L’utilisation juste d’un modèle pour développer un modèle hépatocellulaire de masse de cancer pourrait aider des personnes élucider leur immunotolerance tumeur-induite et traitement spécifique induit, n’importe quelle immunoresponses de tumeur. La tumeur orthotopique qui se développe avec la technique de fibrose hépatique imite les caractéristiques cliniques du cancer du foie humain. Cette méthode pourrait fournir un outil utile dans l’étude immunologique hépatocellulaire de cancer.
La démonstration visuelle de cette méthode peut illustrer les étapes plus techniquement difficiles, telles que l’injection intrasplenique, qui sont essentielles pour une exécution réussie de ce protocole. Ensuite, retenez manuellement un mâle, de six à huit semaines C57 noir 6 souris dorsale côté vers le haut. Utilisez d’autres gommages à 70 % d’éthanol et de bétadine pour nettoyer le site d’injection à trois reprises.
Livrez ensuite 160 microlitres de tétrachlorure de carbone à la souris par injection intraperitoneal et retournez l’animal dans sa cage d’origine. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des pieds, chez une souris transgénique simienne de cinq mois 40 T, placez la souris en position supine et fixez les membres avec du ruban adhésif. Faire une incision de laparotomie médiane le long de la longueur de l’alba linea, assez grand pour fournir une exposition adéquate du foie, et déplacer les intestins vers la gauche.
Disséquer au-dessus du foie pour l’exposition au cava vena inférieur. Induire une pince d’artère pour ligate le navire. Utilisez une aiguille papillon pour obtenir un accès intraveineux à la veine du portail et fixez manuellement le cathéter.
Changer soigneusement les seringues pour chaque solution, livrer avec succès 15 millilitres de solution un, 15 millilitres de 0,75%collagenase solution deux, et 15 millilitres de solution deux sans collagène via cathéter, à un taux d’écoulement d’environ 8,9 millilitres de solution par minute. À la fin de la perfusion, récolter la masse tumorale dans un tube conique de 50 millilitres contenant 10 à 15 millilitres de PBS. Exciser la tumeur de la prochaine souris MTD2 comme vient de le démontrer.
Utilisez des ciseaux pour couper les foies en petits morceaux. Transférer les tissus dans un nouveau récipient de PBS frais pour enlever le reste du sang du tissu avant de transférer les morceaux de tissu dans un tube conique de 50 millilitres contenant cinq millilitres de milieu rpmi complet. Hacher les échantillons de foie lavés jusqu’à ce que les morceaux puissent s’insérer facilement à travers la pointe d’une pipette de cinq millilitres.
Ajouter suffisamment de milieu au tube pour atteindre un volume final de 30 millilitres. Utilisez une pipette de cinq millilitres pour triturer les fragments de tissu, avant de filtrer la solution à travers une passoire de 70 micromètres dans un nouveau tube de 50 millilitres. Laver la passoire plusieurs fois avec un milieu complet.
Réglez le volume final à 50 millilitres avec un support complet supplémentaire. Faites tourner rapidement la suspension par centrifugation jusqu’à un maximum de 50 fois g avant d’arrêter la centrifugeuse et de décanter le supernatant. Puis resuspendez la pastille en 20 millilitres de PBS pour le comptage.
Pour l’injection intrasplenique des hépatocytes MTD2, chargez une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 27 par animal receveur avec 220 microlitres d’hépatocytes par souris. Confirmer un manque de réponse au pincement des pieds chez un animal anesthésié traité au tétrachlorure de carbone. En commençant juste en dessous du muscle de la colonne vertébrale, ensuite, faire une incision d’un centimètre sur le flanc gauche parallèle à la treizième côte de l’extrême dorsale et utiliser des forceps émoussés pour extérioriser la rate.
Couper la rate avec deux clips de titane de taille moyenne entre l’artère splénique et la veine, et livrer 200 microlitres de cellules dans le pôle inférieur de la rate. Coupez la branche inférieure du pédule avec un clip de taille moyenne et coupez la rate entre les deux clips initialement placés. Enlever le pôle inférieur de la rate qui a été directement injecté avec des cellules tumorales et utiliser 3-0 polyglactine 910 interrompu suturing pour fermer la couche musculaire interne.
Utilisez ensuite des pinces à plaies en acier stérilisées pour fermer la couche externe de la peau et administrer sous-cutanéement cinq milligrammes par kilogramme de carprofène. Après isolement des souris transgéniques d’antigène de T comme démontré, les hépatocytes et les cellules d’infiltration de tumeur peuvent être observés. Les cellules démontrent généralement une viabilité de près de 100% après traitement.
Après l’inoculation intrasplenique dans les animaux traités au tétrachlorure de carbone de type sauvage, les hépatocytes transplantés cultivent avec succès et fiabilité des tumeurs orthotopiques du carcinome hépatocellulaire qui expriment l’antigène 40 T du virus simien spécifique à la tumeur. La préparation de notre population viable et pure d’hépatocytes de la masse MTD2 et l’administration précise de l’injection intrasplenique sont importantes pour le succès de la procédure. Bien que notre équipe ait testé l’inoculation d’hépatocyte dans les souris destinataires par injection intravasculaire et intraperitoneal, ces autres méthodes n’ont pas pu induire le carcinome hépatocellulaire orthotopique.
Ce modèle fournit une plate-forme unique permettant l’investigation pour la surveillance immunisée et la tolérance dans ses premiers et les derniers stades de la progression de tumeur. S’il vous plaît être prudent lors de l’utilisation du tétrachlorure de carbone, car il est toxique.
