Die Verwendung dieses Protokolls zur Entfernung der Variation zwischen Proben kann Einblicke in die differenzielle Regulation von Makromolekülen bieten, die auf den Intra-Sample-Abweichungen zwischen mRNA und Proteinspiegel basieren. Die Verwendung derselben Probe zur Isolierung von DNA, RNA und Protein ist ein Versuch, die Variabilität zu reduzieren, die Reproduzierbarkeit zu verbessern und die Interpretation zu erleichtern. Zu den Vorteilen gehören Zeit- und Ressourcenersparnis bei der Probenentnahme und eine Querschnittsanalyse wertvoller und begrenzter Proben.
Zunächst samen 1 000 Wurmeier in einer 10-Zentimeter-Platte mit entsprechenden Wachstumsbedingungen. 72 Stunden lang bei 20 Grad Celsius inkubieren. Dann waschen Sie die Platte mit 5 Milliliter M9 Puffer und übertragen 1.000 erwachsene Würmer in ein Rohr.
Zentrifugieren Sie die Würmer für eine Minute bei 1.000 g, entsorgen Sie den Überstand und übertragen Sie die pelletierten Würmer mit einem Milliliter M9-Puffer in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr. Zentrifugieren Sie wieder bei 845 g für eine Minute und entsorgen Sie den größten Teil des Überstandes. Bewahren Sie die Pelletwürmer bei minus 80 Grad Celsius länger als vier Stunden auf.
Als nächstes entfernen Sie alle Überstand eisern aus dem aufgetauten Pellet. Fügen Sie einen Milliliter kaltes GTCP-Reagenz hinzu, mischen Sie sie gut, indem Sie nach oben und unten pfeifen und legen Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis. Dann 200 Mikroliter kaltes Chloroform hinzufügen.
Schütteln Sie das Rohr 15 Sekunden lang kräftig und lassen Sie es bei Raumtemperatur für drei Minuten. Als nächstes zentrifugieren Sie das Rohr bei 13, 500 g bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Mit einer Mikropipette die klare Deckschicht in ein neues RNase-freies 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr übertragen.
Übertragen Sie die trübe weiße Interphasenschicht in ein neues Rohr mit der Bezeichnung B2 und übertragen Sie die rosa Schicht vom restlichen Pellet in ein neues Rohr mit der Bezeichnung B und legen Sie beide auf Eis. Eine einfache Trennung der drei Schichten kann schwierig sein. Ich empfehle, die trübe Interphasenschicht in die eigene Röhre zu übertragen, anstatt die DNA aus dieser Schicht aus der organischen oder rosa Schicht zu fällen.
Um RNA zu isolieren, fügen Sie zunächst 500 Mikroliter 100%isopropanol zu Tube A hinzu, um die RNA auszufällen. Dann inkubieren Sie die Röhre bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Nach der Inkubation zentrieren Sie das Rohr bei 13, 500 g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Als nächstes entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie einen Milliliter 75% Ethanol in Tube A hinzu, um das Pellet zu waschen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 5, 300 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Den Überstand entsorgen und die Pelletluft fünf bis zehn Minuten trocknen lassen.
Fügen Sie 50 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu, um das Pellet der RNA zu rekonstituieren und das Pellet bei 55 bis 60 Grad Celsius für 10 Minuten zu inkubieren, um es aufzulösen. Schließlich verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Konzentration der isolierten RNA bei 260 Nanometern zu messen und Verunreinigungen bei 230 und 280 Nanometern zu identifizieren. Um die DNA zu isolieren, fügen Sie zunächst 300 Mikroliter 100% Ethanol in die organische Phase in Tube B und in die trübe weiße Schicht in Tube B2, um die DNA auszufällen, durch Inversion zu mischen und die Rohre bei Raumtemperatur für zwei bis drei Minuten zu lassen.
Dann zentrifugieren die Röhren B und B2 bei 376 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten, um DNA zu pellet. Kombinieren Sie den Überstand aus den Röhrchen B und B2 in einer neuen Zwei-Milliliter-Röhre mit der Bezeichnung C und lassen Sie ihn zur anschließenden Proteinisolierung auf Eis. Als nächstes waschen Sie das DNA-Pellet in Tube B2 mit einem Milliliter 0,1 Molaren-Natriumcitrat in 10% Ethanol für 30 Minuten.
Zentrifugenrohr B2 bei 376 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Wiederholen Sie den Waschschritt und setzen Sie das Pellet dann in 1,5 Milliliter 75% Ethanol wieder auf und lassen Sie es 20 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend Zentrifugenrohr B2 bei 376 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten und dann den Überstand entsorgen und das Pellet für fünf bis zehn Minuten trocknen lassen.
Lösen Sie das Pellet in 150 Mikroliter mit acht Milliliter Natriumhydroxid. Dann zentrifugieren Sie die Probe bei 376 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Schließlich übertragen Sie mit einer Mikropipette den Überstand, der die DNA enthält, in eine neue Röhre.
Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Konzentration der isolierten DNA bei 260 Nanometern zu messen und Verunreinigungen bei 230 und 280 Nanometern zu identifizieren. Um das Protein auszufällen, addieren Sie zunächst bis zu 1,5 Milliliter 100%Isopropanol zum rosa Überstand in Tube C, mischen Sie durch Mehrmalsinvertieren, und inkubieren Bei der Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann Zentrifugenrohr C bei 13, 500 g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit zwei Millilitern 0,3 Molguanidinhydrochlorid in 95% Ethanol für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie das Rohr fünf Minuten lang bei 5, 300 g bei vier Grad Celsius wieder und wiederholen Sie den Waschschritt wie bisher. Übertragen Sie das Proteinpellet in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr mit der Bezeichnung C2 und addieren Sie bis zu 1,5 Milliliter 95% Ethanol, Wirbel, und lassen Sie es bei Raumtemperatur für 20 Minuten sitzen.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 5, 300 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und lassen Sie das Pellet bei Raumtemperatur 10 Minuten trocknen. Dann lösen Sie das Pellet in 300 Mikroliter 5%SDS bei 50 Grad Celsius für 60 Minuten auf.
Schließlich zentrifugieren Sie das Rohr bei 13, 500 g bei 17 Grad Celsius für 10 Minuten. Und übertragen Sie den Überstand, der das Protein enthält, in eine neue Röhre. So führen Sie eine quantitative Reverse-Transkriptions-PCR durch.
Verwenden Sie zunächst ein Nanogramm der isolierten RNA, um cDNA durch umgekehrte Transkription vorzubereiten. Um eine Lagerplatte aus cDNA herzustellen, fügen Sie 100 Mikroliter von einer bis 100 Verdünnung jeder cDNA-Probe zu einzelnen Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu, enthalten geeignete Kontrollen, wie wasserfreie Brunnen und seriell verdünnte Proben, um die Primer-Effizienz für jedes Gen zu ermitteln. Um eine Master-Mischung für jeden Satz von Primern zu machen, addieren Sie bis zu sieben Mikroliter Wasser, einen DNA-interkalierenden Zyanidfarbstoff und fünf Mikro-Molar von Vorwärts- und Reverse-Primern.
Fügen Sie sieben Mikroliter der Master-Mischung in die entsprechenden Bohrungen einer RT-qPCR-Platte. Fügen Sie dann drei Mikroliter der cDNA von der Lagerplatte hinzu und führen Sie die Platte mit einem RT-qPCR-Protokoll, das für die verwendeten Primer geeignet ist. RT-qPCR-Analyse von isolierten mRNAs aus vier unabhängigen Proben von drei Wurmstämmen wurde durchgeführt, um die durch RNA-Seq-Assay identifizierten Ziele zu bestätigen.
Das F07C4.12-Gen wurde in beiden Assays bei esat-2-Würmern hochreguliert, aber seine Upregulation bei rsks-1-Würmern wurde durch RT-qPCR-Assay nicht nachgewiesen. Auch RNA seq erkannte Expressionsänderungen von mrp-1 in esat-2- und rsks-1-Würmern wurden über RT-qPCR bestätigt.
Der Vergleich von GTCp mit RIPA-extrahiertem Protein in Würmern, die durch SDS-Seite getrennt und mit Coomassieblau gefärbt wurden, zeigte eine ähnliche Qualität mit einer besseren Auflösung größerer Proteine für GTCp-extrahierte Proteine. Die Western-Blot-Analyse zeigte in den meisten Fällen ähnliche Proteinwerte; die Proteine, die größer als 75 Kilodalton waren, zeigten jedoch niedrigere Werte im RIPA-extrahierten Protein. Der Vergleich zwischen Targets mRNA und Proteinspiegel aus vier Einzelproben von drei Wurmstämmen zeigte eine geringe Variabilität der mRNA-Spiegel mit größerer Variabilität auf Proteinebene.
Im Zusammenhang mit der DNA-Isolation ist der Ertrag in hohem Maße von der Fähigkeit abhängig, die trübe Interphasenschicht von der organischen oder rosafarbenen Schicht zu erholen. Um die Löslichkeit von Proteinen aus dem Pellet zu verbessern, kann es notwendig sein, das Volumen des Relubilisierungspuffers zu erhöhen oder neben SDS auch andere Reinigungsmittel hinzuzufügen. Die Verwendung dieser Methode kann helfen, Fälle richtig zu identifizieren, in denen die Übersetzung von mRNA in Protein nicht korelativ ist und zu einer tieferen Untersuchung posttranskriptiver und posttranslationaler Regulierungsmechanismen unter verschiedenen Bedingungen führen kann.
In unserem Labor wurde dieses Protokoll verwendet, um wertvolle und zeitlich begrenzte Kernproben zu sparen. Darüber hinaus kann ich mir vorstellen, dass dies ein nützliches Protokoll wäre, um es im zirkadianen Rhythmusfeld zu übernehmen. Das GCTP-Reagenz und lösungsmittel, die in der RNA-Isolierung verwendet werden, sind Gefahren und sollten mit Vorsicht verwendet werden.
