Risolvere la struttura del dominio del recettore della ryanodina può aiutare con la nostra comprensione del meccanismo molecolare della funzione proteica, dell'azione insetticida e dello sviluppo della resistenza agli insetticidi. Questa misura implica l'uso della cristallografia a raggi X per l'illustrazione della struttura, che è considerata un gold standard per la determinazione della struttura proteica a risoluzione quasi atomica. Questa struttura ad alta risoluzione del dominio del recettore della ryanodina degli insetti rivela il meccanismo di canalizzazione e fornisce un modello importante per lo sviluppo di insetticidi specifici per specie utilizzando approcci di progettazione di farmaci basati sulla struttura.
Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà, perché i potenziali cristallografi proteici devono essere esperti di biochimica, biofisica, informatica e matematica. Inizia amplificando il DNA corrispondente alla proteina di interesse per reazione a catena della polimerasi. Al termine della reazione, eseguire tutti i 50 microlitri di miscela di reazione su un gel di agarosio al 2% ed estrarre il DNA con un kit di estrazione del gel secondo protocolli standard.
Successivamente, linearizzare il DNA vettoriale LIC mescolando 20 microlitri del DNA vettoriale con 6 microlitri di tampone di reazione 10X e 4 microlitri dell'enzima di restrizione SspI in 30 microlitri di acqua doppia distillata. Incubare questa miscela di reazione per tre ore a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, eseguire l'intero mix di reazione su un gel di agarosio dell'1%, seguito dall'estrazione del DNA vettoriale linearizzato con un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
Successivamente, eseguire trattamenti separati T4 DNA polimerasi su 5 microlitri del DNA vettoriale linearizzato e del DNA dell'inserto amplificato PCR, secondo protocolli standard. Incubare per 40 minuti a temperatura ambiente, seguito da 20 minuti di inattivazione del calore enzimatico a 75 gradi Celsius. Eseguire la reazione di ricottura della clonazione indipendente dalla legazione combinando 2 microlitri del DNA inserto trattato con T4 con 2 microlitri del DNA vettoriale LICA trattato con T4 per un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente.
Per trasformare le cellule BL21(DE3)E. Coli con il plasmide ricombinante, scongelare 50 microlitri di cellule competenti sul ghiaccio e aggiungere circa 1 microlitro del plasmide ricotto al tubo. Far scorrere delicatamente il tubo da due a tre volte per mescolare le cellule e il DNA e riposizionare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti.
Alla fine dell'incubazione, shock termico le cellule a 42 gradi Celsius per 40 secondi, seguite da due minuti di nuovo sul ghiaccio. Quindi, aggiungere un millilitro di mezzo LB a temperatura ambiente al tubo e posizionare le celle su uno shaker da 250 giri/min per 45 minuti a 37 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione tremante, piastra da 150 a 200 microlitri di questa miscela su piastre di selezione e invertire le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius.
Il giorno dopo, cultura una singola colonia in 100 millilitri di mezzo 2-YT, integrata con kanamicina, in un incubatore shaker a 37 gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, inoculare un litro di mezzo 2-YT, integrato con kanamicina, con 10 millilitri di coltura notturna, e incubare a 37 gradi Celsius con scuotimento fino a quando la lettura OD600 raggiunge circa 0,6. Quindi, indurre la coltura con IPTG a una concentrazione finale di 0,4 millimolare e far crescere le cellule per cinque ore a 30 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, raccogliere le cellule per centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet a 10 grammi di batteri per 40 millilitri di concentrazione tampone di lisi. Interrompere le pareti cellulari per sonicazione con un'ampiezza del 65% e un secondo su un secondo di riposo, per otto minuti. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione.
Quindi, filtrare il supernatante attraverso un filtro da 22 micrometri e caricare la soluzione in un ciclo campione. Per purificare la proteina di fusione, iniettare il supernatante filtrato dal ciclo del campione in una colonna nichel-nitrolotriacetica a cinque millilitri su un sistema di purificazione con un gradiente lineare da 20 a 250 millimolare imidazolo. Scindere la proteina bersaglio eluita con la proteasi del virus dell'incisione del tabacco, con un rapporto da 1 a 50, durante la notte a 4 gradi Celsius, e purificare la miscela di reazione di scissione su una colonna di resina amilosio e una colonna nichel-nitrolotriacetica, per rimuovere l'etichetta e la proteasi del virus dell'incisione del tabacco.
Dializzare il flusso dalla colonna nichel-nitrolotriacetica contro il tampone di dialisi per ridurre la concentrazione di sale e purificare il campione su una colonna di scambio di anione di un gradiente lineare di cloruro di potassio da 20 a 500 millimolare nel tampone di eluizione. Quindi, concentrare la proteina in un concentratore centrifugo. Iniettare la proteina concentrata in una colonna di filtrazione in gel Superdex 200 26/600 per verificare l'omogeneità e valutare la purezza della proteina del 15%SDS-PAGE.
Per preparare la proteina alla cristallizzazione, concentrare il campione proteico purificato a 10 milligrammi per millilitro nel concentratore centrifugo e scambiare tampone nel tampone di cristallizzazione prima dello stoccaggio di 80 gradi Celsius. Per eseguire lo screening di cristallizzazione, utilizzare il metodo di diffusione del vapore a goccia seduta a 295 Kelvin, con diversi kit di cristallizzazione, e un sistema automatizzato di movimentazione dei liquidi in formato 96-well. Al termine dell'impostazione di caduta, sigillare la piastra di cristallizzazione a 96 pozzi per prevenire l'evaporazione e consentire l'equilibrazione della goccia proteica all'interno del tampone del serbatoio.
Posizionare le piastre in un incubatore di cristallo a 18 gradi Celsius. Controllare periodicamente le piastre al microscopio luminoso per monitorare la formazione e la crescita del cristallo. Per differenziare i cristalli proteici dai cristalli di sale, aggiungere un microlitro di colorante cristallino proteico alla goccia bersaglio e osservare i cristalli al microscopio dopo un'ora.
I cristalli proteici appariranno blu. Per ottimizzare ulteriormente i cristalli, utilizzare le condizioni di cristallizzazione positiva e il metodo di diffusione del vapore goccia appeso in piastre a 24 pozzi, seguito dall'incubazione nell'incubatore di cristalli a 18 gradi Celsius. Per determinare la struttura proteica, montare i cristalli su un criopo al microscopio leggero per il raffreddamento flash in azoto liquido e posizionare i cristalli in un unibuck per lo stoccaggio e il trasporto.
Pre-schermare i cristalli in un diffrattore a raggi X interno, utilizzando la funzione di centraggio manuale per montare e centrare i cristalli. Quindi, utilizzare il software di diffrazione a raggi X per raccogliere i dati. Per indicizzare, integrare e ridimensionare il set di dati utilizzando la suite HKL-2000, selezionare innanzitutto il rilevatore e caricare il set di dati.
Quindi, eseguire la funzione di ricerca di picco per trovare i punti di diffrazione. Indicizza le macchie, seleziona il gruppo di spazio giusto ed esegui l'integrazione di picco. Quindi, ridimensionare il set di dati.
Regolare il modello di errore e ridimensionare di nuovo. Salvare il file sca di output. Per determinare la struttura utilizzando la suite software Phenix, creare un nuovo progetto.
In primo luogo, eseguire Extriage con il file sca per calcolare il possibile numero di copie di molecole proteiche nell'unità asimmetrica. Successivamente, per risolvere il problema di fase con la sostituzione molecolare, eseguire Phaser, utilizzando il file di dati di diffrazione, il file di struttura del modello con identità ad alta sequenza e somiglianza strutturale come proteina bersaglio, e il file di sequenza proteica, per trovare la soluzione. Eseguire la compilazione automatica in Phenix per generare il modello iniziale, utilizzando il file di output di Phaser e il file di sequenza dalla proteina di destinazione.
Costruisci manualmente la struttura nella densità elettronica sperimentale modificata usando il COOT e affina usando Phenix affinare nei cicli iterativi. Convalidare il modello finale utilizzando gli strumenti di convalida in Phenix. In questo esperimento rappresentativo, la purificazione del dominio terminale finale della proteina del recettore della falena diamondback ryanodine, come dimostrato, ha prodotto una singola banda a circa 21 kilodalton dall'analisi STS-PAGE.
Il volume di eluizione dalla colonna di filtrazione del gel ha confermato che il dominio terminale del recettore della ryanodina purificato è un monomero. Per la cristallizzazione, le condizioni più ottimali in cui sono stati formati cristalli a forma di piastra di alta qualità erano in presenza di 1 HEPES molare di un pH di 7 e 1,6 solfato di ammonio molare. La determinazione della struttura proteica dal set di dati di diffrazione utilizzando software come dimostrato ha rivelato il dominio terminale terminale del recettore della falena diamondback ryanodine che copre i residui da 1 a 205.
Le proteine con grande disturbo, regioni flessibili o con affinità deboli sono difficili da cristallizzare. In questi scenari, le strategie di ingegneria proteica come la riduzione dell'entropia superficiale, il troncamento ad anello e il cross-linking, possono aumentare la probabilità di ottenere cristalli proteici migliori. Oltre a rivelare strutture proteiche ad alta risoluzione, la cristallografia a raggi X può anche essere utilizzata per studiare le interazioni proteina-pesticida, che potrebbero aiutare con la progettazione di pesticidi a base di struttura.
