This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la legge sul benessere degli animali e la politica US Public Health Service su Humane cura e l&#39;uso di animali da laboratorio dopo la revisione dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del NIEHS. 1. Preparazione di K. Cultura pneumoniae Attenzione: eseguire tutti i passaggi del 2 (BSL2) cappuccio o altra area designata BSL2 livello di biosicurezza e gettare i rifiuti secondo le linee guida BSL2 istituto. <ol><li> Per la crescita sospensione K. pneumoniae, scongelare uno stock di glicerolo di batteri e inoculare una cultura del lavoro trasferendo 1 ml di K. pneumoniae stock da 50 ml di brodo di soia trittico (TSB) in un pallone da 500 ml o più grande. </li><li> Fare scorte glicerolo con l&#39;aggiunta di 900 ml di coltura log-fase di K. pneumoniae a 100 ml di glicerolo sterile e congelamento a -20 ° C o -80 ° C. Per la conservazione a lungo termine, si raccomanda -80 ° C. </li><li> Coltura dei batteri da stEP 1.1 agitando matraccio overnight (14 - 18 hr) a 37 ° C a 200-225 rpm.In per promuovere la crescita di fase log, diluire 1-5 ml di questa coltura durante la notte in un pallone contenente 50 ml TSB la mattina e mettere di nuovo a 37 ° C con agitazione per ~ 2,5 ore. </li><li> Trasferire 1 ml di K. cultura pneumoniae dal l&#39;ultimo passo in una provetta da 1,5 ml e far girare a 7.500 xg per 2 minuti. Un pellet bianco dovrebbe essere visibile. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet, risospendere delicatamente i batteri con la pipetta in 1 ml di soluzione fisiologica sterile, e far girare di nuovo a 7.500 xg per 2 minuti. <ol><li> Eseguire questo passaggio di lavaggio 2x, fanalino di finale, pellet lavato in 1 ml di soluzione fisiologica sterile. </li></ol></li><li> Eseguire diluizioni seriali di log-saggio di questo inoculo pulito. Ad esempio, aggiungere 400 ml di inoculo in 3,6 ml di soluzione salina sterile serialmente per effettuare una serie di 10 -1 -10 -9 diluizione. </li><li> Determinare la OD 600 di lavato K. pneumoniae ponendo 1 ml di1:10 e 1: 100 diluizioni in cuvette usa e getta e la misurazione del diametro esterno 600, tranciatura prima con soluzione salina sterile. Misurare i duplicati per garantire l&#39;accuratezza. Un OD 600 di 1,0 equivale all&#39;incirca a 4-7 x 10 8 UFC / ml. Si noti che il rapporto tra OD e CFU / ml non può essere lineare. <ol><li> Utilizzare la OD 600 dalle diluizioni per calcolare la concentrazione di K. pneumoniae, applicando la OD: conversione CFU / ml sopra, e factoring nella diluizione. </li></ol></li><li> Utilizzare il K. concentrazione pneumoniae per preparare la dose di inoculo CFU desiderato in &lt;volume di 100 microlitri per la consegna per topi (vedere sotto). </li><li> Piatto anche 100 ml di 10 -6 -10 -9 diluizioni e 100 ml di soluzione fisiologica sterile su piastre di agar singoli trittico di soia (TSA) a temperatura ambiente. Incubare a 37 ° C per una notte e contare le colonie batteriche per calcolare la concentrazione esatta che è stato utilizzato in esperimenti e controllare la contaminazione. NOTA: la concentrazione batterica effettivo di inoculo finale può essere ± 500 UFC / ml quella prevista dalla assorbanza. Gli sperimentatori dovrebbero idealmente confermare l&#39;OD 600: CFU / ml rapporto in studi pilota preliminari da utilizzare in vivo nel topo, empiricamente riaggiustare la OD 600: UFC / ml di conversione in base alla loro esperienza personale. </li></ol> 2. murino intratracheale (IT) L&#39;aspirazione di K. pneumoniae da Orofaringe <ol><li> Assicurarsi che i topi sono identificati univocamente da Mark coda, tatuaggio, o altro identificativo approvato. </li><li> Elaborare dosaggio inoculo di batteri utilizzando P200 pipetta prima di rimuovere i topi da isoflurano al fine di accelerare procedimento. Per ottenere i migliori risultati con esso aspirazione, utilizzare un volume di &lt;100 microlitri per evitare overflow. Qui, usare 2000 UFC / 50 ml di K. pneumoniae. </li><li> Anestetizzare topi in modo chiaro da camera con gas isoflurano (ad esempio, 2% isoflurano a portata di 1 l / min) o secondo institlinee guida utional. Il numero di topi per anestetizzare insieme è determinata dal livello di comfort dello sperimentatore, tipicamente 1-2 alla volta. Osservare la respirazione e confermare il livello di anestesia volta respiri profondi sono visibili e 2-3 secondi possono essere contati tra i respiri. NOTA: Se c&#39;è preoccupazione sui possibili effetti confondenti di anestetici volatili (per via inalatoria), l&#39;anestesia può essere raggiunto invece con iniezione intraperitoneale di ketamina / xylazina. Con il metodo sopra descritto, l&#39;anestesia profonda dura pochi minuti. Se più anestesia prolungata è indotta, pomata oculare dovrebbe essere usato per prevenire l&#39;essiccamento oculare. </li><li> Una volta che il mouse è anestetizzato, posizionarlo in posizione supina semiseduta, sospesa dalle incisivi mascellari da un elastico teso tra pioli su una scheda di plexiglas inclinato (Figura 1). </li><li> Tirare delicatamente la lingua del mouse al lato con un paio di pinze non ridged contundenti e la dose di deposito nella cavità orale con un pipett P200e. Esercitare la massima cura per evitare di indurre traumi sia alla lingua o dell&#39;orofaringe. </li><li> Pur mantenendo la lingua retratta, occludere delicatamente il naso con un dito guantato fino il mouse inala. Continuare a coprire il naso finché il mouse non ha preso due o più inalazioni, e nessun liquido è visibile nella cavità orale. Coprendo il naso aiuta a garantire che il mouse si inalano i batteri nei polmoni, come i topi sono sfiati naso obbligati. </li><li> Rimuovere il mouse dalla scheda di inoculazione e tornare alla sua gabbia, posizionando il mouse sulla sua schiena per evitare lenzuola o detriti bloccando le narici mentre il mouse si sta riprendendo dall&#39;anestesia. </li><li> Una volta che tutti i topi sono stati dosati e hanno risvegliato dall&#39;anestesia, topi casa in una cabina / camera che contengono solo i topi che sono stati dosati con K. pneumoniae. Monitorare i topi al giorno, compresi i pesi corporei se andare al di là di post-infezione 48 ore. </li><li> Utilizzare poltiglia giornaliero e / o di calore supplementare se consentire i topi di andare oltre 48hr. </li></ol> 3. lavaggio broncoalveolare Fluid (BAL) raccolta e analisi <ol><li> Euthanize topi secondo le linee guida istituzionali. Qui, utilizzare un&#39;iniezione letale di 150 mg / kg pentobarbital sodio o dose equivalente di soluzione dell&#39;eutanasia commerciale seguita da dissanguamento, come questo evita possibili complicazioni ai polmoni associata con CO 2 inalazione e dislocazione cervicale. </li><li> del mouse Posizione sulla schiena e sterilizzare il mouse spruzzando pelliccia con il 70% di etanolo in particolare sulla zona del torace e del collo. </li><li> Fare un taglio longitudinale appena sotto lo sterno, quindi si tiene lo sterno con una pinza, Nick il diaframma, permettendo al polmone a ripiegare nella cavità toracica. Tagliare attraverso la cavità toracica su entrambi i lati del sistema vascolare e poi attraverso il collo, esponendo la trachea. </li><li> Poiché la trachea è circondato da muscoli longitudinali su entrambi i lati, accuratamente tagliato nel mezzo e spingere il tessuto ai lati, comequesto evita il taglio della vascolarizzazione circostante, che potrebbe introdurre il sangue nella trachea. Se il sistema vascolare è scalfito, pulire l&#39;area circostante con una garza prima di accedere il lume tracheale. </li><li> Usare le forbici chirurgiche o un ago per nick trachea circa ¼ fino in fondo dalla testa e inserire una cannula collegata ad una siringa da 1 ml precaricato con 1 ml di 1x PBS (PBS) caudalmente nella trachea. Se si utilizzano topi &lt;8 settimane di età o di sesso femminile, ridurre il volume lavaging di 600-800 ml. </li><li> Inserire il volume nei polmoni lentamente, permettendo a tutti i lobi di gonfiarsi e poi tirare il volume sul retro con la siringa, ripetendo 3x. Se PBS fuoriesce narici cannula non è stato spinto abbastanza lontano in trachea o inflazione verificano troppo rapidamente. In alternativa, se i polmoni non sono gonfiando bene, la cannula è stato spinto in troppo, quindi ritirare leggermente. </li><li> Raccogliere lava pool in un tubo da 15 ml su ghiaccio. </li><li> rotazioneil fluido di lavaggio dello spazio aereo a 1200 xg per 5 min, raccogliere il supernatante in una provetta da 1,5 ml e congelare a -80 ° C. Successivamente, utilizzare il surnatante (cioè, BALF) per la misurazione di proteine, citochine, e per vari altri saggi biochimici. Il pellet rappresenta le cellule dallo spazio broncoalveolare. </li><li> Se i globuli rossi (RBC) sono evidenti nel pellet di cellule in base al colore, lisare con 1 ml di tampone di lisi ACK per 1 min seguita da aggiunta di 5 ml di PBS 1x per arrestare la reazione di lisi e diluire il buffer. Trattare tutti i campioni in modo identico, sia trattato o meno con tampone di lisi ACK. </li><li> celle Spin a 1.200 xg per 5 minuti, decantare il surnatante, e portare le cellule in 1 ml di PBS 1x. </li><li> cellule Vortex e contare su un emocitometro per il conteggio delle cellule totali di spazio aereo. </li><li> Sulla base di densità delle cellule aggiungere circa 80-150 ml (~ 80 ml per un mouse infetto e ~ 150 per un mouse ingenuo) per una camera di scorrimento su una centrifuga cytospin. cell Spins su vetrini da microscopio per la successiva colorazione per determinare le popolazioni differenziali delle cellule. </li><li> Consentono alle cellule per asciugare su vetrini durante la notte. Cellule macchia con tri-macchia (ad esempio, Hema 3 [vedi tabella]) immergendo le diapositive 7 volte in fissativo, 9 volte in macchia 1, e 7 volte in macchia 2 (senza risciacqui tra macchie), e lasciare asciugare. Dopo macchia si è asciugata, scivoli coprioggetto e manualmente contano differenziali di microscopio. In generale, neutrofili e monociti / macrofagi sono facilmente distinguibili per le loro dimensioni e la morfologia nucleare. </li></ol> 4. Determinazione della carica batterica nel polmone e periferiche tessuti <ol><li> Prima di iniziare: Preparare le provette di diluizione con 900 ml di PBS 1x per polmone e della milza e 90 ml di PBS 1x per il sangue. targhette di identificazione per la coltura di batteri e fissati a temperatura ambiente; di conseguenza, il tempo una volta che il tessuto è stato raccolto sarà ridotto al minimo tra omogeneizzazione e placcatura per la crescita batterica. Nota: A causa della Deposi eterogeneazione di batteri nei polmoni che possono verificarsi con l&#39;aspirazione, si raccomanda che i singoli topi utilizzati per l&#39;analisi di una cellularità vie aeree totale o totale carica batterica (bilaterale) polmone. </li><li> Euthanize il mouse come per passo 3.1 e successivamente raccogliere il sangue dal ventricolo sinistro, mettendo in una provetta eparinizzata per evitare la coagulazione. Rimuovere tutti i lobi polmonari e posto in una provetta da 15 ml contenente 5 ml di PBS 1x, seguita dalla rimozione della milza e il posizionamento in 2 ml di PBS 1x. Mettere i tubi in ghiaccio. Fare attenzione a pulire gli strumenti con etanolo tra ciascun tessuto / mouse. </li><li> Omogeneizzare il tessuto sul ghiaccio, preferibilmente con omogeneizzatori usa e getta che possono essere modificate tra ogni campione. punte omogeneizzatore monouso possono essere sterilizzati in autoclave per il riutilizzo tra esperimenti. </li><li> Una volta che il tessuto è stato omogeneizzato, eseguire diluizioni seriali e piatto. campioni piastra di un tessuto data / diluizione in duplice copia su un&#39;unica piastra TSA tracciando una linea di demarcazione sulla plastica. Placcatura e disuggerimenti Lution sono riportati di seguito (in tutti i casi, 10 ml di campione si sviluppa sulla piastra) e si basano su un post-infezione necroscopia 24 hr. Se l&#39;analisi dei campioni 48-72 hr, un maggior numero di diluizioni può avere bisogno di essere placcato a causa di aumento della carica batterica in momenti successivi. <ol><li> Per Sangue - diluire 1:10 aggiungendo 10 ml di sangue in 90 ml di sterile PBS 1x. Piatto pulito e 1:10 campioni diluiti in duplicato. Una volta che il sangue è stato placcato, girare sangue residuo a 9.300 xg per 10 min per estrarre plasma per la misurazione delle citochine e chemochine. </li><li> Per Lung - diluire 1:10 - 1: 100 aggiungendo 100 ml di polmone omogeneizzato in 900 ml di sterile PBS 1x serialmente. Piastra omogeneizzato pulito e tutte le diluizioni in duplicato. </li><li> Per Milza - diluire 1: 10-1: 100 con l&#39;aggiunta di 100 ml di milza omogeneizzato in 900 ml di sterile PBS 1x seriale. Piastra omogeneizzato pulito e ambedue le diluizioni in duplicato. </li></ol></li><li> Lasciare che i campioni diffusione ad asciugare brevemente. </li&gt; <li> Capovolgere le piastre TSA e posto in una statica a 37 ° C incubatore per una notte. </li><li> Determinare il numero di batteri colonizzano mediando le colonie batteriche da entrambi i lati della piastra e da ciascuna diluizione. Fattore nelle diluizioni iniziali di 5 ml per polmone e 2 ml per milza per determinare CFU tessuto totali. </li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Modelli murini di polmonite batterica, collaborato con gene targeting e negli interventi biologiche e farmacologiche in vivo, hanno fornito spunti critici nella risposta difesa ospite polmonare. Grandi progressi sono stati fatti, in particolare, nella nostra comprensione delle chemochine e molecole di adesione che regolano il reclutamento dei neutrofili allo spazio aereo infetto 10,11. Modelli in vivo di polmonite, a differenza di approcci basati su celle o alternativi, hanno anche ...

Polmonite acquisita in comunità rimane la principale causa di morte per infezioni negli Stati Uniti, con poca variazione complessiva dei tassi di mortalità nel corso degli ultimi 40 anni, nonostante i miglioramenti nella vaccinazione e le strategie di antibiotici 1,2. Nonostante la mancanza di progressi sensibili a livello della salute pubblica, in anni recenti progressi drammatici sono stati fatti nella comprensione della patogenesi molecolare e cellulare di polmonite, con molti di questi passi avanti reso possibile dall&#39;utilizzo di modelli murini di infezione polmonare. La trattabilità genetica del topo, la somiglianza del murino e sistema immunitario umano, e la vasta gamma di reagenti immunologici murini mirati che si sono resi disponibili in commercio hanno facilitato insieme rapido progresso del campo. modelli murini di polmonite batterica descritti in letteratura sono generalmente invocato uno dei quattro percorsi tecnici per l&#39;inoculazione dei patogeni: i) aerosol; ii) intrconsegna Anasal; iii) la consegna per via orale; e iv) iniezione intratracheale chirurgica (cioè, tracheotomia) 3. Tutte le vie di infezione presentano vantaggi e svantaggi 3. In particolare, l&#39;esposizione relativa delle vie aeree superiori, possibilità di mescolanza di flora oronasali, i requisiti per l&#39;anestesia generale, la variabilità della inoculo consegnato al polmone distale, la distribuzione lobare dei patogeni consegnati, i requisiti di perizia tecnica, e la morbilità procedurali variano ampiamente tra questi approcci. Comunemente tecniche di infezione orale per utilizzati includono incannulamento endotracheale (translaringea) sia tramite un approccio &#39;blind&#39; (non visualizzato), o sotto la visualizzazione della laringe diretta 3-5. Entrambi i metodi, mentre robusti, richiedono una formazione sostanziale e portano anche il rischio di traumi per le vie aeree superiori. Nella presente relazione, si descrive un metodo tecnicamente non intensivo, non invasivo, economico, e la rapida delle infezioni per via orale, wdichiara batteri Klebsiella pneumoniae (nell&#39;esempio fornito) pipettati in orofaringe di un mouse anestetizzato vengono consegnati ai polmoni tramite aspirazione (vale a dire, per inalazione). Noi e altri abbiamo utilizzato la tecnica polmonite ab ingestis successo 6-9. Questo metodo polmone recapito versatile e di facile apprendimento può essere esteso alla consegna di molti agenti non corrosivi aggiuntivi ai polmoni, quali citochine e altre proteine, molecole associati ai patogeni (ad esempio, lipopolisaccaride), cellule (cioè, trasferimento adottivo), e le tossine (ad esempio, bleomicina). Oltre a discutere importanti considerazioni tecniche, abbiamo anche descriviamo un approccio integrato, quantitativa per valutare la successiva risposta dell&#39;ospite alla polmonite, compresa la misurazione a valle della clearance batterica (ad esempio, unità formanti colonia [CFU] quantificazione negli organi polmone e periferici) e dei leucociti accumulo nello spazio aereo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Klebsiella pneumoniae, serotype 2</td>
			<td style="width:169px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">43816</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tryptic soy broth</td>
			<td style="width:169px;">Becton Dickenson</td>
			<td>211825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4&#34;</td>
			<td>Claflin Medical Equipment</td>
			<td style="width:119px;">MEDC-031122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hema 3 Solution 1</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23-122-937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hema 3 Solution 2</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23-122-952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Hema 3 Fixative</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">23-122-929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">27&#189; gauge tuberculin syringes</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">14-826-87</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Lithium heparin plasma collectors</td>
			<td style="width:169px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2675187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">L-shaped disposable spreaders</td>
			<td style="width:169px;">Lab Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DSC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:243px;">1x PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:169px;">prepared in-house</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:243px;">ACK lysis buffer</td>
			<td style="width:169px;">prepared in-house</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-invasive and technically non-intensive method for induction and phenotyping of experimental bacterial pneumonia in mice

Anche se polmonite acquisita in comunità rimane un importante problema di salute pubblica, modelli murini di polmonite batterica hanno recentemente facilitato significativi progressi preclinici nella nostra comprensione della patogenesi cellulare e molecolare di base. In vivo modelli murini catturare la fisiologia integrata e la resilienza della risposta di difesa ospitante un modo non rivela, ex vivo approcci semplificati alternativi. Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per l&#39;inoculazione intrapolmonare di batteri nei topi, compresi aerosolizzazione, consegna intranasale, perorale cannulazione endotracheale in condizioni &#39;ciechi&#39; e visualizzate, e transcutanea cannulazione endotracheale. Tutti i metodi hanno meriti relativi e limitazioni. Qui, descriviamo in dettaglio un metodo non invasivo, tecnicamente non intensivo, poco costoso, e rapido per la consegna intratracheale di batteri che coinvolge l&#39;aspirazione (cioè, inalazione) per il mousedi un inoculo infettiva pipettati in orofaringe, mentre in anestesia generale. Questo metodo può essere utilizzato per la consegna polmonare di un&#39;ampia varietà di agenti biologici e chimici non corrosivi, ed è relativamente facile da imparare, anche per laboratori con minima esperienza precedente con procedure polmonari. Oltre a descrivere il metodo di polmonite ab ingestis, forniamo anche procedure passo-passo per saggiare la successiva in vivo polmonare risposta immunitaria innata del mouse, in particolare, i metodi per quantificare la clearance batterica e la risposta immunitaria cellulare delle vie aeree infetto. Questo approccio integrato e semplice valutazione polmonite consente di valutazione rapida e robusta dell&#39;effetto delle manipolazioni genetiche e ambientali upon polmonare immunità innata.

C57BL / 6 topi sono stati infettati con 2.000 UFC di K. pneumoniae 43816 (sierotipo 2) tramite aspirazione orofaringea nei polmoni. A questa dose, i topi di solito iniziano a mostrare sintomi clinici dopo l&#39;infezione 12-24 ore tra cui letargia, pelliccia arruffata, e perdita di peso del 5-10% (Figura 2A). All&#39;interno di post-infezione 48-72 ore, molti dei topi mostrano sintomi della malattia e morbilità che in genere viene preceduto da una media di perd...

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A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per modellare la polmonite batterica nei topi. Qui, descriviamo un non invasivo, economico, rapido metodo per indurre la polmonite tramite aspirazione (vale a dire, l&#39;inalazione) di un inoculo batterico pipettati in orofaringe. metodi di valle per la valutazione della risposta immunitaria innata polmonare sono anche dettagliata.

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l&#39;induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

a-non-invasive-technically-non-intensive-method-for-induction

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K Views.  National Institutes of Health.  Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per modellare la polmonite batterica nei topi. Qui, descriviamo un non invasivo, economico, rapido metodo per indurre la polmonite tramite aspirazione (vale a dire, l'inalazione) di un inoculo batterico pipettati in orofaringe. metodi di valle per la valutazione della risposta immunitaria innata polmonare sono anche dettagliata. 

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Preparation of Mouse Pituitary Immunogen for the Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1. It has traditionally been considered a rare disease but reporting has increased markedly in recent years. Hypophysitis, in fact, develops not uncommonly as a "side effect" in cancer patients treated with antibodies that block inhibitory receptors expressed on T lymphocytes, such as CTLA-42 and PD-1 receptors. Autoimmune hypophysitis can be induced experimentally by injecting mice with pituitary proteins mixed with an adjuvant3. In this video article we demonstrate how to extract proteins from mouse pituitary glands and how to prepare them in a form suitable for inducing autoimmune hypophysitis in SJL mice.

Autoimmune hypophysitis can be reproduced in mice by injecting an extract of mouse pituitary proteins.

Preparazione di Immunogeno mouse ipofisari per l&#39;induzione di ipofisite autoimmune sperimentale

Autoimmune hypophysitis is a chronic inflammation of the pituitary gland caused or accompanied by autoimmunity1.  It has traditionally been considered a ...

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

Induzione di ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Un metodo per l&#39;etichettatura vasi embrionali nei topi

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Non invasiva Imaging di candidosi disseminata nelle larve Zebrafish

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Non invasiva Modello di neuropatogeno<em&gt; Escherichia coli</em&gt; L&#39;infezione neonatale nel ratto

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alto</sup&gt; T Cells in topi immunodeficienti

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) resulting in cognitive and motor impairment. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a useful animal model of MS, because it is also characterized by lesion formation in the CNS, motor impairment and is also driven by autoimmune and inflammatory reactions. One of the EAE models is induced with a peptide derived from the myelin oligodendrocyte protein (MOG)35-55 in mice. The EAE mice develop a progressive disease course. This course is divided into three phases: the preclinical phase (day 0 - 9), the disease onset (day 10 - 11) and the acute phase (day 12 - 14). MS and EAE are induced by autoreactive T cells that infiltrate the CNS. These T cells secrete chemokines and cytokines which lead to the recruitment of further immune cells. Therefore, the immune cell distribution in the spinal cord during the three disease phases was investigated. To highlight the time point of the disease at which the activation/proliferation/accumulation of T cells, B cells and monocytes starts, the immune cell distribution in lymph nodes, spleen and blood was also assessed. Furthermore, the levels of several cytokines (IL-1&#946;, IL-6, IL-23, TNF&#945;, IFN&#947;) in the three disease phases were determined, to gain insight into the inflammatory processes of the disease. In conclusion, the data provide an overview of the functional profile of immune cells during EAE pathology.

This manuscript describes the methods for induction and scoring of the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model, together with the assessment of immune cell distribution and mRNA cytokine levels in lymph nodes, spleen, blood and spinal cord using flow cytometry and quantitative PCR, respectively, at various disease phases.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Un metodo non invasivo e tecnicamente non intensiva per l'induzione e Fenotipizzazione Sperimentale polmonite batterica nei topi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Non invasiva di imaging di homing dei leucociti e la migrazione In vivo

Preparazione di Immunogeno mouse ipofisari per l'induzione di ipofisite autoimmune sperimentale

Induzione di ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Un metodo per l'etichettatura vasi embrionali nei topi

Non invasiva Imaging di candidosi disseminata nelle larve Zebrafish

Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse

Non invasiva Modello di neuropatogeno

Induzione di Murine infiammazione intestinale per trasferimento adottivo di Effector CD4

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti