Questo protocollo mostra che le radiazioni influenzano le proprietà della matrice extracellulare del tessuto adiposo nel cuscinetto di grasso mammario murino. L'aggiunta di radiazioni in un modello di decellularizzazione non è mai stata fatta prima. Questa tecnica utilizza diversi passaggi di lavaggio che servono ciascuno a uno scopo chimico unico nel processo di decellularizzazione.
La specificità di questa tecnica consente lavaggi chimici più delicati, per preservare meglio le proprietà tissutali. La ricaduta del cancro al seno si verifica dopo la terapia, specialmente nei casi tripli negativi. Valutare come la matrice extracellulare irradiata altera il comportamento delle cellule tumorali porterà a importanti scoperte sui meccanismi di ricorrenza.
Dopo aver irradiato i campioni, utilizzando una sorgente di cesio, trasferire le MFP irradiate e i mezzi RPMI completi in un armadio di biosicurezza. Riempire piatti di sei centimetri o 10 centimetri con mezzi sufficienti per immergere l'MFP. Incubare a 37 gradi Celsius, con 5% di anidride carbonica, per due giorni.
In primo luogo, posizionare l'MFP in piatti di sei centimetri con cinque millilitri di soluzione Trypsin-EDTA. Spruzzare e pulire i piatti con il 70% di etanolo e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Utilizzare filtri da 0,7 millilitri per lavare le MFP con acqua deionizzata, versando acqua sul tessuto tre volte.
Utilizzare le forcep per massaggiare manualmente il tessuto tra un lavaggio e l'altro. Successivamente, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Posizionare i tessuti essiccati in un becher pre-autoclavato, contenente una barra di agitazione di dimensioni appropriate e coprire i tessuti con 60 millilitri di 3%t-ottilfenossipotetossietanolo per grammo di tessuto.
Mescolare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi gettare il contenuto del becher in un colino. Risciacquare il becher con acqua deionizzata e versarlo sui tessuti.
Ripetere questo processo di risciacquo altre due volte, assicurandosi di utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro. Dopo questo, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulire e pesare. Riposizionare i tessuti e le barre di agitazione negli stessi becher e coprirli con 60 millilitri di acido deossicolico al 4% per grammo di tessuto.
Mescolare a temperatura ambiente per un'ora. Quindi, gettare il contenuto del becher in un colino a rete, sciacquare il becher con acqua deionizzata e versarlo sui tessuti. Ripetere questo processo di risciacquo altre due volte, assicurandosi di utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto tra un risciacquo e l'altro.
Asciugare brevemente il tessuto risciacquato su una delicata salvietta e pesarlo. Mettere i tessuti essiccati nello stesso becher, insieme all'acqua fresca deionizzata, integrata con 1%penicillina-streptomicina. Coprire saldamente il becher con pellicola di paraffina e lasciare a 4 gradi Celsius durante la notte.
Il giorno dopo scolare il contenuto del becher in un colino, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Quindi, posizionare l'MFP nello stesso becher con una barra di agitazione di dimensioni appropriate. Coprire il tessuto con 60 millilitri di una soluzione contenente il 4%etanolo e lo 0,1% di acido peracetico per grammo di tessuto.
Mescolare a temperatura ambiente per due ore. Gettare il contenuto del becher in un colino da 0,7 millimetri. Utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto e riposizionare il contenuto nel becher.
Lavare il tessuto coprendolo con 60 millilitri di 1X PBS per grammo di tessuto. Mescolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripeti l'intero processo di lavaggio ancora una volta.
Quindi, gettare il contenuto del becher in un colino di 0,7 millimetri. Utilizzando le forcelle, massaggiare manualmente il tessuto e riposizionare il contenuto nel becher. Lavare il tessuto coprendolo con 60 millilitri di acqua deionizzata per grammo di tessuto.
Mescolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripeti l'intero processo di lavaggio ancora una volta. Asciugare brevemente il tessuto lavato su una delicata salvietta e pesarlo.
Gettare il tessuto e il contenuto in un colino e utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto. Riposizionare il contenuto nel becher e coprire i tessuti con 60 millilitri di 100%n-propanolo per grammo di tessuto. Mescolare a temperatura ambiente per un'ora.
Quindi, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo. Gettare il tessuto e il contenuto in un colino di 0,7 millimetri e utilizzare le forcelle per massaggiare manualmente il tessuto. Riposizionare il contenuto nel becher e lavare il tessuto coprendolo con 60 millilitri di acqua deionizzata per grammo di tessuto.
Mescolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Ripetere questo processo di lavaggio tre volte. Dopo questo, asciugare brevemente il tessuto su un delicato compito pulirlo e pesarlo.
Trasferire il tessuto in un tubo etichettato da 15 millilitri e congelare a -80 gradi Celsius durante la notte. In primo luogo, riempire un contenitore poco profondo con azoto liquido. Rimuovere i campioni dal congelatore e pesare ogni MFP lyophilizzato.
Posizionare un campione nella malta, utilizzare un guanto criogenico per tenere la malta nell'azoto liquido. Quindi, utilizzare un pestello, attaccato a un trapano mentre si tiene a mano, per fresare il campione. Fresare a intervalli di un minuto per controllare l'avanzamento e rimuovere la mano guantata dall'azoto liquido.
Ripetere questo processo di fresatura per tutti i campioni, assicurandosi di spruzzare e pulire la malta e il pestello con etanolo tra ogni campione. Conservare i campioni in polvere in tubi da 15 millilitri a -80 gradi Celsius fino a quando non sono pronti per l'uso. Per iniziare, rimuovere i campioni dal congelatore e scongelare a temperatura ambiente.
Mentre i campioni vengono scongelati, mescolare la pepsina in acido cloridrico per formare una soluzione di Pepsin-HCL. Quindi, aggiungere la polvere di campione e la soluzione Pepsin-HCL a un tubo da 15 millilitri, aggiungere una piccola barra di agitazione e mescolare per 48 ore. Dopo questo, metti i tubi sul ghiaccio per cinque minuti.
Aggiungere 10X PBS a ciascun campione, in modo che la soluzione finale abbia una concentrazione di 1X PBS. Quindi, aggiungere il 10% di volume/volume, 0,1 idrossido di sodio molare ad ogni soluzione, per raggiungere il pH 7,4, utilizzando carta pH per testare ogni soluzione singolarmente. Utilizzando una soluzione di gel pH 7.4, rimescolare la GFP pellettata e la luciferasi etichettate 4T1 celle a una concentrazione di 500, 000 o 1.000.000 di cellule per millilitro di soluzione di gel.
Aggiungere 16 microlitri di soluzione di cellule gel ad ogni pozzo di uno scivolo da camera da 16 po 'e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di supporti RPMI completi a ciascun pozzo. Continuare a incubare a 37 gradi Celsius per 48 ore.
Quindi, usa un microscopio a fluorescenza per osservare le cellule a una lunghezza d'onda di eccitazione di 519 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 618 nanometri. In questo studio vengono studiati i normali effetti delle radiazioni tissutali, utilizzando idrogel a matrice extracellulare. La colorazione di ematossilina ed eosina è usata per confermare la decellularizzazione, attraverso la perdita di nuclei e altre tracce di DNA.
Mentre la colorazione Oil Red O viene utilizzata per valutare il contenuto lipidico e confermare la ritenzione di una morfologia della dipasite. Le proprietà reologiche degli idrogel ECM sono valutate a 37 gradi Celsius. Il modulo di stoccaggio è superiore al modulo di perdita per tutte le condizioni, dimostrando una formazione stabile di idrogel.
GFP e luciferasi etichettate 4T1 cellule carcinoma mammarie vengono quindi incapsulate negli idrogel. La proliferazione cellulare viene esaminata mediante microscopia a fluorescenza, mediante misurazioni dell'illuminescenza e colorazione di vitalità, 48 ore dopo l'incapsulamento. Gli idrogel irradiati mostrano una tendenza crescente nella proliferazione delle cellule tumorali.
Il coniugato di phalloidina viene utilizzato per visualizzare l'F-Actin nelle cellule incapsulate. Ricordarsi di raffreddare la malta prima di posizionare il tessuto all'interno del mulino, una malta calda può portare a fresatura incompleta. Prestare attenzione quando si maneggiano n-propanale e pepsina, solo aprire n-propanali e altri agenti decellularizzanti sotto una cappa chimica.
Se possibile, pesare la pepsina sotto una cappa chimica, in quanto vi è il pericolo di inalazione. I cambiamenti di composizione dell'ECM dopo l'irradiazione e la decellularizzazione possono essere valutati utilizzando la spettrometria di massa e la spettroscopia Raman. Inoltre, la struttura in fibra degli idrogel ECM può essere analizzata scansionando la microscopia elettronica.
Questo metodo ha il potenziale per essere ampliato per esaminare gli effetti delle radiazioni non solo sulle cellule tumorali ma anche sulle cellule immunitarie, così come sui tessuti che sperimentano danni da radiazioni, a causa della terapia. Questa tecnica di decellularizzazione consentirà ai ricercatori di valutare le proprietà della matrice extracellulare del tessuto dopo la radiazione, che è un'importante opzione di trattamento nella maggior parte dei tumori.
