Questo protocollo, il saggio di invasione in vitro, è uno strumento utile per misurare quantitativamente la capacità delle linee cellulari di migrare attraverso una matrice ricca di proteine e passare attraverso una membrana porosa, in un processo simile alle prime fasi dell'invasione delle cellule tumorali. Queste linee cellulari possono essere geneticamente alterate al fine di esprimere es oltre un gene o di avere una ridotta espressione di un gene al fine di determinare se quel gene gioca un ruolo nella migrazione cellulare o nell'invasione cellulare. Molti tumori aggressivi comportano cambiamenti drammatici nel comportamento cellulare, tra cui l'aumento della migrazione e dell'invasione.
Quindi questo saggio di invasione in vitro può permetterci di comprendere meglio i geni e altri fattori coinvolti in questo processo. Per iniziare questa procedura, far crescere le cellule tumorali mammarie del topo aderenti in un pallone T25 a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e umidità del 100% fino a quando non sono confluenti dal 70% al 90% per il primo giorno dell'esperimento. Recuperare gli inserti della camera Boyden dallo stoccaggio e trasferirli in una cappa di coltura cellulare per riscaldarli a temperatura ambiente per 20 minuti.
Utilizzare tre inserti per generare dati statisticamente validi per ogni riga di cella per ogni esperimento. E poi aggiungere 500 microlitri dei supporti DMEM pre-riscaldati senza siero agli inserti in modo che la membrana porosa e il gel siano idratati su entrambi i lati. Incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% e umidità del 100% per almeno due ore.
Successivamente, preparare le cellule rimuovendo il terreno di crescita e risciacquando le cellule con cinque millilitri di HBSS. Rimuovere l'HBSS e aggiungere un millilitro della soluzione EDTA allo 0,25%. Incubare a 37 gradi Celsius per uno o cinque minuti o fino a quando le cellule appaiono arrotondate o mostrano segni di distacco.
Quindi toccare delicatamente il pallone per staccare tutte le cellule. Sospendere di nuovo le celle in cinque millilitri di DMEM con 10%FBS. E trasferire la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga sterile da 15 millilitri.
Centrifugare le cellule e 1000 volte g per cinque minuti per pellettare delicatamente le cellule. Rimuovere il supporto e sospendere di nuovo il pellet in cinque millilitri di DMEM senza siero. Ripetere il processo di centrifugazione e nuova sospensione due volte in più per un totale di tre lavaggi.
Successivamente, sospendere completamente le cellule negli ultimi cinque millilitri di DMEM senza siero e assicurarsi che non ci siano grumi di cellule. Utilizzare un emocitometro per determinare la concentrazione cellulare assicurandosi di contare solo le cellule vitali. E diluire la sospensione cellulare a 50.000 cellule per millilitro in cinque millilitri di DMEM senza siero.
Quindi, rimuovere il piatto con gli inserti dall'incubatore e aspirare delicatamente il supporto da un inserto. Sollevare l'inserto e aspirare il supporto dal pozzo. Lavorando rapidamente, aggiungere il chemioattrattante alla camera inferiore.
Posizionare l'inserto nel pozzo e, per un piatto da 24 porri, aggiungere 500 microlitri della sospensione cellulare all'inserto. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria su entrambi i lati della membrana. Restituire il piatto all'incubatore di coltura cellulare per 22 ore.
Dopo 22 ore, preparare una soluzione di paraformaldeide all'1% e un X PBS per la fissazione. In un piatto pulito da coltura cellulare da 24 pozzetti, aggiungere un millilitro del fissatore ai singoli pozzi in modo che ce ne sia un pozzo per ogni inserto. Quindi, preparare la soluzione di colorazione dello 0,1% di viola cristallino in una soluzione di PBS con 10%etanolo.
Aggiungere un millilitro di questa soluzione di colorazione a un pozzo pulito per ogni inserto. Utilizzando le forcep, rimuovere ogni inserto uno alla volta. Posizionare un batuffolo di cotone sterile all'interno di ogni inserto e tamponare il lato superiore della membrana per rimuovere eventuali cellule non migrate.
Ripetere questo processo con un secondo batuffolo di cotone. Successivamente, rimuovere tutti i supporti rimanenti dall'interno dell'inserto e aggiungere 750 microlitri di PBS per lavare via eventuali celle staccate. Rimuovere il PBS e ripetere il lavaggio con PBS fresco.
Quindi posizionare l'inserto in un pozzo contenente fissatore per fissare le cellule migrate sul lato inferiore della membrana. Ripetere questo processo per tutti gli inserti e lasciare che gli inserti si fissino per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere ogni inserto uno alla volta dal suo pozzo e lavarlo con 750 microlitri di PBS.
Posizionare l'inserto in una soluzione di colorazione ben contenente e lasciarlo per 15 minuti per macchiare tutte le celle migrate e fisse. Quindi rimuovere gli inserti e immergerli in un becher contenente acqua distillata fino a quando l'acqua che scorre dall'inserto è limpida. Rimuovere eventuali goccioline d'acqua in eccesso e posizionare l'inserto lateralmente su un pezzo di carta da filtro.
Lasciare asciugare all'aria gli inserti. Preparare la membrana per l'imaging etichettando un vetrino di vetro pulito per ogni inserto e posizionando una piccola goccia di olio ad immersione al microscopio al centro di ogni diapositiva. Utilizzando un bisturi, tagliare intorno al perimetro della membrana all'interno dell'inserto di plastica per staccare la membrana.
Utilizzare le forcep per rimuovere la membrana e posizionarla sopra la goccia d'olio sullo scivolo etichettato. Utilizzando un microscopio composto, visualizzare le celle a cinque volte, 10 volte o 20 volte l'ingrandimento. Per la quantificazione, scatta più immagini non sovrapposte con un ingrandimento 10 volte superiore.
Determinare il numero totale di celle o celle invasori per area per tutti i campioni. Per ogni esperimento, eseguire ogni condizione nel saggio con tre inserti replicati e ripetere più volte per risultati statisticamente utili. In questo studio, l'invasione in vitro attraverso una matrice proteica viene utilizzata per valutare i fenotipi aggressivi nei comportamenti cellulari oncogeni delle cellule tumorali mammarie del topo con espressione alterata della proteina delle dita di zinco, Zc3h8.
Livelli più elevati di espressione di Zc3h8 sono osservati nelle linee cellulari tumorali o dall'espressione mediata del promotore da un plasmide, con conseguente rapidi tassi di proliferazione cellulare, migrazione rapida, crescita in ambienti 3D e aumento dell'invasione all'interno del saggio di invasione in vitro. Al contrario, la diminuzione dell'espressione da parte dei costrutti di shRNA si traduce in proliferazione, migrazione e invasione meno aggressive. Mentre l'invasione cellulare diminuisce al momento dell'abbattimento dello shRNA dell'espressione Zc3h8, quell'invasione viene salvata quando l'espressione viene salvata.
La tecnica di dosaggio dell'invasione in vitro è estremamente utile in quanto è un approccio rapido, economico, flessibile e relativamente facile allo studio del comportamento cellulare. Le cellule coltivate in coltura sono facili da manipolare geneticamente. Possono anche essere testati per mutazioni specifiche.
Il sistema di invasione in vitro consente anche l'analisi di inibitori di piccole molecole e agenti biologici come i microRNA per i loro effetti sulla migrazione e l'invasione cellulare. Questo saggio include anche una grande quantità di flessibilità, consentendo l'alterazione del contenuto proteico della matrice, delle dimensioni dei pori e del chemioattrattante.
