Questo metodo consente la generazione di un gran numero di progenitori di gemme epatiche umane e cellule simili a epatociti con elevata purezza. La capacità di generare queste cellule del fegato potrebbe essere importante per la medicina rigenerativa e altri campi. Controllando le vie di segnalazione dello sviluppo per promuovere la differenziazione epatica e sopprimere la formazione di tipi di cellule indesiderate, questo metodo consente una generazione efficiente di progenitori di gemme epatiche umane e cellule simili a epatociti rispettivamente di sei e 18 giorni di differenziazione.
Il principale vantaggio di questa tecnica è l'elevata purezza delle cellule epatiche umane generate. Per essere questa procedura, aggiungere 50 millilitri di IMDM a un pallone conico contenente una barra di agitazione. Riscaldare il mezzo a 50 gradi Celsius e aggiungere 0,5 grammi di PVA mescolando continuamente per preparare uno stock di PVA a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro.
Successivamente, rimuovere la soluzione di PVA dalla pastiglia di riscaldamento e consentirgli di raffreddarsi a temperatura ambiente. Una volta raffreddata la soluzione, filtrarla attraverso un filtro sterile da 0,2 micrometri. Preparare cdm2 e CDM3 combinando il PVA filtrato con altri reagenti come descritto nella tabella uno del protocollo di testo.
Utilizzare un filtro sterile da 0,2 micrometri per filtrare tutti i supporti. Quindi, preparare i supporti di base rimanenti, CDM4 e CDM5, come descritto nella tabella uno del protocollo di testo. Per preparare il mezzo di differenziazione, scongelare prima le piccole molecole congelate e/o i fattori di crescita a temperatura ambiente.
Aliquota la quantità richiesta di mezzo di base e aggiungi le piccole molecole e i fattori di crescita specificati al mezzo di base alle concentrazioni appropriate. Il giorno prima dell'uso, scongelare la matrice a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, diluire la matrice con un rapporto tra uno e 100 aggiungendo 500 microlitri di matrice in 50 millilitri di DMEM freddo.
Pipettare la matrice diluita nel numero richiesto di pozzi utilizzando un volume di soluzione sufficiente a coprire la superficie del pozzo. Trasferire la piastra rivestita a matrice in un incubatore a 37 gradi Celsius per almeno 60 minuti. Immediatamente prima della semina, aspirare la soluzione a matrice rimanente dai pozzi rivestiti.
Quindi, aspirare il mezzo da una piastra di coltura hPSC in gran parte confluente e aggiungere agente di dissociazione acquistato commercialmente, assicurandosi di utilizzare quanto basta per coprire la superficie su cui le cellule stanno crescendo. Incubare gli hPSC nell'agente di dissociazione a 37 gradi Celsius per cinque minuti o fino a quando alcune colonie iniziano a staccarsi. Aggiungere quindi DMEM e F-12 per diluire l'agente di dissociazione.
Utilizzare una pipetta sierologica a cinque millilitri per pipettare delicatamente su e giù più volte per lavare via tutte le cellule dalla superficie del pozzo. Raccogliere le singole celle rimorsiate in un tubo conico da 50 millilitri e diluire con DMEM e F-12 in base alle esigenze. Centrifugare questo tubo di hPSC raccolti a 350 volte g e a quattro gradi Celsius per tre minuti per pellettare le cellule.
In attesa della centrifugazione, aspirare la matrice dalla piastra in cui verranno seminati gli hPSC. Aggiungere una quantità sufficiente di supporti mTeSR ai pozzi destinatari per coprirli. Quando la centrifugazione è completa, aspirare con cura il supernatante, lasciando gli hPSC pelletati nella parte inferiore del tubo conico.
Resuspend il pellet cellulare in mTeSR integrato con un micromolare di Tiazovivin ottenuto commercialmente. Utilizzando una pipetta P1000, triturare delicatamente da due a tre volte per rimescolare uniformemente il pellet cellulare in una singola sospensione cellulare. Pipettare immediatamente 10 microlitri della sospensione cellulare in un emocitometro e contare il numero di cellule.
Regolare il volume degli hPSC rimorsi con mTeSR integrato con Thiazovivin per ottenere la concentrazione cellulare desiderata per la placcatura. Quindi, agitare la piastra in un motivo incrociato più volte per assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente. Dopo che gli hPSC sono stati placcati per almeno 24 ore, utilizzare un microscopio a contrasto di fase per controllare la morfologia delle cellule con particolare enfasi sul diametro delle colonie hPSC placcate.
Preparare quindi il primo mezzo di differenziazione APS del primo giorno, come indicato nella tabella due del protocollo di testo. Un giorno dopo la semina, aspirare il mTeSR integrato con Thiazovivin dagli hPSC placcati e lavarli brevemente con supporti IMDM. Successivamente, aggiungere il primo giorno di supporto agli hPSC.
Registrare il tempo e riposizionare le cellule nell'incubatrice a 37 gradi Celsius. Continua con i successivi passaggi di differenziazione preparando il mezzo di differenziazione necessario e aggiungendolo alle cellule nei rispettivi giorni di differenziazione intorno alla stessa ora del giorno. In questo studio, popolazioni arricchite di progenitori di gemme epatiche e successivamente cellule simili a epatociti sono generate da hPSC.
Al secondo giorno di differenziazione, le cellule striate primitive si sono differenziate in cellule endodermiche definitive al secondo giorno. La stragrande maggioranza di queste cellule esprime SOX17 e FOXA2. Al terzo giorno di differenziazione, le cellule endodermiche si sono differenziate in progenitori di foregut che appaiono di forma poligonale.
Più tardi, al sesto giorno, i progenitori del progenitore del mento si sono differenziati in progenitori del bocciolo epatico. Questi progenitori di gemme epatiche esprimono AFP, TPX3 e HNF4alpha. Attraverso tre linee hPSC, questo metodo genera il sesto giorno di progenitori epatici positivi all'AFP con un'efficienza di circa l'89%Infine, dopo 18 giorni di differenziazione epatica dagli hPSC, compaiono cellule epatocite positive all'albumina.
Morfologicamente, queste cellule appaiono epiteliali, formando bordi luminosi che ricordano i canaliculi biliari. In questa fase, il citoplasma degli epatociti derivati da hPSC del giorno appare più scuro del nucleo. Quando si seminano cellule staminali pluripotenti umane per la differenziazione, è imperativo seminarle alla giusta densità e anche distribuirle attraverso il pozzo scuotendo la piastra.
La capacità di produrre epatociti umani in vitro è una tecnologia abilitante che consentirà agli scienziati di studiare i meccanismi alla base dello sviluppo epatico. Questo metodo produce un gran numero di epatociti umani in vitro che potrebbero essere utilizzati per studiare la funzionalità e la malattia epatica e per consentire infine nuove terapie per l'insufficienza epatica.
