stimolati PDGF-BB promuovono l'attivazione delle cellule endoteliali. Quando si esegue questa procedura, è importante preparare le soluzioni in anticipo e assicurarsi che le celle siano pronte prima di iniziare. Oltre alle cellule endoteliali, le matrici possono anche essere sezionate con cellule epiteliali e può essere osservata la reazione a fattori esterni come la condizione nei media o i farmaci citotossici.
La generazione di matrice extracellulare è fondamentale nella progettazione di esperimenti macroambientali tumorali.
