Ringraziamo il Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California a Berkeley per analisi di spettrometria di massa e utili commenti. Si ringrazia il Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, istituti per le scienze biologiche, Accademia delle scienze cinese, Shanghai, Cina per la fornitura di un costrutto di CENP-F full-length. Infine, ringraziamo Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan e Dr. Christof Grewer at Binghamton University per l'accesso alle apparecchiature. Questa ricerca è stata finanziata dalla Fondazione di ricerca per la State University di New York e il dipartimento di chimica, State University of New York at Binghamton.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La nostra analisi in vitro della chinasi sono un metodo molto potente per identificare bersagli molecolari per la chinasi Cdk1, che è un regolatore matrice del ciclo cellulare e regola molti processi cellulari importanti. Il metodo determina se una proteina purificata è un substrato per Cdk1 e permette l'identificazione di siti di fosforilazione specifici. Questo facilita gli studi meccanicistici per regolazione di processi cellulari da fosforilazione attraverso Cdk1.
Il fattore pi?...

Le chinasi sono enzimi che regolano molti processi cellulari e trasferiscono gruppi fosfato da ATP su substrati. Questa fosforilazione è reversibile, veloce, aggiunge due cariche negative e memorizza l'energia libera ed è uno delle modificazioni post-traduzionali più comune usate dalle cellule. CDK1, che è anche conosciuto come omologo di proteina 2 ciclo di divisione cellulare (cdc2) è un master controller per il ciclo cellulare in tutti gli eucarioti1,2,3,4,5e fosforila un orario 8-13% del proteoma6,7.
Mentre gli studi di proteomica recenti hanno identificato molti siti di fosforilazione di proteine, nella maggior parte dei casi, la chinasi responsabile di queste modificazioni è sconosciuta. Il numero di bersagli Cdk1 noti, in particolare nelle cellule umane è basso7. L'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici è importante, in quanto consente studi meccanicistici che stabiliscono come Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Regolazione del ciclo cellulare è importante per la segregazione del cromosoma fedele e la divisione cellulare, e una miriade di processi cellulari devono verificarsi per supportare questa importante funzione fisiologica. Questo include arrestare trascrizione e traduzione prima dell'inizio della mitosi, come pure una riorganizzazione drammatica nella struttura cellulare e organizzazione, ad esempio lo smontaggio dell'involucro nucleare, condensazione cromosomica, Assemblea del fuso mitotico e. Deregolamentazione e gli errori in questi processi causano cancro, difetti di nascita o morte cellulare mitotica. Inibitori specifici di Cdk1 come RO-3306 sono stati sviluppati8, che forniscono potenti strumenti per studi funzionali, e alcuni di questi inibitori sono attualmente nei test clinici per il trattamento del cancro (Vedi9 per la revisione).
Qui, descriviamo una in vitro analisi della chinasi che permette l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici. In questo test, disponibili in commercio umano Cdk1/ciclina B è utilizzato per fosforilare un obiettivo purificato della proteina in vitro. Fosforilazione di un substrato aumenta la sua massa e aggiunge due cariche negative; di conseguenza, fosforilazione successo è confermata da uno spostamento verso l'alto della band gel di proteina su SDS-PAGE. Siti di fosforilazione CDK1 specifici sono successivamente identificati dall'analisi di spettrometria di massa della proteina in vitro fosforilato. Per aiutare con disegno sperimentale, esaminiamo anche strumenti computazionali e riferimenti per la previsione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici dalla sequenza della proteina. Inoltre, descriviamo anche protocolli di purificazione che producono preparati proteici altamente puro e omogeneo adatti per l'analisi della chinasi. Infine, i siti di fosforilazione identificata devono essere verificati da studi funzionali e un'analisi di associazione semplice è descritto qui per tale scopo. Combinato, questo è un approccio molto potente che produce siti di fosforilazione Cdk1 specifici e consente studi meccanicistici in modo Cdk1 controlla il ciclo cellulare7,10,11. Poiché questo metodo si basa su proteine purificate, può essere applicato a qualsiasi risultati affidabili di modello, organismo e rendimenti. Tuttavia, è consigliabile verifica funzionale dei siti fosforilazione ottenuti in vitro , come le cellule hanno ulteriori meccanismi di regolamentazione in vigore, come modifiche di posttranslational, partner di interazione o localizzazione cellulare che può rendere siti di fosforilazione accessibile o inaccessibile per il riconoscimento di Cdk1.
CDK1 riconosce un sito di fosforilazione di consenso che si compone di (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), dove X è ogni residuo e una serina o treonina è il sito di fosforilazione. Particolarmente importante per il riconoscimento è la presenza della prolina in posizione + 1. Inoltre, i residui di base sono preferiti nelle posizioni + 2 o + 3, con la maggior parte dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici contenenti un Lys o Arg presso il + 3 posizione6,12.
Attivazione di Cdk1 è strettamente regolato e conduce all'inizio della mitosi1,2,3,4,5. L'attività di chinasi ciclina-dipendenti in generale dipende dalla loro associazione con distinte cicline (ciclina A, B, C, D ed E in esseri umani), che si sono espressi a livelli durante il ciclo cellulare13di oscillazione. L'espressione CDK1 è costante attraverso il ciclo cellulare e la regolazione della sua attività si basa sulla sua associazione con la subunità regolatorie cicline A e ciclina B5,13,14,15, come Beh come modificazioni post-traduzionali. Formazione del complesso Cdk1/ciclina B è necessaria per le chinasi attivazione5,14,15,16,17,18. Nella fase G2, ciclina B è tradotto nel citosol e importato nel nucleo dove si lega a Cdk15,14,15,16,17,18; Tuttavia, Cdk1/ciclina B è detenuto inattivato da fosforilazione in residui Thr14 e Tyr15 dalla chinasi Cdk1-inibitorio umani Myt1 (chinasi cdc2-inibitorio di membrana-collegato della tirosina e treonina-specifiche) e Wee1, rispettivamente19, 20,21. La fine della fase G2, defosforilazione di Thr14 e Tyr15 dalla divisione cellulare ciclo 25 fosfatasi (cdc25) attiva l'attività della chinasi del complesso Cdk1/cyclin B e innesca l'inizio della mitosi12,14, 18 , 20 , 22 , 23. fosforilazione di Thr161 è anche necessaria per l'attivazione di chinasi ciclina Cdk1/B ed è mediato da Cdk7, l'attivazione di Cdk chinasi (CAK)18. Degradazione del cyclin B in anafase inattiva Cdk1, permettendo l'uscita dalla mitosi24,25. L'attivazione della chinasi Cdk1/ciclina B è pertanto un processo complicato. Il protocollo presentato qui viene eseguito con commercialmente disponibili Cdk1/ciclina B. Durante espressione ricombinante di questo complesso in cellule di insetto, essa è attivata in vivo di chinasi endogene14,20 e resta attiva nello stato purificato. La risultante attiva, ricombinante umano Cdk1/ciclina B è adatto per le analisi in vitro della chinasi.
Qui, descriviamo un protocollo per l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici nel centromero umano proteina F (CENP-F)10. CENP-F è una proteina di cinetocore che risiede nel nucleo durante la maggior parte di interfase (G1 e fase S) e viene esportata nel citosol in G2 fase26,27,28 in un dipendente Cdk1 modo10, 11. localizzazione nucleare è conferita da un bipartito cNLS26. cNLSs sono riconosciuti dal trasporto nucleare di fattore α karyopherin, che facilita, insieme a β di karyopherin e RanGDP, l'importazione del cNLS-carico nel nucleo29. Export nucleare nella fase G2 è facilitata tramite un percorso di esportazione sconosciuto10. Una volta CENP-F risiede nel citosol, esso viene reclutato alla busta nucleare e reclute a sua volta il motore della proteina dineina complesso30,31. Questo percorso è importante posizionare il nucleo rispettivo per il centrosoma durante le fasi iniziali di assemblaggio del fuso mitotico in modo dineina-dipendente, che è importante per la corretta fasatura della voce mitotica e per un processo fondamentale nel cervello sviluppo30,31,32. A partire dalla fase G2, CENP-F è anche assemblati nel cinetocore dove ha ruoli importanti per fedele cromosoma segregazione27,28,33,34,35 . Un passo fondamentale di regolamentazione di queste vie è l'esportazione nucleare di CENP-F nella fase G2, che è dipenda Cdk110,11. Descriviamo qui un protocollo per l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici in cNLS CENP-f. Le mutazioni di Phosphomimetic di questi siti rallentano importazione nucleare di CENP-F, suggerendo che Cdk1/ciclina B regola direttamente la localizzazione cellulare di CENP-F da fosforilazione di sua cNLS10.
Nel complesso, questa analisi in vitro della chinasi permette l'identificazione di substrati specifici per proteine chinasi Cdk1. depurata bersaglio sono fosforilati in vitro di commercialmente disponibile Cdk1/ciclina B complesso e i siti di fosforilazione Successivamente vengono identificati mediante spettrometria di massa. L'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici supporta studi meccanicistici che rivelano come Cdk1 controlla il ciclo cellulare.

<table><tbody><tr><td>2800 mL baffled Fernbach flask</td><td>Corning</td><td>44232XL</td><td></td></tr><tr><td>ampicillin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP413-25</td><td></td></tr><tr><td>benzamidine hydrochloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>B6506-25</td><td></td></tr><tr><td>bottletop filter</td><td>Corning</td><td>431161</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td><td>EMD Millipore</td><td>14-450</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td><td>Invitrogen</td><td>PV3292</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>P6020</td><td></td></tr><tr><td>CENP-F (residues 2987 &amp;ndash; 3065) pGEX6P1 plasmid</td><td>Available upon request.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr><tr><td>centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>chlorampenicol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>C-105-100</td><td></td></tr><tr><td>D/L methionine</td><td>Agros Organics / Fisher</td><td>125650010</td><td></td></tr><tr><td>desalting pipet tips: Zip tips</td><td>Millipore Sigma</td><td>ZTC18S008</td><td></td></tr><tr><td>disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Gold Biotechnology</td><td>DTT50</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td><td>EMD Millipore</td><td>71403</td><td></td></tr><tr><td>electrospray ionization Fourier transform ion</td><td>Bruker Amazon</td><td>Apex III</td><td></td></tr><tr><td>cyclotron resonance mass spectrometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>electrospray ionization ion trap mass spectrometer</td><td>Bruker Amazon</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td><td>Thermo Scientific</td><td>97040-276</td><td></td></tr><tr><td>FPLC system: &amp;Auml;kta Pure FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>29032697</td><td></td></tr><tr><td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>glutathione agarose</td><td>Pierce</td><td>16101</td><td></td></tr><tr><td>glutathione, reduced</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>incubation shaker: multitron shaker</td><td>Infors</td><td>I10102</td><td></td></tr><tr><td>isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>karyopherin &amp;alpha; pet-28a pres plasmid</td><td>Available upon request.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>BP1426-2</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge 5418R, refrigerated</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (0.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>microtubes (1.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>P6611-100ml</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-6P-1 plasmid</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE28-9546-48</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Gold Biotechnology</td><td>P470-10</td><td></td></tr><tr><td>PS protease: PreScission protease</td><td>GE Healthcare</td><td>27084301</td><td></td></tr><tr><td>Phos-tag acrylamide</td><td>Wako Pure Chem. Ind.</td><td>304-93521</td><td></td></tr><tr><td>reduced gluthathione</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4251-50g</td><td></td></tr><tr><td>roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)</td><td>Fisher Scientfiic</td><td>055291D</td><td></td></tr><tr><td>site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning</td><td>Agilent</td><td>210518</td><td></td></tr><tr><td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonifier: Branson S-250D sonifier</td><td>Branson</td><td>15 338 125</td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)</td><td>Spectrum Labs</td><td>08 670B</td><td></td></tr><tr><td>swing out rotor TX-1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>10033-778</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay

Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono un master controller per il ciclo cellulare in tutti gli eucarioti e fosforilano un stimato 8-13% del proteoma; Tuttavia, il numero degli obiettivi identificati per Cdk1, particolarmente in cellule umane è ancora basso. L'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1-specifici è importante, in quanto forniscono meccanicistici intuizioni come Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Regolazione del ciclo cellulare è fondamentale per la segregazione del cromosoma fedele, e difetti in questo processo complicato portano ad aberrazioni cromosomiche e cancro.
Qui, descriviamo una in vitro analisi della chinasi che è utilizzata per identificare siti di fosforilazione Cdk1 specifici. In questo saggio, una proteina purificata è fosforilata in vitro di commercialmente disponibile umano Cdk1/ciclina B. Successful fosforilazione è confermata da SDS-PAGE, e siti di fosforilazione sono successivamente identificate mediante spettrometria di massa. Descriviamo anche protocolli di purificazione che producono preparati proteici altamente puro e omogeneo adatti per l'analisi della chinasi e un'analisi obbligatoria per la verifica funzionale dei siti di fosforilazione identificati, che l'interazione tra le sonde un segnale di localizzazione nucleare classica (cNLS) e relativo trasporto nucleare del ricevitore karyopherin α. Per aiutare con disegno sperimentale, passiamo in rassegna gli approcci per la stima dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici da sequenze proteiche. Insieme questi protocolli presentano un approccio molto potente che produce siti di fosforilazione Cdk1 specifici e consente studi meccanicistici in modo Cdk1 controlla il ciclo cellulare. Poiché questo metodo si basa su proteine purificate, può essere applicato a qualsiasi modello organismo e rendimenti risultati affidabili, specialmente se combinata con studi funzionali delle cellule.

Abbiamo recentemente utilizzato una in vitro analisi della chinasi (Figura 1) per identificare i siti di fosforilazione Cdk1 specifici in un frammento di CENP-F che conteneva un cNLS10. Questo segnale conferisce la localizzazione nucleare di CENP-F durante la maggior parte di interfase. Nella fase G2, CENP-F viene esportato dal nucleo al cytosol in modo Cdk1-dipendente. Per ottenere meccanicistici intuizioni su come Cdk1 regol...

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Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono attivato nella fase G2 del ciclo cellulare e regola molte vie cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi in vitro della chinasi con Cdk1, che permette l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici per stabilire obiettivi cellulari di questa chinasi importante.

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

18.5K Views.  State University of New York at Binghamton. Chinasi cyclin-dipendente 1 (Cdk1) sono attivato nella fase G2 del ciclo cellulare e regola molte vie cellulari. Qui, presentiamo un protocollo per un'analisi in vitro della chinasi con Cdk1, che permette l'identificazione dei siti di fosforilazione Cdk1 specifici per stabilire obiettivi cellulari di questa chinasi importante.

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

Analizzare l&#39;attività della proteina con l&#39;ATP radioattivato

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Ricerca

Biochimica

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Identificazione dei substrati di chinasi CK2 romanzo utilizzando un approccio biochimico Versatile

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular isoform of the myosin regulatory light chain (MLC2v). MLC2v phosphorylation levels are significantly reduced in failing hearts, indicating the clinical importance of assessing the activity of cMLCK and the phosphorylation level of MLC2v to elucidate the pathogenesis of heart failure. This paper describes nonradioactive methods to assess both the activity of cMLCK and MLC2v phosphorylation levels. In vitro kinase reactions are performed using recombinant cMLCK with recombinant calmodulin and MLC2v in the presence of ATP and calcium at 25 &#176;C, which are followed by either a bioluminescent ADP detection assay or a phosphate-affinity SDS-PAGE. In the representative study, the bioluminescent ADP detection assay showed a strict linear increase of the signal at cMLCK concentrations between 1.25 nM to 25 nM. Phosphate-affinity SDS-PAGE also showed a linear increase of phosphorylated MLC2v in the same cMLCK concentration range. Next, the time-dependency of the reactions was examined at the concentration of 5 nM cMLCK. A bioluminescent ADP detection assay showed a linear increase in the signal during 90 min of the reaction. Similarly, phosphate-affinity SDS-PAGE showed a time-dependent increase of phosphorylated MLC2v. The biochemical parameters of cMLCK for MLC2v were determined by a Michaelis-Menten plot using the bioluminescent ADP detection assay. The Vmax was 1.65 &#177; 0.10 mol/min/mol kinase and the average Km was around 0.5 USA &#181;M at 25 &#176;C. Next, the activity of wild type and the dilated cardiomyopathy-associated p.Pro639Valfs*15 mutant cMLCK were measured. The bioluminescent ADP detection assay and phosphate-affinity SDS-PAGE correctly detected defects in cMLCK activity and MLC2v phosphorylation, respectively. In conclusion, a combination of the bioluminescent ADP detection assay and the phosphate-affinity SDS-PAGE is a simple, accurate, safe, low-cost, and flexible method to measure cMLCK activity and the phosphorylation level of MLC2v.

This study describes protocols for nonradiometric methods, a bioluminescent ADP detection assay and a phosphate-affinity SDS-PAGE, to determine the kinase activity of cardiac myosin light chain kinase (cMLCK) and the phosphorylation level of its substrate, myosin regulatory light chain (MLC2v).

Cardiac-specific myosin regulatory light chain kinase (cMLCK) regulates cardiac sarcomere structure and contractility by phosphorylating the ventricular ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such probes typically consist of variants of CFP and YFP, intervened by a phosphorylatable sequence and a phospho-binding domain. Upon phosphorylation, the probe changes conformation, which results in a change of the distance or orientation between CFP and YFP, leading to a change in FRET efficiency (Fig 1). Several probes have been published during the last decade, monitoring the activity balance of multiple kinases and phosphatases, including reporters of PKA2, PKB3, PKC4, PKD5, ERK6, JNK7, Cdk18, Aurora B9 and Plk19. Given the modular design, additional probes are likely to emerge in the near future10. 
Progression through the cell cycle is affected by stress signaling pathways 11. Notably, the cell cycle is regulated differently during unperturbed growth compared to when cells are recovering from stress12.Time-lapse imaging of cells through the cell cycle therefore requires particular caution. This becomes a problem particularly when employing ratiometric imaging, since two images with a high signal to noise ratio are required to correctly interpret the results. Ratiometric FRET imaging of cell cycle dependent changes in kinase and phosphatase activities has predominately been restricted to sub-sections of the cell cycle8,9,13,14.
Here, we discuss a method to monitor FRET-based probes using ratiometric imaging throughout the human cell cycle. The method relies on equipment that is available to many researchers in life sciences and does not require expert knowledge of microscopy or image processing.

FRET-based reporters are increasingly used to monitor kinase and phosphatase activities in live cells. Here we describe a method on how to use FRET-based reporters to assess cell cycle-dependent changes in target phosphorylation.

Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Biologia

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Saggiare l&#39;attività chinasi di LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Analizzare l'attività della proteina con l'ATP radioattivato

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Identificazione dei substrati di chinasi CK2 romanzo utilizzando un approccio biochimico Versatile

Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

Saggiare l'attività chinasi di LRRK2 In vitro

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine vegetali Complessi

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening

Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

Identificazione della chinasi Cyclin-dipendente 1 siti di fosforilazione specifico da una chinasi In Vitro test

Riepilogo

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Analizzare l'attività della proteina con l'ATP radioattivato

Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione

Identificazione dei substrati di chinasi CK2 romanzo utilizzando un approccio biochimico Versatile

Caratterizzazione a livello molecolare utilizzando robusti approcci biochimici di una nuova proteina Kinase

Non-Radioactive In Vitro Cardiac Myosin Light Chain Kinase Assays

Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

Saggiare l'attività chinasi di LRRK2 In vitro

Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine ​​vegetali Complessi

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening

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Identificazione delle modificazioni post-traduzionali di proteine vegetali Complessi