L'uso di un solo modello per sviluppare un modello di massa tumorale epatocellulare potrebbe aiutare le persone a chiarire la loro immunotoleranza indotta dal tumore e specifiche immunorisomie tumorali indotte dal trattamento. Il tumore ortotopico che si sviluppa con la tecnica della fibrosi epatica imita le caratteristiche cliniche del cancro al fegato umano. Questo metodo potrebbe fornire uno strumento utile nello studio immunologico del cancro epatocellulare.
La dimostrazione visiva di questo metodo può illustrare i passaggi tecnicamente più impegnativi, ad esempio l'iniezione intrasplenica, essenziali per un'esecuzione corretta di questo protocollo. Successivamente, trattenere manualmente un maschio, da sei a otto settimane C57 nero 6 mouse dorsale lato verso l'alto. Utilizzare scrub alternativi al 70% di etanolo e betadine per pulire il sito di iniezione tre volte.
Quindi consegnare 160 microlitri di tetracloruro di carbonio al topo mediante iniezione intraperitoneale e riportare l'animale nella sua gabbia di casa. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, in un topo transgenico antigene simian 40 T di cinque mesi, posizionare il mouse in posizione supina e fissare gli arti con del nastro adesivo. Fare un'incisione di laparotomia mediana lungo la lunghezza della linea alba, abbastanza grande da fornire un'adeguata esposizione del fegato, e spostare l'intestino a sinistra.
Sezionare sopra il fegato per esposizione la vena cava inferiore. Indurre un morsetto dell'arteria per ligare il vaso. Utilizzare un ago a farfalla per ottenere l'accesso endovenoso alla vena del portale e fissare manualmente il catetere.
Cambiando con cura le siringhe per ogni soluzione, fornire con successo 15 millilitri di soluzione uno, 15 millilitri di soluzione di collagenasi 0,75% due e 15 millilitri di soluzione due senza collagenasi tramite catetere, a una portata approssimativa di 8,9 millilitri di soluzione al minuto. Alla fine della perfusione, raccogliere la massa tumorale in un tubo conico da 50 millilitri contenente da 10 a 15 millilitri di PBS. Asporta il tumore dal prossimo topo MTD2 come appena dimostrato.
Usa le forbici per tagliare i fegati a pezzi più piccoli. Trasferire i tessuti in un nuovo contenitore di PBS fresco per rimuovere il resto del sangue dal tessuto prima di trasferire i pezzi di tessuto in un tubo conico da 50 millilitri contenente cinque millilitri di mezzo RPMI completo. Tritare i campioni di fegato lavati fino a quando i pezzi possono adattarsi facilmente attraverso la punta di una pipetta da cinque millilitri.
Aggiungere abbastanza mezzo al tubo per raggiungere un volume finale di 30 millilitri. Utilizzare una pipetta da cinque millilitri per triturare i frammenti di tessuto, prima di filtrare la soluzione attraverso un colino di 70 micrometri in un nuovo tubo da 50 millilitri. Lavare il colino più volte con mezzo completo.
Regolare il volume finale a 50 millilitri con un mezzo completo aggiuntivo. Ruotare rapidamente la sospensione per centrifugazione fino a un massimo di 50 volte g prima di fermare la centrifuga e decantare il supernatante. Quindi rimospensi il pellet in 20 millilitri di PBS per il conteggio.
Per l'iniezione intrasplenica degli epatociti MTD2, caricare una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 27 per ogni animale ricevente con 220 microlitri di epatociti per topo. Confermare la mancanza di risposta al pizzico in un animale anestetizzato trattato con tetracloruro di carbonio. Iniziando appena sotto il muscolo della colonna vertebrale, quindi, fai un'incisione di un centimetro sul fianco sinistro parallela alla tredicesima costola dall'estremo dorsale e usa le forcep con punte smussate per esternarizzare la milza.
Ritagliare la milza con due clip in titanio di medie dimensioni tra l'arteria e la vena splenica e fornire 200 microlitri di cellule nel polo inferiore della milza. Ritagliare il ramo inferiore del pedicolo con una clip di medie dimensioni e tagliare la milza tra le due clip inizialmente posizionate. Rimuovere il polo inferiore della milza che è stata iniettata direttamente con cellule tumorali e utilizzare 3-0 poliglactina 910 interrotta suturando per chiudere lo strato muscolare interno.
Quindi utilizzare clip sterilizzate per ferite in acciaio per chiudere lo strato esterno della pelle e somministrare per via sottocutanea cinque milligrammi per chilogrammo di carprofene. Dopo l'isolamento dai topi transgenici dell'antigene T come dimostrato, si possono osservare sia epatociti che cellule infiltrazioni tumorali. Le celle in genere dimostrano una vitalità di quasi il 100% dopo l'elaborazione.
Dopo l'inoculazione intrasplenica in animali trattati con tetracloruro di carbonio di tipo selvatico, gli epatociti trapiantati crescono con successo e in modo affidabile tumori del carcinoma epatocellulare ortotopico che esprimono l'antigene simian 40 T specifico del tumore. La preparazione della nostra popolazione vitale e pura di epatociti dalla massa MTD2 e la somministrazione accurata dell'iniezione intrasplenica sono importanti per il successo della procedura. Sebbene il nostro team abbia testato l'inoculazione di epatociti nei topi ricevente tramite iniezione intravascolare e intraperitoneale, questi altri metodi non sono stati in grado di indurre carcinoma epatocellulare ortotopico.
Questo modello fornisce una piattaforma unica che consente l'indagine per la sorveglianza immunitaria e la tolleranza nelle sue fasi iniziali e successive della progressione tumorale. Si prega di fare attenzione quando si utilizza il tetracloruro di carbonio, in quanto è tossico.
