In questa recensione, discuteremo sia le tecniche di imaging che biochimiche utilizzate per studiare il posizionamento e la composizione degli organelli, nonché i riarrangiamenti del citoscheletro osservati durante la formazione di una sinapsi immunologica. Le fasi iniziali del rimodellamento attivo consentono alle cellule B di aumentare la loro superficie cellulare e massimizzare la quantità di complessi BCR antigeni raccolti alla sinapsi. D'altra parte, il reclutamento locale di lisosomi, insieme al centrosoma alla membrana sinaptica, può essere accoppiato alla secrezione di lisosomi, nota per facilitare l'estrazione di antigeni immobilizzati.
L'antigene uptaken viene ulteriormente elaborato all'interno di compartimenti endolisosomi in peptidi, che vengono caricati su molecole MHC di classe II per la presentazione alle cellule di aiuto T. Pertanto, lo studio della dinamica organelle associata alla sinapsi immunitaria è fondamentale per capire come le cellule B sono completamente attivate. L'immunofluorescenza delle cellule B attivate con antigeni immobilizzati ci permette di seguire diversi componenti cellulari e come possono essere reclutati nella sinapsi immunitaria.
Le cellule B possono essere attivate attraverso antigeni immobilizzati su una superficie di perline o una superficie di coprispaglia. Le perline rivestite di antigene vengono preparate incubando ligandi specifici con amino-perline precedentemente trattate con glutaraldeide per attivare gli amminoacidi. Resuspend attivava perline in 100 microlitri di PBS e vortice.
Nel frattempo, preparare la soluzione di antigene aggiungendo 100 microgrammi per mL di ligando BCR in 150 microlitri di PBS. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di perline attivate alla soluzione di antigene e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Ricorda, usa anche un ligando non correlato come controllo negativo.
Dopo l'incubazione, lavare le perline con PBS. Aspirare il supernatante e sostituirlo con PBS. Ripeti tre volte.
Successivamente, bloccare i tre ammino gruppi con perline rimescolate in 500 microlitri di una soluzione di BSA. Infine, resuspend perline in 70 microlitri di PBS. Per calcolare la concentrazione finale, è possibile utilizzare un emocitometro per contare le perline.
Per l'attivazione delle cellule B, utilizzare un tubo da 50 ml e cellule resuspend ad una concentrazione di 1,5 milioni per ml in CLICK integrata con siero bovino fetale al 5%. Successivamente, aggiungere 150.000 cellule B, corrispondenti a 100 microlitri della miscela di perline cellulari a un coverslip ad incubato rivestito in poli-L-lisina ad incubare a 37 gradi per i diversi punti di tempo. Un secondo approccio per attivare le cellule B è seminarle su coverlips rivestiti di antigene.
A questo scopo, rivestire le diapositive con anti-BCR e B220 con migliora l'adesione cellulare. Preparare la soluzione di antigene aggiungendo rispettivamente anti-BRC e B220 in PBS a una concentrazione finale di 10 microgrammi per mL e 0,5 microgrammi per mL. Successivamente, impostare il coperchio su un coperchio di 24 piastre ben coperte con pellicola parafilm e aggiungere 40 microlitri di soluzione di antigene.
Sigillare il piatto e quindi incubare a 4 gradi durante la notte. Per iniziare l'attivazione in coverslip, prima lavarli con PBS e lasciarli asciugare per alcuni minuti. Quindi, aggiungere 150.000 cellule B e incubare a 37 gradi per i diversi punti di tempo.
In entrambi i casi, quando si attiva con perline o diapositive rivestite di antigene, si consiglia di iniziare con il punto di tempo più lungo e quindi procedere a quelli più brevi. Una volta montato il coverslip asciutto sullo scivolo del microscopio, è possibile utilizzare un'epifluorescenza o un microscopio confocale per visualizzare i campioni, a seconda dei requisiti di risoluzione. Mettere a fuoco il campione utilizzando la luce trasmessa.
È necessario cercare i campi in cui celle e perline interagiscono con un rapporto uno e uno. Per le cellule B attivate su coverlip coperte da antigene, utilizzare l'obiettivo 100x per una migliore risoluzione. Per i parametri, prendere in considerazione l'assunzione di uno stack z che copra l'intera cella.
È possibile etichettare actin per delimitare i limiti inferiore e superiore della cella. Per le cellule B attivate con perline rivestite di antigene ed etichettarle per organelli confinati in un punto, prima delimitare due aree: l'area cellulare e l'area del tallone. Successivamente, identificare la posizione o l'organelli di un punto e ottenere le sue coordinate di localizzazione.
Disegna due vettori:uno tra il centro cellulare e l'organelli e l'altro tra il centro cellulare e il centro del tallone. Misurare la lunghezza di entrambi e misurare l'angolo tra i due vettori, ora indicato come alfa. Fare una proiezione con il vettore tra il centrosoma e il centro cellulare usando il guassian di alfa e quindi calcolare l'indice di polarità dell'organelle dividendo il vettore proiettato, a, per b.
Quindi un indice di polarità tra zero e uno indica un fenotipo polarizzato. I valori compreso tra zero e meno uno indicano un fenotipo non polarizzato. Per determinare l'indice di polarità per organelli più dispersi, come i lisosomi, è possibile utilizzare lo stesso algoritmo menzionato in precedenza, cambiando le coordinate di localizzazione degli organelli per le coordinate del centro di massa delle etichette, in questo caso i lisosomi.
Analogamente all'analisi descritta in precedenza, un indice di polarità tra zero e uno indica un fenotipo polarizzato, mentre i valori tra zero e meno uno indicano un fenotipo non polarizzato. Per quantificare la quantità di ogni organelle strettamente reclutato nella nuova sinapsi, è possibile calcolare la percentuale della fluorescenza dell'organelle al tallone. Per questo, è necessario delimitare il tallone e l'area cellulare, misurare la rispettiva intensità di fluorescenza e quindi dividere la fluorescenza del tallone per la somma del tallone e della fluorescenza cellulare.
Troverete la quantità di ogni organelli che è a contatto con la nuova sinapsi. In alternativa, disegnare un rettangolo opposto alla perla. Utilizzare un peso corrispondente a un quarto della lunghezza della cella, quindi misurare l'intensità della fluorescenza all'interno del rettangolo e dividerlo per la fluorescenza totale.
Questo algoritmo sarà sempre quello di ottenere la percentuale di organelli che è strettamente alla nuova sinapsi, ma non necessariamente a diretto contatto con l'interfaccia. Per quantificare i componenti associati al centrosoma nelle celle B a riposo e attivate. In breve, determiniamo tre parametri.
L'area della cellula e del tallone e le coordinate di localizzazione centrosomale. Successivamente, definiamo un cerchio che circonda il centrosoma ed eseguiamo un'analisi del profilo radiale dal centro del centrosoma, precedentemente definito. Una volta che si dispone del plottaggio, determinare il raggio in cui viene mantenuto il 70% della fluorescenza massima.
Utilizzate questo raggio per disegnare un cerchio che circonda il centrosoma. Infine, ottenere la densità di fluorescenza del componente di interesse nell'area centrosoma e nell'area cellulare, e dividere entrambi i valori per ottenere il rapporto di densità fluorescente. Per misurare la distribuzione degli organelli all'interfaccia della sinapsi immunitaria, identificare prima l'area delle cellule B a contatto con il coverslip rivestito di antigene.
Puoi etichettare actin per aiutarti a definire quest'area. Quindi, misurare l'area a contatto con la diapositiva, l'altezza e la larghezza della cella. L'area di fronte allo slittamento del coperchio rivestito di antigene è una misura della diffusione della cellula B all'attivazione della cella B.
Utilizzare i valori di altezza e larghezza per delimitare un'area centrale della cella, separata dai limiti da un quarto dei valori di altezza e larghezza. Di solito questi corrispondono a circa un terzo dell'area totale della cella. Infine, calcolare il reclutamento degli organelli al centro della nuova sinapsi, dividendo la densità di fluorescenza nell'area centrale per la densità di fluorescenza dell'intera cellula.
I valori positivi di questo indice indicano un arricchimento dell'organelli al centro della nuova sinapsi. Al contrario, i valori negativi indicano una distribuzione periferica. Per misurare la distribuzione degli organelli attraverso i piani Z delle cellule B attivati su coverlips rivestiti di antigene, prima delimitare l'interfaccia sinaptica e il limite superiore della cellula.
Quindi, disegna una linea attraverso il centro della cella e riselizza l'immagine per ottenere un'immagine XZ. Misurare la testa della cellula e dividere l'immagine in 10 frazioni della stessa area, dalla sinapsi immunitaria al limite superiore della cellula. Misurare la fluorescenza in ogni frazione z e calcolare la percentuale di fluorescenza dividendo la fluorescenza ad ogni frazione z per la fluorescenza totale della cellula.
Infine, tracciare la percentuale di intensità di fluorescenza per frazione z. La frazione uno e due rappresentano l'interfaccia sinaptica. Ecco il flusso di lavoro o la procedura di isolamento centrosoma.
Utilizzare 20 milioni di cellule B per condizione. Pre-trattare le cellule con citocalcasina D e Nocodazolo secondo il protocollo richiesto per facilitare il distacco di centrosoma. Quindi, guarda le cellule rimontettandole in 5 mL di buffer TBS.
Ripetere utilizzando 1 mL di tampone TBS 0,1x integrato con l'8% di saccarosio. Rimescolare il pellet cellulare con 150 microlitri di tampone dilisi. Centrifuga a 10.000 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius per separare il citosolo e gli organelli dal nucleo.
Recuperare con cura il supernatante cellulare e posizionarlo sopra un tubo da 1,5 ml. Riempirlo con 300 microlitri di tampone di gradiente integrati con il 60% di saccarosio. Centrifuga i campioni a 10.000 g per 30 minuti a 4 gradi Celsius.
Questo passaggio di centrifugazione è importante per concentrare i centrosomi. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il supernatante fino a raggiungere l'interfaccia. Vortice il campione rimanente nel tubo.
Preparare il gradiente di saccarosio discontinuo in un tubo ultracentrifugo sovrapponendo 0,45 ml di saccarosio al 70%, con 0,27 ml di saccarosio al 50%, e quindi 0,27 ml di saccarosio al 40% in tampone di gradiente. Posizionare i campioni arricchiti di centrosoma sul gradiente discontinuo e calibrare il peso di ciascun campione nei rispettivi adattatori. Centrifugare i tubi a 40.000 g per 1 ora a 4 gradi Celsius, con accelerazione minima e senza rottura per evitare di perturbo del gradiente.
Dopo la centrifugazione, raccogliere con cura 12 frazioni con lo stesso volume. Riaspensare l'esempio con il buffer di caricamento ed eseguire un SDS-PAGE. Per studiare la distribuzione degli organelli nelle cellule B durante la formazione di una sinapsi immunitaria, abbiamo usato cellule 2A1.6 B attivate con perline rivestite di antigene per diversi punti di tempo.
Come controllo, le cellule B sono state attivate con perline contenenti un ligando BCR non correlato. Quindi, usando la colorazione immunofluorescenza, rileviamo diversi organelli, che cambiano la loro localizzazione all'attivazione con antigeni immobilizzati. Mostriamo qui il centrosoma, etichettato con alfa-tubulina e apparato golgi etichettato con Rab6a.
Nel grafico, mostriamo l'indice di polarità per la polarità dell'apparato centrosoma e golgi verus ogni punto di attivazione, in cui ogni punto rappresenta una cellula. Durante l'attivazione, possiamo osservare che gli indici di polarità per questi organelli raggiungono valori più vicini a 1, suggerendo un aumento del loro reclutamento nell'IS.Organelles che mostrano una distribuzione più dispersa, come i lisosomi, possono anche essere quantificati usando un indice di polarità. Possiamo osservare che l'indice di polarità del liosoma raggiungerà valori più positivi al momento dell'attivazione, che deriva dal reclutamento nell'IS. Mostriamo un approccio complementare per quantificare il reclutamento di un lisosoma verso la sinapsi immunitaria.
Utilizzando lo stesso protocollo di attivazione con perline rivestite di antigene, il reclutamento di lisosomi nell'IS è stato calcolato quantificando l'etichetta di fluorescenza dei liosomi reclutati nell'area definita intorno al tallone o all'interno dell'area sinaptica. Possiamo osservare che l'attivazione aperta. C'è un aumento dei lisosomi accoppiati al sito della sinapsi.
Qui presentiamo la quantificazione dell'actina al centrosoma in cellule B attivate con perline rivestite di antigene specifiche e non specifiche. Il pool di actin è indicato con una freccia. La quantificazione dei componenti associati al centrosoma, come l'actina in questo caso, può essere rappresentata da un grafico a punti, in cui ogni punto rappresenta una cella.
Dopo l'attivazione, la cellula B diminuisce la quantità di actina intorno al centrosoma. Questo passo è importante per staccare il centrosoma dalla regione perinucleare per consentirne la polarizzazione alla nuova sinapsi. Per le cellule B attivate su superficie rivestita di antigene, è possibile studiare il rimodellamento dell'actina e il reclutamento di organelli nella membrana sinaptica.
Qui mostriamo l'analisi degli organelli, come l'apparato golgi e il reticolo endoplasmatico, che mostrano rispettivamente una distribuzione centrale e periferica. Inoltre, possiamo calcolare l'area di diffusione delle cellule B dopo diversi punti di attivazione. A questo scopo, etichettiamo actin per essere in grado di definire il limite di cellule nel piano XY.
Nel grafico, è possibile osservare l'aumento dell'area cellulare dopo 30 e 60 minuti di attivazione. La distribuzione di un organelle può anche essere calcolata nel piano XZ in relazione all'interfaccia sinaptica. Il grafico rappresenta la distribuzione dell'actina nel piano z, dove i primi due piani corrispondono all'interfaccia sinaptica.
Possiamo osservare che actin si arricchisce in questo settore al momento dell'attivazione. Oltre all'analisi dell'imaging, l'approccio biochimico può anche essere usato per studiare il cambiamento nella composizione centrosomale dopo l'attivazione delle cellule B. Mostriamo qui una macchia occidentale rappresentativa di frazione contenente centrosoma evidenziata dal rettangolo beige.
Le frazioni centro-porose sono state isolate su un gradiente di saccarosio discontinuo e rilevate dal livellamento gamma-tubulina. La macchia occidentale sottostante mostra actina e Arp2 in frazioni centrosomali da cellule B a riposo, che si esauriscono al momento dell'attivazione. I linfociti B subiscono cambiamenti dinamici all'interfaccia della membrana al fine di formare una sinapsi immunitaria funzionale.
Questo processo può essere studiato mediante imaging e tecniche biochimiche descritte qui in questo video. Crediamo che questa analisi possa fornire informazioni di valore sui meccanismi molecolari coinvolti su come le cellule B possono essere attivate in modo efficiente.
