Un aumento delle recenti epidemie, come il virus Zika e Ebola, ha evidenziato la necessità di una risposta più coordinata e agile su scala globale. A tal fine abbiamo progettato un'unità di laboratorio intramo modale innovativa, scalabile da utilizzare in aree limitate dalle risorse in tutto il mondo durante tali epidemie. Qui presentiamo i nostri laboratori di container di spedizione mobili intra-modali, espandibili.
E nel seguente articolo, presentiamo il nostro approccio BSL-2 e BSL-3 alla diagnosi del virus dell'influenza respiratoria. Diagnostica rapida dei virus influenzali da parte di RCT-PCR. Prima di prepararsi a entrare nell'unità di laboratorio installata, tenere presente che tutti i requisiti di sicurezza BSL-2 devono essere contabilizzati.
Ciò include vestirsi con adeguati dispositivi di protezione individuale, lavarsi le mani, indossare guanti e decontaminare tutti gli spazi di lavoro che si prevede di utilizzare. Si noti che se si utilizza la candeggina per decontaminare lo spazio di lavoro e le forniture, è necessario utilizzare anche il 70% di etanolo per pulire tutte le aree esposte alla candeggina, poiché la candeggina può mescolarsi con altre sostanze chimiche nell'area di lavoro per creare fumi tossici. Smaltire tutti i prodotti di candeggina nel proprio cestino dei rifiuti designato.
Quando i tamponi campione vengono prelevati dai pazienti, vengono trasportati alla struttura di laboratorio dal campo o dalla clinica e passati al tecnico di laboratorio tramite la finestra passante. Questa finestra non può essere aperta da entrambi i lati. Nella finestra passante BSL-2, la superficie esterna dei tubi contenenti campioni deve essere completamente disinfettata con candeggina e lasciata sola per sedersi per due minuti.
Aprire la finestra pass-through e raccogliere i campioni da registrare. Pulire tutti i campioni che hanno resti di candeggina e pulire l'interno della finestra passante con candeggina, seguita da una soluzione di etanolo al 70%. Aggiungere codici a barre a ogni tubo campione e ai quattro tubi vuoti designati per le aliquote.
Spostare i campioni nella cappa di sfiato. Scansiona il codice a barre su ogni tubo e assicurati che le informazioni di identificazione del campione corrette appaia sul sistema basato su tablet o sullo schermo del laptop. Completare il processo di registrazione.
Aliquota campione. Una volta etichettate le provette, utilizzare un armadietto di biosicurezza certificato e decontaminato di classe II per prelevare aliquote di campioni. Quando si assumono aliquote, assicurarsi di utilizzare pipette fresche sterili o monouso per ogni campione e scartarle in contenitori di rifiuti pericolosi per evitare la contaminazione incrociata.
Assicurarsi che ogni tubo sia ben sigillato e chiuso. Utilizzare un'aliquota per campione per l'estrazione immediata. Conservare eventuali altre aliquote nel congelatore per un uso futuro.
Prima di passare alla postazione di lavoro, pulire tutte le superfici e le attrezzature del workspace con candeggina seguita da una soluzione di etanolo al 70%. Una volta che i campioni PCR con codice a barre sono stati aliquotati, spostarli su una workstation designata per l'estrazione. Preparare la miscela di RNA portante AVL tampone per la fase dilisi.
La miscela master del campione e del tampone di lisi deve essere mantenuta a temperatura ambiente. Etichettare un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri. Impostare la punta della pipetta su 560 microlitri.
Applicare una punta di pipetta pulita. Aggiungere un tampone dilisi a ciascun tubo. Scartare la discarica nel contenitore dei rifiuti.
Quindi, prendi l'esempio di aliquota PCR. Posizionarlo nel tubo tampone dilisi preparato designato per uno aliquota e ripeterlo per eventuali campioni aggiuntivi. Scartare la vecchia punta della pipetta e applicare una punta di pipetta pulita.
Applicare una punta di pipetta pulita. Aggiungere 140 microlitri di un tampone al tubo di controllo. Chiudere ogni tubo in modo sicuro.
Vortice di impulsi per 15 secondi. Ripetere con eventuali aliquote o campioni aggiuntivi. Microcentrifugare ogni campione per cinque secondi.
Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo 10 minuti centrifugare brevemente i tubi per rimuovere eventuali gocce dall'interno del coperchio di ogni tubo. Aggiungere 560 microlitri di etanolo a quello campione.
Cambia la punta della pipetta. Ripetere con tutti i campioni rimanenti o aggiuntivi. Chiudere ogni tubo campione in modo sicuro.
Impulso-vortice ogni campione per 15 secondi. Microcentrifugare i campioni per cinque secondi. Ottenere un tubo di raccolta pulito da due millilitri.
Aggiungere le colonne di rotazione. Etichettali in modo che corrispondano ai tuoi campioni. Trasferire 630 microlitri del campione in modo che corrispondano di conseguenza alla colonna.
Assicurati i tappi. Spostati verso la centrifuga. Distribuire uniformemente i campioni nella centrifuga.
Centrifugare a 6000 g per un minuto per rimuovere il tampone dilisi. Tornare alla postazione di lavoro. Sostituire i tubi di raccolta.
Aggiungere il tampone dilisi rimanente e ripetere il passaggio di centrifugazione. Scartare i tubi campione aliquota originali, dopodiversi, smaltire l'eluiato e lavare la colonna di rotazione con il buffer AW1. Ripetere questa procedura con ogni campione o eventuali campioni aggiuntivi.
Fissare i tappi su ogni campione e centrifugare a sei g. Ripetere con il secondo tampone di lavaggio AW2 a 20 g. Infine, posizionare la colonna in un tubo pulito da 1,5 millilitri.
Aprire la colonna e aggiungere 60 microlitri di tampone AVE. Incubare a temperatura ambiente per un minuto e centrifugare a sei g per un minuto. L'esempio è ora pronto per l'analisi PCR.
In condizioni BSL-3 il protocollo sperimentale rimarrà lo stesso, ma le misure di sicurezza prenderanno precedenti sopra ogni altra cosa. Prima di entrare nel laboratorio BSL-3, guardare attraverso la finestra trasparente per assicurarsi che sia stata stabilita una pressione negativa nell'unità del portaoggetti. Sarà evidente che la pressione negativa è stata stabilita quando la palla nel muro è visibile.
Una volta stabilita la pressione negativa aprire la porta ed entrare nell'unità. Lavarsi immediatamente le mani e quindi procedere alla lista di controllo dei DPI. Procedi a indossare il DPI nel seguente ordine: sotto guanti, abito, copriscarpe, maschera, scudo facciale, secondo paio di guanti.
Accendere la macchina e lasciare stabilizzare la pressione nel portaoggetti. Utilizzare una soluzione spray per candeggina per decontaminare tutte le aree e le forniture che si prevede di utilizzare all'interno e all'esterno del portaoggetti. Smaltire eventuali prodotti di scarto di candeggina in un contenitore di sola candeggina.
Utilizzare la soluzione di etanolo al 70% per pulire su tutte le aree in cui è stata utilizzata la candeggina. Trasferisci i tuoi campioni tramite la finestra pass-through. I campioni devono essere stati spruzzati con soluzione di candeggina e lasciati soli per almeno un minuto nel passaggio prima di riceverli all'interno dell'unità BSL-3.
Quindi, ricevere i campioni all'interno dell'unità BSL-3 e pulirli accuratamente prima di procedere alla fase di registrazione ed etichettatura. Una volta registrati i campioni e etichettati i tubi, posizionare i campioni nel portaoggetti tramite il vassoio della camera di compensazione. Non aprire entrambe le porte contemporaneamente.
Aprire e chiudere ogni porta in due passaggi diversi per precauzioni di sicurezza. Una volta che i campioni sono stati spostati in modo sicuro all'interno del portaoggetti, seguire gli stessi passaggi descritti in precedenza per la creazione di aliquote campione nel vano portaoggetti. Una volta che i campioni sono stati aliquoti spostare i campioni nel contenitore ermetico.
Spruzzare la soluzione di candeggina all'interno del portaoggetti per decontaminare i tubi e tutte le altre superfici. Attendere cinque minuti e quindi applicare la soluzione di etanolo al 70% per lavare la candeggina. Dopo un'accurata decontaminazione spostare solo i campioni necessari per l'analisi PCR per lalisi tornare indietro nel portaoggetti.
Nel portaoggetti eseguire solo la fase dilisi della procedura di estrazione. Una volta che le cellule sono state lisciviate, sigillare saldamente i tappi su ciascun campione e posizionarli nel passaggio della camera d'aria pressurizzata. Decontaminare nuovamente il portaoggetti con candeggina seguita da una soluzione di etanolo al 70%.
Spostare i campioni fuori dal portaoggetti e trasferirli sulla workstation per i passaggi rimanenti della procedura di estrazione. Dopo l'estrazione trasferire i campioni alla finestra pass-through per l'analisi PCR. Dopo che i campioni sono stati rimossi e trasferiti, decontaminare lo spazio di lavoro di laboratorio all'esterno del portaoggetti.
Prima di rimuovere i DPI, attendere che la circolazione dell'aria nell'unità abbia raggiunto in modo sicuro un numero adeguato di cicli di filtraggio prima di iniziare a rimuovere i DPI. Immediatamente dopo aver rimosso e smaltito tutti i DPI nel contenitore dei rifiuti DPI, procedere a lavarsi le mani nel lavandino del laboratorio con acqua e sapone prima di uscire dall'unità. Amplificazione e rilevamento PCR.
Rimuovere i campioni di RNA estratti dalla finestra passante. Preparare un mix master in un tubo da 1,5 millilitri con i seguenti componenti per ogni saggio mirato: acqua, primer e sonde, miscela di attacco e tampone 2X. Vortice e girare il mix principale, dopo di che, aliquotare il mix master in ciascuno dei tubi di striscia.
Riportare il kit PCR in deposito alle temperature consigliate una volta preparato il master mix. Aggiungere i campioni a ciascuno dei tubi del nastro utilizzando una punta separata tra ciascun tubo di striscia. Ruotare i campioni a 1.500 giri/min per un minuto, dopo di che i campioni sono pronti per essere caricati sull'unità PCR in tempo reale.
Una volta caricati i campioni sullo strumento PCR, ci vogliono circa 90 minuti per completare una corsa. Il test PCR in tempo reale è un metodo sensibile per il rilevamento robusto del virus. Questo può essere visto nella tabella con l'etichetta:Risultati analizzati PCR.
Prima di raccogliere i risultati e lasciare il laboratorio, rimuovere i DPI e decontaminare adeguatamente ogni postazione di lavoro in preparazione del prossimo test diagnostico. Risultati rappresentativi. Il flusso di lavoro di laboratorio è rappresentato nel diagramma che enfatizza la protezione personale.
Il rapido test diagnostico dell'influenza viene effettuato tramite l'analisi RT-PCR. La procedura è costituita da quattro passaggi principali e le singole aree di lavoro vengono assegnate per ogni fase del protocollo. L'obiettivo di questo progetto è convalidare una nuova struttura modulare di laboratorio rapidamente dispiegabile e lo abbiamo fatto con successo, nonché sviluppare programmi di formazione per il personale di laboratorio che lavora in ambienti a basse risorse durante epidemie ed epidemie.
