Pseudomonas aeruginosa è un agente patogeno di livello BSL-2. Ricordarsi di seguire tutte le pratiche di sicurezza di livello BSL-2 durante la manipolazione di questo organismo. Qui dimostreremo l'isolamento delle cellule primarie, la fagocitosi in vitro e l'analisi delle vie fagocitiche, la fagocitosi in vivo e la valutazione della clearance batterica nei topi.
Una consegna intratracheale riuscita richiede pratica da padroneggiare. Assicurarsi che il microsprayer sia caricato correttamente, che l'ago sia tra le due pieghe vocali e che la velocità dello stantuffo sia adeguatamente controllata. Iniziare fissando il mouse in posizione supina con gli arti sparsi su un pannello di dissezione coperto da tovaglioli di carta e agganciando una corda sotto i denti anteriori per ritrarre la testa in modo che la trachea sia posizionata dritta e livellata.
Disinfettare il mouse con il 70% di etanolo e utilizzare forcep regolari per estrarre la pelle sulla linea centrale del corpo. Usa le forbici chirurgiche per tagliare la pelle dall'addome alla parte superiore della gola. Utilizzare l'estremità smussata delle forbici chirurgiche standard per sezionare attentamente il muscolo della gola e i tessuti connettivi.
Aprire la parete addominale sotto la gabbia toracica. Tagliare il diaframma e tagliare la parte inferiore della gabbia toracica per esporre parzialmente i polmoni. Usa le forbici a molla per esporre la trachea e usa le forcep per afferrare un anello di cartilagine.
Utilizzare micro forbici per fare con cura un'incisione di circa 1,5 millimetri sulla faccia ventrale della trachea. Infilare con cura una breve lunghezza di filo di sutura sotto la trachea e inserire una cannula calibro 18 nella trachea. Quando la cannula è in posizione, lavare delicatamente il polmone tre volte con un millilitro di PBS fresco per lavaggio, ritirando delicatamente il fluido nella siringa prima di reinfonderlo nel polmone per tre volte in successione.
Dopo ogni lavanda, trasferire il liquido di lavanda broncoalveolare raccolto o BALF in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione del fluido raccolto totale. Rimescolare il pellet in un millilitro di PBS fresco per una seconda centrifugazione e rimescolare i macrofagi alveolari lavati in due millilitri del Modified Eagles Medium o DMEM di Dulbecco integrati con siero bovino fetale non inattivato termicamente al 10%. Quindi trasferire i macrofagi alveolari primari in una piastra di Petri con fondo di vetro per la loro coltura di due giorni a 37 gradi Celsius in un incubatore di cellule.
Dopo 48 ore, lavare la coltura con un millilitro di PBS prima di nutrire la coltura con due millilitri di mezzo fresco. Quindi, aggiungere 50 perline coniugate in lattice carbossilato di due micrometri di diametro per cellula alla coltura per un'incubazione di un'ora a 37 gradi Celsius in un incubatore di cellule. Alla fine dell'incubazione, lavare la piastra ampiamente cinque volte con un millilitro di PBS fresco per lavaggio per rimuovere le perline extracellulari e immagini casualmente 100 cellule per contare le cellule contenenti perline intracellulari.
Per un test di opsonizzazione, incubare due volte 10 all'ottavo globulo rosso delle pecore o SRBC con 50 microlitri di immunoglobulina M o IgM anti-SRBC di coniglio per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi incubare gli SRBC opsonizzati con 50 microlitri di siero umano carente di C5 per 30 minuti a 37 gradi Celsius per fissare i frammenti del complemento dell'inibitore C3b e C3b sugli SRBC rivestiti in IgM. Successivamente, aspirare i supporti e aggiungere 100 microlitri di uno per 10 ai sette SRBC opsonizzati per millilitro di mezzo per ogni pozzo di una piastra da 96 pozzetti contenente uno per 10 al quarto macrofagi murini coltivati durante la notte per pozzo.
Incubare la cocoltura di macrofagi del topo SRBC per un'ora a 37 gradi Celsius e quindi rimuovere gli SBC non vincolati lavandosi con 100 microlitri di tampone di lisi del cloruro di ammonio di potassio per un minuto. Dopo aver rimosso gli SRBC non vincolati, sciacquare con 100 microlitri di supporti. Lisciviare le cellule rimanenti con solfato di dodecil di sodio allo 0,1% e trattare i lisati con 50 microlitri di 2, 7-diaminofluorene integrati con perossido di idrogeno al 3% e sei urea molare.
Quindi misurare l'assorbanza della formazione di blu fluorene catalizzato da emoglobina su uno spettrofotometro a 620 nanometri. Utilizzare una curva standard a valori di assorbanza di 620 nanometri con un numero noto di SRBC per determinare il numero di SRBC opsonizzati che sono fagocitizzati. Per valutare la fagocitosi mediata dal recettore del riconoscimento del modello, lavare macrofagi alveolari alveolari primari di topo coltivati di due giorni con un millilitro di PBS e trattare le cellule con 500 microlitri di mezzo fresco contenenti 100 fluoro-488 Zymosan-A coniugate.
Dopo un'ora a 37 gradi Celsius, arrestare la fagocitosi con 500 microlitri di PBS ghiacciato e lavare le cellule ampiamente cinque volte con un millilitro di PBS per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente e lavare le cellule altre cinque volte come dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, coprire le cellule con 500 microlitri di PBS fresco per l'imaging sotto contrasto di interferenza differenziale e canale fluorescente a 488 nanometri per quantificare il numero di macrofagi alveolari contenenti Zymosan-A-bioparticella.
Per la valutazione della fagocitosi macrofagia alveolare in vivo, confermare il livello appropriato di sedazione per mancanza di risposta al dito del piedi in un topo anestetizzato e posizionare il mouse su una tavola piatta con un filo di plastica sotto gli incisivi superiori. Posizionare il mouse in un rostro semi-reclinato in posizione di 45 gradi con la superficie ventrale rivolta verso l'alto e utilizzare forcep curvi per estrarre e sopprimere la lingua. Quindi inserire un microsprayer tra le pieghe vocali per somministrare in modo intratracheale 50 microlitri di cinque volte 10 alle sei unità di formazione della colonia di P.aeruginosa GFP nei polmoni dell'animale anestetizzato.
Per confermare che l'ago del microsprayer è nella trachea, spostare delicatamente la siringa e osservare le pieghe vocali su entrambi i lati dell'ago. Un'ora dopo l'infezione, raccogliere il liquido di lavanda come appena dimostrato e pelletare i macrofagi alveolari per centrifugazione. Resuspend uno per 10 alla terza cellule in 100 microlitri di PBS fresco per il citocentrifugo su uno scivolo di vetro.
Quindi macchiare in modo differenziato le diapositive citospunte per macrofagi alveolari, neutrofili e linfociti, secondo i protocolli istochimici standard. Selezionare casualmente 100 macrofagi alveolari per quantificare la percentuale di cellule che hanno fagocitostosto i batteri. Nel primo studio di clearance dei batteri in vivo, iniettare per via intratracheale una dose subletale di circa 2,5-5 volte 10 la quinta unità di formazione della colonia per millilitro di P.aeruginosa in tipo selvatico anestetizzato e topi mutanti e misurare il peso corporeo di ogni animale ogni giorno per sei giorni.
Nel secondo studio, iniettare un nuovo set di topi selvatici e mutanti con un letale tre volte 10 alle sette unità di formazione della colonia per dose millilitro di P.aeruginosa e registrare la mortalità entro due giorni da un'iniezione, raccogliendo l'intero tessuto polmonare al momento della morte o due giorni dopo l'iniezione per quantificazione del carico batterico polmonare al picco dell'infezione. Dopo aver raccolto i polmoni, tagliare i campioni polmonari in piccoli pezzi sul ghiaccio e omogeneizzare i frammenti polmonari utilizzando un'impostazione di omogeneizzatore elettrico regolata. Quindi placcare 100 microlitri di omogeneizzato su piastre di agar di isolamento Pseudomonas in diluizioni seriali 10 volte.
La microscopia a fluorescenza rivela che la fagocitosi del macrofago alveolare primario del topo delle perline di lattice FITC si verifica dopo un'ora di incubazione, con macrofagi knockout TRIM72 che dimostrano una capacità fagocitica significativamente più elevata. Al contrario, la sovraespressione di TRIM72, una proteina con funzione sconosciuta nelle cellule murine del macrofago, si traduce in una diminuzione di oltre cinque volte della fagocitosi del complemento. Le particelle Zymosan-A coniugate di Alexa fluor-488, tuttavia, sono ingerite in quantità uguale da macrofagi alveolari primari isolati da topi selvatici o knockout.
La colorazione differenziale del BALF raccolto da animali selvatici e knockout rivela un numero simile di macrofagi ma una maggiore capacità fagocitica per i macrofagi raccolti da topi knockout. Inoltre, i topi knockout TRIM72 dimostrano un recupero più rapido del loro peso corporeo, mantengono la loro sopravvivenza e mostrano un carico batterico inferiore rispetto agli animali di tipo selvatico dopo la somministrazione intratracheale di P.aeruginosa. Utilizzando questa tecnica, possono essere analizzati altri processi fagocitici che sono importanti per la polmonite come la fagocitosi neutrofila e il contributo relativo di altri fagociti nella clearance batterica.
In combinazione con inibitori farmacologici, trasferimento adattivo e animali transgenici, questa tecnica può aiutare i ricercatori a esplorare la componente molecolare di un tipo specifico di fagocitosi per i fagociti di interesse.
