Dieses Protokoll, der In-vitro-Invasionstest, ist ein nützliches Werkzeug zur quantitativen Messung der Fähigkeit einer Zelllinien, durch eine proteinreiche Matrix zu wandern und eine poröse Membran zu durchlaufen, in einem Prozess, der den frühen Stadien der Krebszellinvasion ähnelt. Diese Zelllinien können genetisch verändert werden, um ein Gen zu übertragen oder die Expression eines Gens zu reduzieren, um festzustellen, ob dieses Gen eine Rolle bei der Zellmigration oder Zellinvasion spielt. Viele aggressive Krebsarten beinhalten dramatische Veränderungen im Zellverhalten, einschließlich erhöhter Migration und Invasion.
Dieser In-vitro-Invasionstest kann es uns ermöglichen, die Gene und andere Faktoren, die an diesem Prozess beteiligt sind, besser zu verstehen. Um dieses Verfahren zu beginnen, wachsen anhimante Maus-Mammary-Tumorzellen in einem T25-Kolben bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und 100% Luftfeuchtigkeit, bis sie 70% bis 90% konfluent für tag eins des Experiments sind. Holen Sie die Boyden Kammereinsätze aus dem Lager und übertragen Sie sie auf eine Zellkulturhaube, um sie für 20 Minuten auf Raumtemperatur zu erwärmen.
Verwenden Sie drei Einfügungen, um statistisch gültige Daten für jede Zelllinie für jedes Experiment zu generieren. Und dann 500 Mikroliter des vorgewärmten serumfreien DMEM-Mediums zu den Einsätzen geben, so dass die poröse Membran und das Gel beidseitig hydratisiert sind. Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und 100% Luftfeuchtigkeit für mindestens zwei Stunden inkubieren.
Danach bereiten Sie die Zellen vor, indem Sie die Wachstumsmedien entfernen und die Zellen mit fünf Millilitern HBSS spülen. Entfernen Sie den HBSS und fügen Sie einen Milliliter 0,25%trypsin EDTA Lösung hinzu. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für ein bis fünf Minuten oder bis Zellen gerundet erscheinen oder Anzeichen einer Ablösung zeigen.
Tippen Sie dann vorsichtig auf den Kolben, um alle Zellen zu lösen. Setzen Sie die Zellen in fünf Milliliter DMEM mit 10%FBS wieder aus. Und übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles 15 Milliliter Zentrifugenrohr.
Zentrifugieren Sie die Zellen und 1000 mal g für fünf Minuten, um die Zellen sanft zu pellet. Entfernen Sie das Medium und setzen Sie das Pellet in fünf Milliliter serumfreiem DMEM wieder auf. Wiederholen Sie die Zentrifugation und den Wiederaussetzungsprozess zwei weitere Male für insgesamt drei Wäbungen.
Danach setzen Sie die Zellen in den letzten fünf Millilitern serumfreiem DMEM gründlich wieder auf und stellen Sie sicher, dass es keine Zellklumpen gibt. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellkonzentration zu bestimmen, um sicherzustellen, dass nur lebensfähige Zellen zählen. Und verdünnen Sie die Zellsuspension auf 50.000 Zellen pro Milliliter in fünf Milliliters serumfreiem DMEM.
Als nächstes entfernen Sie die Schale mit den Einsätzen aus dem Inkubator, und saugen Sie das Medium vorsichtig von einem Einsatz ab. Heben Sie den Einsatz an und aspirieren Sie die Medien aus dem Brunnen. Schnell arbeiten, fügen Sie das Chemoattractant in die untere Kammer.
Legen Sie den Einsatz in den Brunnen, und für eine 24 Brunnenschale, fügen Sie 500 Mikroliter der Zellsuspension auf den Einsatz. Stellen Sie sicher, dass auf beiden Seiten der Membran keine Luftblasen vorhanden sind. Bringen Sie das Gericht für 22 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurück.
Nach 22 Stunden eine Lösung aus 1%Paraformaldehyd und einem X PBS zur Fixierung vorbereiten. In einem sauberen 24 Gut-Zell-Kultur-Gericht, fügen Sie einen Milliliter des Fixativs zu einzelnen Brunnen, so gibt es einen Brunnen für jeden Einsatz. Bereiten Sie dann die Färbelösung von 0,1% Kristallviolett in einer Lösung von PBS mit 10% Ethanol vor.
Fügen Sie einen Milliliter dieser Färbelösung zu einem sauberen Brunnen für jeden Einsatz hinzu. Entfernen Sie mit Zangen jede Einfügung nacheinander. Legen Sie einen sterilen Wattestäbchen in jeden Einsatz und wischen Sie die Oberseite der Membran ab, um alle nicht migrierten Zellen zu entfernen.
Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einem zweiten Wattestäbchen. Entfernen Sie als Nächstes alle verbleibenden Medien von der Innenseite des Einsatzes, und fügen Sie 750 Mikroliter PBS hinzu, um alle abgetrennten Zellen wegzuwaschen. Entfernen Sie die PBS und wiederholen Sie die Wäsche mit frischen PBS.
Legen Sie dann den Einsatz in einen Brunnen, der Fixativ enthält, um die migrierten Zellen auf der Unterseite der Membran zu fixieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Einsätze und lassen Sie die Einsätze 15 Minuten bei Raumtemperatur fixieren. Danach entfernen Sie jeden Einsatz nacheinander aus seinem Brunnen und waschen Sie ihn mit 750 Mikroliter PBS.
Legen Sie den Einsatz in eine gut enthaltende Färbelösung und lassen Sie ihn 15 Minuten lang, um alle migrierten und festen Zellen zu färben. Entfernen Sie dann die Einsätze und tauchen Sie sie in einen Becher mit destilliertem Wasser, bis das Wasser, das von der Einlage abfließt, klar ist. Entfernen Sie überschüssige Wassertröpfchen und legen Sie den Einsatz seitlich auf ein Stück Filterpapier.
Lassen Sie die Einsätze lufttrocknen. Bereiten Sie die Membran für die Bildgebung vor, indem Sie für jeden Einsatz ein sauberes Glasmikroskopdia beschriften und einen kleinen Tropfen Mikroskop-Tauchöl in die Mitte jedes Dias legen. Mit einem Skalpell um den Umfang der Membran auf der Innenseite des Kunststoffeinsatzes schneiden, um die Membran zu lösen.
Verwenden Sie Zangen, um die Membran zu entfernen und auf den Öltropfen auf dem beschrifteten Schlitten zu legen. Mit einem zusammengesetzten Mikroskop können Sie Zellen fünfmal, zehnmal oder 20-mal vergrößern. Nehmen Sie zur Quantifizierung mehrere nicht überlappende Bilder bei der 10-fachen Vergrößerung.
Bestimmen Sie die Gesamtzahl der einfallenden Zellen oder Zellen pro Fläche für alle Proben. Führen Sie für jedes Experiment jede Bedingung im Test mit drei Replizierenvoneinsätzen aus und wiederholen Sie sie mehrmals, um statistisch nützliche Ergebnisse zu erzielen. In dieser Studie wird die In-vitro-Invasion durch eine Proteinmatrix verwendet, um die aggressiven Phänotypen in onkogenen Zellverhalten von Maus-Mammary-Tumorzellen mit veränderter Expression des Zinkfingerproteins Zc3h8 zu bewerten.
Höhere Konzentrationen der Zc3h8-Expression werden in Tumorzelllinien oder durch Promotor vermittelte Expression eines Plasmids gesehen, was zu schnellen Raten der Zellproliferation, schneller Migration, Wachstum in 3D-Umgebungen und erhöhtem Eindringen in den In-vitro-Invasionstest führt. Umgekehrt führt eine verminderte Expression durch shRNA-Konstrukte zu weniger aggressiver Proliferation, Migration und Invasion. Während die Zellinvasion nach shRNA-Knockdown des Zc3h8-Ausdrucks abnimmt, wird diese Invasion gerettet, wenn der Ausdruck gerettet wird.
Die In-vitro-Invasions-Assay-Technik ist äußerst nützlich, da sie ein schneller, kostengünstiger, flexibler und relativ einfacher Ansatz zur Untersuchung des Zellverhaltens ist. Zellen, die in der Kultur angebaut werden, sind leicht genetisch zu manipulieren. Sie können sogar auf spezifische Mutationen getestet werden.
Das In-vitro-Invasionssystem ermöglicht auch die Analyse von kleinen Molekülinhibitoren sowie biologischen Wirkstoffen wie Mikro-RNAs für ihre Auswirkungen auf die Zellmigration und -invasion. Dieser Test beinhaltet auch eine große Flexibilität, die eine Veränderung des Proteingehalts der Matrix, Porengröße und Chemoattractant ermöglicht.
