Questo lavoro è stato supportato con premi da parte del Chief Scientist Office (TCS/16/37) e una borsa di studio di dottorato di MRC.

1. cellule staminali pluripotenti (hPSCs) in 96 ben piastre per Hepatocyte differenziazione di semina
Nota: I reagenti e le attrezzature utilizzate in questo protocollo è stato elencati nella tabella 1. I supporti utilizzati per questo esperimento devono essere sterile e a temperatura ambiente per la coltura cellulare. Se non diversamente specificato, tutti i volumi di soluzione di reagente, descritti in questa parte del protocollo si basano su un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
<ol><li>
Preparare laminin verniciato a 96 pozzetti.
	<ol>
<li>Scongelare una fiala di laminina ricombinante 521 (100 µ g/mL) (LN-521) per 2 h per una notte a 4 ° C.</li>
		<li>Preparare una soluzione di 5 µ g/mL diluendo LN-521 ghiacciata 1 x soluzione tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) (con Ca2 +/Mg2 +).</li>
		<li>Utilizzare un liquido automatico movimentazione erogatore con un tubo standard cassetta di erogazione per aggiungere 50 µ l della soluzione LN-521 per pozzetto di una piastra ben 96. Nota: Tutto il volume dispensa vengono eseguite con un dispenser automatico dei liquidi con un tubo standard cassetta di erogazione, se non diversamente specificato. Privilegiata la soluzione fino a quando raggiunge la fine erogazione della cassetta, quindi procedere per erogare. Più di 96 pozzetti possono essere preparati nello stesso esperimento ripetendo la procedura tante volte quanto necessario.</li>
		<li>Incubare le piastre rivestite con LN521 a 37 °C/5% CO2 per 2-4 h. Nota: Piastre rivestite con LN521 possono essere conservati fino a due settimane a 4 ° C. Tenere le piastre sigillate su una superficie piana per evitare l'evaporazione e contaminazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Scaldare il numero richiesto di prepatinato piastre a 37 ° C per 30 min a 1 h.</li>
	<li>Aspirare la soluzione di LN-521 restante della superficie verniciata utilizzando un adattatore di aspirazione 8 canali. Nota: È fondamentale per evitare il contatto con la superficie rivestita per evitare il degrado del rivestimento.</li>
	<li>Immediatamente aggiungere 50 µ l di mTeSR1 supplementato con inibitore di 10 µM Rho-collegata della chinasi (ROCK) Y27632 e mantenere la piastra nell'incubatore fino semina a 37 °C/5% CO2cellulare. Nota: Non lasciare asciugare i pozzetti rivestite con laminina.</li>
	<li>
Preparare una sospensione di cellule di 3 x 105 cellule/mL in mTeSR1 supplementato con inibitore di 10 µM ROCK Y27632. Nota: La densità di semina per ogni linea cellulare richiedono ottimizzazione.<ol>
<li>Aspirare il mezzo da una capsula di Petri con una cultura indifferenziata di hPSCs a circa 75% a 85% confluency coltivati su LN-521 come precedentemente descritto12. Nota: hPSCs sono coltivate su LN-521 in mTSER1 con il mezzo cambiato ogni 24 h e attraversate regolarmente una volta che le cellule raggiungono l'80% dei confluency come descritto in precedenza12.</li>
		<li>Lavare le cellule con 5 mL di temperatura 1 x DPBS (senza Ca2 +/Mg2 +) e aspirare il buffer.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di 1x delicato reagente di dissociazione delle cellule alle cellule e incubare a 37 ° C per 6-8 min per dissociazione delle cellule. Nota: Per interrompere la reazione, esaminare il distacco delle cellule dalla matrice sotto il microscopio. Le cellule dovrebbero essere parzialmente disconnesso dalla piastra. In caso contrario, estendere l'incubazione per un min di 1 o 2 extra.</li>
		<li>Terminare la reazione aspirando il reagente delicata delle cellule dissociazione e aggiungere 5 mL di mTeSR1 fresco supplementato con inibitore di ROCK Y27632 di 10 µM per le cellule. Usare un raschietto di cella per sollevare le cellule dalla matrice e pipetta su e giù utilizzando una punta di P1000 più volte per mescolare.</li>
		<li>Contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro basato su macchiatura metodo di esclusione del blu di Trypan e preparare la sospensione cellulare con concentrazioni necessarie.</li>
		<li>Pipettare il numero desiderato di cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL o 50 mL sterile e rallentare le cellule mediante centrifugazione li a 115 x g per 5 min a temperatura ambiente. Nota: Per un 96 ben piatto, 5 mL di mezzo di mTeSR1 che contiene 3 x 105 cellule/mL è necessaria per la linea cellulare H9.</li>
		<li>Aspirare il supernatante e Risospendere delicatamente il cellulare fino ad ottenuta una soluzione omogenea a 37 ° C in mTeSR1 supplementato con inibitore di 10 µM ROCK Y27632. Nota: L'uso dell'inibitore di roccia è consigliato come migliora la sopravvivenza post ri-placcatura delle cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 50 µ l della sospensione delle cellule sulla piastra ben 96 contenente 50 µ l di mTeSR1 con inibitore di 10 µM ROCK Y27632.</li>
	<li>Dopo la semina, riporre le piastre nell'incubatore di cella a 37 °C/5% CO2 per 24 h permettere alle cellule di allegare.</li>
	<li>Esaminare le cellule il giorno successivo e prelevare inibitore di roccia, una volta stabilito il contatto cellula-cellula. Al 40% confluency, passare a mezzo di differenziazione (Figura 1B). Nota: Se confluency di cella è superiore al 40%, le piastre non sono adatte per la differenziazione di HLC con la linea cellulare H9.</li>
</ol>2. differenziazione hPSCs per Hepatocyte-come le cellule su laminine ricombinante in 96 ben piastre
<ol><li>
Preparare la differenziazione crescita media e fattori.
	<ol>
<li>Preparare soluzione stock di activina A umana (100 µ g/mL) di dissoluzione umana activina A polvere in sterile 0,2% albumina di siero bovino (BSA) in PBS. Aliquotare il brodo e conservare a-20 ° C. Utilizzare 1:1, 000.</li>
		<li>Preparare soluzione stock mouse Wnt3a (10 µ g/mL) di dissoluzione del mouse Wnt3a polvere in sterile 0,2% di BSA. Aliquotare il brodo e conservare a-20 ° C. Utilizzare a 1: 200.</li>
		<li>Preparare soluzione di riserva (HGF) di fattore di crescita dell'epatocita umano (10 µ g/mL) di dissoluzione umana HGF polvere in sterile 0,2% di BSA. Aliquotare il brodo e conservare a-20 ° C. Utilizzare a 1: 1000.</li>
		<li>Preparare soluzione stock Oncostatin M (OSM) (20 µ g/mL) sciogliendo la polvere in sterile 0,2% di BSA. Aliquotare il brodo e conservare a-20 ° C. Utilizzare 1:1, 000.</li>
		<li>Endoderma definitivo: preparare mezzo di differenziazione endoderma, che consiste di 2% B27 supplemento (50 x, senza insulina), 1% di penicillina/streptomicina (concentrazioni finali: 100 UI/mL e 100 µ g/mL, rispettivamente) aggiunto al Roswell Park Memorial Institute 1640 ( RPMI 1640) medio basale. Conservare a 4 ° C e consumare entro due settimane. Ad ogni cambio medio, integrare il volume richiesto con activina A e Wnt3a alla concentrazione finale di 100 ng/mL e 50 ng/mL, rispettivamente.</li>
		<li>Hepatoblast differenziazione: preparare mezzo di differenziazione hepatoblast, costituito da sostituzione di 20% ad eliminazione diretta del siero (KSR), 0,5% alternativa supplemento di L-Glutammina, 1% non essenziali aminoacidi (NEAA), 0,1 mM beta-mercaptoetanolo, 1% DMSO e 1% penicillina/streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e 100 µ g/mL, rispettivamente) aggiunto a knockout DMEM (KO-DMEM). Filtrare sotto vuoto e conservare a 4 ° C. Utilizzare entro due settimane.</li>
		<li>Differenziazione dell'epatocita: preparare mezzo di differenziazione dell'epatocita, costituito da 1% un'alternativa supplemento di L-Glutammina, sale di 10 µM idrocortisone 21-emisuccinato sodico (HCC), 1% di penicillina/streptomicina (concentrazioni finali a 100 IU/mL e 100 µ g/mL, rispettivamente) aggiunto al medium HepatoZYME. Conservare il brodo a 4 ° C e utilizzare entro due settimane. Per ogni cambiamento medio, integrare il volume richiesto con HGF e OSM (concentrazioni finali a 10 ng/mL e 20 ng/mL, rispettivamente).</li>
	</ol>
</li>
	<li>24h post semina, con attenzione rimuovere il mezzo utilizzando un sistema di pipetta automatica dei canali elettronici portatili e aggiungere 100 µ l di fresco endoderma-adescamento supplementato con 100 ng/mL activina A e 50 ng/mL Wnt3a. Nota: Il processo di differenziazione inizia una volta che è stato aggiunto il supporto di endoderma definitivo. Una volta semina delle cellule è ottimizzato, la differenziazione cellulare viene avviata normalmente entro 24 ore. Tutte le medie, le modifiche vengono eseguite rimuovendo il mezzo con un sistema di pipetta automatica dei canali elettronici portatili e 100 µ l di terreno fresco utilizzando un dispenser automatico dei liquidi con uno standard di erogazione tubo erogazione cassetta a meno che non altrimenti specificato. Con una testa, con 300 µ l punte 96 è stato utilizzato un sistema di pipetta automatica dei canali elettronici portatili. In breve, 90 µ l sono stati aspirati dal bene evitando qualsiasi contatto con le cellule, ed è importante non asciugare le cellule durante il cambiamento medio per ridurre lo stress cellulare.</li>
	<li>Per cellule staminali embrionali umane (hESC), cambiare il mezzo di differenziazione endoderma ogni giorno per tre giorni. Se la differenziazione viene eseguita per le cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs), è possibile estendere la fase di endoderma definitivo 2 giorni extra utilizzando activina A solo.</li>
	<li>Dopo induzione endoderma definitivo, passare al mezzo di KSR/DMSO per hepatoblast specifica e modificare il mezzo ogni 2 giorni per 5 giorni. Nota: Se ci sono un numero di cellule non iscritti nel pozzo, utilizzare non integrati KO-DMEM per lavare le cellule una volta prima del prossimo cambio medio. A causa della durata della seconda fase del protocollo (5 giorni), ci saranno 3 cambi medi con l'ultimo l'ultimo giorno della specifica hepatoblast.</li>
	<li>In seguito la differenziazione hepatoblast, passare a HepatoZYME mezzo per maturazione dell'epatocita. Lavare le cellule una volta con HepatoZYME senza il supplemento dopo aver tolto di mezzo KSR/DMSO e aggiungere 100 µ l di terreno di maturazione HepatoZYME completato con HGF 10 ng/mL e 20 ng/mL OSM.</li>
	<li>Modificare il mezzo ogni 48 h per 7-10 giorni. Al giorno 18 della differenziazione, caratterizzano HLCs analizzando l'espressione genica e l'attività metabolica CYP P450.</li>
</ol>3. caratterizzazione del Hepatocyte-come cellule differenziate su ricombinante laminine
<ol><li>Rilevare l'espressione di marcatori specifici dell'epatocita e di polarizzazione usando immunostaining.</li>
	<li>Testare la funzione metabolica degli epatociti, facendo uso delle analisi di CYP P450 come descritto prima delle12.</li>
	<li>Determinare la variazione di piastra, contando il numero totale di cellule per pozzetto per piastra.</li>
</ol>4. high Throughput immunocitochimica e acquisizione di immagini
<ol><li>Il giorno 18 di differenziazione, lavare i pozzetti tre volte con 1 x DPBS, difficoltà il HLCs erogazione 50 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare a temperatura ambiente per 15-30 min. Dopo la fissazione, lavare tre volte con PBST (0.1% tween) (senza Ca2 +/Mg2 +) utilizzando un lavatore automatico del piatto. Nota: Tutti i lavaggi in questa sezione vengono eseguite utilizzando un lavatore automatico del piatto, se non diversamente specificato. Tutti i lavaggi sono fatta seguendo lo stesso protocollo.</li>
	<li>Permeabilize la membrana di erogazione 100 µ l di PBST (senza Ca2 +/Mg2 +) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, eseguire il blocco della proteina di erogazione 100 µ l di 10% BSA in PBST e incubare per 1 h in agitazione delicata utilizzando un agitatore per piastre. Dopo proteina bloccando, aggiungere 50 µ l di 1% BSA in PBST contenente gli anticorpi primari, incubare per una notte a 4 ° C con agitazione delicata utilizzando un agitatore per piastre. Nota: Non lavare tra aggiunta di blocco e l'anticorpo di proteina.</li>
	<li>Dopo 24 h, lavare tre volte con 1 x DPBS (senza Ca2 +/Mg2 +) e aggiungere l'anticorpo secondario di erogazione 50 µ l di 1% BSA in PBST. Incubare 1h a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Dopo l'incubazione anticorpo secondario, lavare 3 volte con 1 x DPBS. Aggiungere 50 µ l di DPBS con DAPI (10 µ g/mL) e incubare per 5 – 10 minuti a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Infine, lavare 3 volte con DPBS e lasciare 100 µ l di 1 x DPBS nel pozzo. Le piastre sono pronte per l'imaging. Nota: Piastre devono essere conservate a 4 ° C al buio fino a formazione immagine.</li>
	<li>La piastra di immagine utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto e acquisire diversi campi attraverso il pozzo per ottenere una buona rappresentazione del pozzo. Quantificare l'espressione dei diversi marcatori nel HLCs utilizzando software di Columbus (Imaging ad alto contenuto di software di sistema di analisi). Nota: Columbus è un software di analisi dei contenuti ad alta, che offre analisi di segmentazione di cellule per fenotipizzazione delle cellule. Risultati simili possono essere raggiunti utilizzando CellProfiler, un software open-source per l'analisi quantitativa di immagini biologiche22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. 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Prof. ssa David C. Hay è un co-fondatore e direttore di Stemnovate Limited.
Prof. ssa David C. Hay è un direttore di HigherSteaks Limited.

La nostra procedura semiautomatica è efficiente, affidabile ed economico, permettendo la produzione di HLCs a scala (Figura 1). Non c'era alcuna differenza significativa in termini di numero di cellule tra i pozzetti della piastra, rendendo questa piattaforma un approccio adatto per lo screening basati su cellule (Figura 2). Inoltre, il flusso di lavoro semi-automazione consente all'utente di produrre un numero elevato di piastre in una sola volta, che non era possibile prima utilizzando processi manuali5,12.
D'importanza, il processo di automazione non ha impatto sui rendimenti di differenziazione, con la maggior parte delle cellule che esprimono HNF4α (89,2% ± 2) e ALB (92,8% ± 6) (Figura 3). HLCs inoltre espresso enzimi CYP P450 CYP2D6 e CYP3A4 e visualizzato CYP1A2 e CYP3A attività metabolica paragonabile ai precedenti esperimenti segnalati (Figura 3)5. Nonostante la standardizzazione del protocollo, confluency di cella prima la differenziazione è fondamentale per il differenziamento di HLC puro. Di conseguenza, garantendo una distribuzione delle cellule buona attraverso il ben è una considerazione importante (Figura 1). Questo ha dimostrato di essere la linea cellulare dipendente, pertanto è richiesto per ogni prima della linea cellulare scalabilità ottimizzazione di semina e la densità delle cellule.
Nella sua forma attuale, questa piattaforma non è adatta per produrre grandi quantità di HLCs per applicazioni cliniche, e questo molto probabilmente sarà raggiunto attraverso l'uso di bioreattori e fabbriche di cella. Tuttavia, la metodologia sviluppata consente la rapida generazione di cellule di fegato umane per modellazione di malattia, lo screening di stupefacenti e/o droga repurposing studi. Inoltre, il dosaggio è suscettibile di multiplexing, permettendo la generazione di DataSet multiparametrico per analisi meccanicistica. Andando avanti, anche noi crediamo che questa tecnologia potrebbe essere applicata a sistemi più complessi in vitro quali la differenziazione 3D o come una piattaforma per migliorare HLC fenotipo in vitro.
In conclusione, crediamo che il nostro sistema semi-automatizzato e semplice aumentare la velocità effettiva sperimentale e ridurre la variazione sperimentale, migliorando così la qualità del set di dati biologici e loro estrapolazione verso la fisiologia umana.

Epatociti umani primari (PHHs) rappresentano lo standard corrente per la ricerca biomedica del fegato. Malgrado i loro vantaggi, PHHs rappresentano una fonte limitata di epatociti maturi con fenotipo instabile1. Cellule staminali embrionali (ESC) e cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSC) sono stati proposti come una potente risorsa per la ricerca biomedica, promettendo una fonte rinnovabile di tessuto umano, tra cui fegato2,3,4 . Attuali procedure di differenziazione dell'epatocita generano cellule che esprimono i marcatori dell'epatocita, geni e funzioni simili a PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11. Più recentemente, l'uso di materiali definiti e matrici quali ricombinante laminine, ha migliore delle cellule fenotipo e riproducibilità sperimentale5,12,13,14.
Tecniche di coltura cellulare tradizionale si basano molto il pipettaggio manuale, che è molto tempo e soggetto a errori. Questo limita la velocità effettiva del dosaggio e il formato del piatto si può lavorare con. Fino ad oggi, la maggior parte degli studi che descrive la generazione di HLCs sono lavoro intensivo in natura e di conseguenza piccola scala nelle dimensioni15,16,17.
Corrente i progressi nella gestione dei liquidi e sistemi di pipettaggio, in combinazione con microscopia automatizzata e analizzatori di laboratorio, hanno permesso di sviluppare procedure che ridurre al minimo la necessità di intervento umano. Abbiamo approfittato di queste tecnologie e sviluppato un sistema di differenziazione semi-automatico con cui generare grandi quantità di tessuto epatico umano per basic e ricerca biomedica applicata. Questo approccio può essere eseguito con linee di iPSC con piccoli aggiustamenti necessari, a seconda della linea cellulare e umano ESC. Combinando questo sistema con alta contenuto analisi, dimostriamo che phenotyping HLC può essere meno che richiede tempo ed eseguito a scala18,19,20,21.
In sintesi, l'automazione delle tecniche di coltura cellulare descritto nel presente documento ha portato a miglioramenti nell'affidabilità, gestione del tempo sperimentale e analisi throughput.

<table><tbody><tr><td>405 LS Washer</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with Calcium and Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Gentle cell dissociation reagent</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>GripTips for VIAFLO 96</td><td>Integra</td><td>6434</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Human Hepatocyte Growth Factor</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Human Oncostatin M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Laminin 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td><td>ThermoFisher</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Operetta High-Content Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse Wnt3a</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Standard tube dispensing cassette</td><td>ThermoFisher</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette</td><td>Integra</td><td>6001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496&amp;nbsp;EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>Alpha-fetoprotein</td><td>Abcam</td><td>ab3980</td><td>1:500 (mouse)</td></tr><tr><td>CYP2D6</td><td>University of Dundee</td><td>University of Dundee</td><td>1:200 (sheep)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>University of Dundee</td><td>University of Dundee</td><td>1:200 (sheep)</td></tr><tr><td>HNF-4&amp;alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (rabbit)</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-Mouse 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-sheep 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11015</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11008</td><td>1:400</td></tr></tbody></table>

semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells

Cellule staminali pluripotenti umane rappresentano una fonte rinnovabile di tessuto umano. La nostra ricerca è focalizzata sulla generazione di tessuto epatico umano dalle cellule staminali embrionali umane (hESC) ed ha indotto le cellule staminali pluripotenti (iPSCs). Attuali procedure di differenziazione generano umano dell'epatocita-come le cellule (HLCs) visualizzati da una miscela di tratti fetali ed adulti. Per migliorare il fenotipo delle cellule, abbiamo completamente definito la nostra procedura di differenziazione e la nicchia delle cellule, con conseguente generazione di popolazioni di cellule che mostrano l'espressione genica migliorata e funzione. Mentre questi studi segnano progressi, la capacità di generare grandi quantità di multi piastre a pozzetti per lo screening è stata limitata da lavoro intensive procedure e variazioni da lotto a lotto. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato una piattaforma semi-automatizzata per differenziare cellule staminali pluripotenti in HLCs. Stem cell seeding e differenziazione sono state effettuate usando liquid handling e sistemi automatici di pipettaggio in formato piastra a 96 pozzetti. In seguito la differenziazione, fenotipo delle cellule è stata analizzata usando microscopia automatizzata e un luminometro ben multi.

Differenziazione delle cellule è stata effettuata usando una linea di cellule staminali embrionali (H9). La piattaforma semi-automatica è stata utilizzata per differenziare e caratterizzare le cellule (Figura 1A). Un dispenser automatico dei liquidi è stato utilizzato per cappotto matrice e seme di singole cellule. Differenziazione cellulare è stata iniziata quando le cellule raggiunto confluency di 40% (giorno 0). Le modifiche di supporto sono state eseguite utilizzando un sistema di pipetta automatica dei canali elettronici portatili per rimuovere il mezzo e il dispenser di manipolazione dei liquidi per media aggiunta (Figura 1A). Fissazione delle cellule e la colorazione sono stati eseguiti utilizzando il distributore automatico dei liquidi in combinazione con la rondella automatica della piastra. Imaging e quantificazione sono stati eseguiti utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto e software di Columbus. L'attività del citocromo P450 è stata misurata usando un'analisi consolidata. A seguito di incubazione del substrato, i surnatanti delle cellule sono state raccolte e bioluminescenza registrate utilizzando un lettore di micropiastre multimodale (Figura 1A). Inoltre, microscopia di contrasto di fase convenzionale è stata utilizzata per misurare i cambiamenti nella morfologia delle cellule durante la differenziazione degli epatociti (Figura 1B).
Il giorno 18, la variabilità nel numero delle cellule tra pozzi è stata esaminata in seguito DAPI macchiatura (Figura 2A). Sette campi di vista furono catturati per bene e il numero dei nuclei quantificato (Figura 2A). Abbiamo non rilevato nessuna differenza statistica tra pozzetti con una media di ± 3 41.662, 366 cellule per pozzetto (Figura 2B).
Al giorno 18, HLCs erano fissi e macchiato per marcatori tipici dell'epatocita (Figura 3A-G) e testati per l'attività di CYP P450. HLCs hanno espresso gli indicatori dell'epatocita come HNF4α (89,2% ± 2 cellule positive), ALB (92,8% ± 6 cellule positive), AFP (61,8% ± 2 cellule positive). HLCs inoltre esprimono proteine CYP P450, CYP2D6 e CYP3A4 e visualizzato un aspetto poligonale distinto come indicato dall'espressione di proteine E-Cadherin. Attività di CYP P450 HLCs è stata misurata al giorno 18. HLCs ha esibito l'attività di CYP1A2 a 295.906 ± 45, 828 RLU/mL/mg di proteina e CYP3A a 1.066.112 ±177, 416 RLU/mL/mg di proteina (Figura 3 H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> Figura 1: differenziazione degli epatociti da sportelli unici nella 96 Beh formato. (A). diagramma delle attrezzature utilizzate per semi-automatizza la differenziazione cellulare, fissazione, colorazione, imaging e l'attività funzionale. (B). rappresentante cambiamenti nella morfologia cellulare durante il differenziamento HLC. Brevemente, gli sportelli unici sono pronti verso endoderma definitivo, seguita dalla specifica di hepatoblast caratterizzata dalle cellule visualizzati da ciottoli-come la morfologia e prima della maturazione degli epatociti con cellule l'acquisizione di forma poligonale. Barra della scala = 100 µm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> Figura 2: valutazione della variabilità di HLCs pozzetto a altro. (A) rappresentazione di un 96 piastra ben vista di HLCs macchiato con DAPI. Barra della scala = 1 mm (B) quantificazione del numero di cellule per pozzetto. Media del numero di cellulare per pozzi in colonne (in alto) e righe (in basso), da sette campi di viste al bene e quantificati utilizzando software di Columbus. Numero medio delle cellule attraverso la piastra è 41.662 ± 3.366 SEM cellule per pozzetto. Sono state osservate differenze statisticamente significative tra pozzetti. È stato impiegato un one-way ANOVA con test statistici di post-hoc di Tukey. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> Figura 3: espressione del marcatore dell'epatocita e misura di attività di CYP P450 in HLCs al giorno 18. (A) la percentuale dell'alfa di fattore nucleare 4 dell'epatocita (HNF4α) espressione ± SEM si basa su trenta pozzi con dieci campi di vista per pozzetto. (B) la percentuale di espressione di albumina (ALB) + /-SEM, si basa su 3 pozzetti separati con dieci campi di vista per pozzetto. (C) la percentuale di alfa fetoproteina (AFP) + /-SEM si basa su 3 pozzetti separati con dieci campi di vista per pozzetto. Macchiatura di E-caderina (D) . (E) la macchiatura CYP2D6. Macchiatura di CYP3A4 (F) . (G). immunoglobulina G (IgG) controllo di colorazione. Barra della scala = 50 µm. (H) CYP P450 1A2 e 3A attività metabolica in HLCs al giorno 18. La rappresenta dati biologici sei replica + /-SEM. attività è citato come unità di luce relativa (RLU) /mL per 1 mg di proteina. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

Questo protocollo descrive un approccio semi-automatizzato per produrre dell'epatocita-come le cellule da cellule staminali pluripotenti umane in un formato ben 96 PORTATARGA. Questo processo è rapido ed economico, permettendo che la produzione di qualità ha assicurato lotti dell'epatocita-come delle cellule per la ricerca umana di base e applicata.

Produzione semi-automatizzata di Hepatocyte come cellule staminali pluripotenti

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

semi-automated-production-hepatocyte-like-cells-from-pluripotent-stem

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K Views.  University of Edinburgh. Questo protocollo descrive un approccio semi-automatizzato per produrre dell'epatocita-come le cellule da cellule staminali pluripotenti umane in un formato ben 96 PORTATARGA. Questo processo è rapido ed economico, permettendo che la produzione di qualità ha assicurato lotti dell'epatocita-come delle cellule per la ricerca umana di base e applicata.

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Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

Definito e Generazione scalabile di cellule epatociti-come da cellule staminali umane pluripotenti

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

Produzione senza siero di epofere umane tridimensionali da cellule staminali pluripotenti

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

Biologia

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

Protocollo integrativo per la generazione di organoidi epatici umani 3D derivati da iPSC

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to their nature to cluster in the culture dishes with low or no adhesive characteristics, they form aggregates of multiple liver cells that are called human liver spheroids. The forming of 3D liver spheroids relies on the natural tendency of hepatic cells to aggregate in the absence of an adhesive substrate. These 3D structures possess better physiological responses than cells, which are closer to an in vivo environment. Using 3D hepatocyte cultures has numerous advantages when compared with classical two-dimensional (2D) cultures, including a more biologically relevant microenvironment, architectural morphology that reassembles natural organs as well as a better prediction regarding disease state and in vivo-like responses to drugs. Various sources can be used to generate spheroids, like primary liver tissue or immortalized cell lines. The 3D liver tissue can also be engineered by using human embryonic stem cells (hESCs) or induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to derive hepatocytes. We have obtained human liver spheroids using blood-derived pluripotent stem cells (BD-PSCs) generated from unmanipulated peripheral blood by activation of human membrane-bound GPI-linked protein and differentiated to human hepatocytes. The BD-PSCs-derived human liver cells and human liver spheroids were analyzed by light microscopy and immunophenotyping using human hepatocyte markers.

Here we present a non-genetic method to generate human autologous liver spheroids using mononuclear cells isolated from steady-state peripheral blood.

Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Bioingegneria

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

Un metodo efficiente per l'induzione di cellule simili a epatociti diretti da cellule staminali embrionali umane

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

Immunologia e infezioni

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

Specifica del progenitore epatico da cellule staminali pluripotenti utilizzando un sistema di differenziazione definito

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are prone to spontaneous differentiation into unwanted cell types. The methods are labor-intensive and are not easily amenable to large-scale experiments. To overcome these limitations, we developed an automated cell culture system coupled to a high-throughput imaging system and implemented protocols for maintaining multiple hiPSC lines in parallel and neuronal differentiation. We describe the automation of a short-term differentiation protocol using Neurogenin-2 (NGN2) over-expression to produce hiPSC-derived cortical neurons within 6&#8210;8 days, and the implementation of a long-term differentiation protocol to generate hiPSC-derived midbrain dopaminergic (mDA) neurons within 65 days. Also, we applied the NGN2 approach to a small molecule-derived neural precursor cells (smNPC)&#160;transduced with GFP lentivirus and established a live-cell automated neurite outgrowth assay. We present an automated system with protocols suitable for routine hiPSC culture and differentiation into cortical and dopaminergic neurons. Our platform is suitable for long term hands-free culture and high-content/high-throughput hiPSC-based compound, RNAi and CRISPR/Cas9 screenings to identify novel disease mechanisms and drug targets.

We show the automation of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures and neuronal differentiations compatible with automated imaging and analysis.

Produzione automatizzata di neuroni corticali e dopaminergici pluripotenti indotti dall'uomo con monitoraggio integrato delle cellule vive

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...