Questa ricerca è stata finanziata in parti da sovvenzioni NIH HL66299 TS, RB e SL, HL60024 a TS e HL136869 a MF.

Tutte le procedure di animali sono state esaminate e approvati dal comitato di cura di animale della University of South Alabama e istituzionale e sono state eseguite in conformità con tutte le normative federali, statali e locali. Colture primarie di cellule endoteliali microvascolari polmonare del ratto (PMVECs) sono stati ottenuti dall'impianto di Core di cultura cellulare presso la University of South Alabama di centro per biologia del polmone. Le cellule sono state preparate utilizzando le procedure precedentemente descritte16.
1. generazione di citotossici surnatanti
Nota: Qui, usiamo due diversi ceppi di p. aeruginosa: PA103, che ha un sistema di secrezione di III tipo intatto in grado di trasferire gli ESOENZIMI ExoU ed ExoT cellule bersaglio durante l'infezione e ∆PcrV, che manca un tipo sistema di secrezione di III ed è incapace di trasferimento ESOENZIMI alle cellule bersaglio dopo l'inoculazione.
<ol><li>Striscia di batteri sul Vogel-Bonner (VB) agar piastre17 e crescere durante la notte a 37 ° C.<ol>
<li>Per preparare i piatti, fare la seguente soluzione di riserva (sali Vogel-Bonner; 10 stock di x): misurare 2G MgSO4, 20 g acido citrico (acido libero), 100 g K2PO4e 35 g NaH2PO4. Aggiungere ddH2O 1 L e autoclave per 15 min con scarico lento.</li>
		<li>Posto 7,5 g di agar in 450 mL ddH2O ed autoclave come sopra.</li>
		<li>A seguito di sterilizzazione in autoclave, inserire entrambe le soluzioni in bagnomaria a 50 ° C per raffreddare.</li>
		<li>Aggiungere 50 mL della soluzione 10 x VB madre sale in agar.</li>
		<li>Aggiungere carbenicillina a 400 µ g/mL (per i ceppi di p. aeruginosa in uso) e miscelare bene agitando la beuta.</li>
		<li>Posto 5 mL della soluzione di agar VB in piastre di coltura sterile individuali, consentire l'agar solidificare e quindi conservare a 4 ° C fino al giorno di semina batterica.</li>
		<li>Il giorno della semina batterica, pre-riscaldare un piatto fino a 37 ° C e poi rigare i batteri sulla piastra con un'ansa sterile. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C durante la notte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verificare PMVEC purezza dalla macchiatura positiva con fluorescente Griffonia simplicifolia lectina e macchiatura negativa con fluorescenti Helix pomatia lectin (un indicatore per cellule endoteliali arteriose). Aliquotare cellule e congelamento in azoto liquido.</li>
	<li>Per esperimenti, mantenere le cellule dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) completati con 10% siero bovino fetale e crescere le cellule in un incubatore a 37 ° C contenente 5% CO2. Utilizzare le celle a passaggi 5-15.<ol>
<li>Per la generazione dei surnatanti citotossici, piastra 2 x 106 cellule in piatti individuali 150cm e crescere per 3-4 giorni fino a quando non viene raggiunto la confluenza. Utilizzare due piastre per esperimento (Vedi sotto).</li>
		<li>Per l'analisi dei surnatanti citotossici, cellule5 piastra 1 x 10 nei singoli pozzetti di un 6-Pozzo piatto e crescono per quattro giorni fino a quando non viene raggiunto la confluenza.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per produrre il surnatante, lavare uno dei piatti dal punto 1.3.1 con tampone fosfato salino due 150 cm di PMVECs, tripsinizzano e poi contare le celle (utilizzare un contatore di cellule automatizzato e seguire il protocollo del produttore; Vedi Tabella materiali). Lavare l'altro piatto di PMVECs con di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) e quindi infettare con uno sforzo di p. aeruginosa ad una molteplicità di infezione (MOI) di 20:1. Ciò si ottiene come segue:<ol>
<li>Per p. aeruginosa, OD540 0.25 = 2 x 108 CFU/mL. Per preparare questa diluizione, aggiungere 1 mL HBSS una cuvetta monouso da 1 mL. Raschiare abbastanza batteri fuori la piastra che è stato preparato nel passaggio 1.1 fino ad ottenere un OD540 di 0,25 quando misurata con uno spettrofotometro. Il passo successivo fornirà un calcolo di quanto i batteri saranno necessari.</li>
		<li>Una volta determinato il numero di PMVECs nella piastra di coltura (passaggio 1.4 sopra), determinare il numero appropriato di batteri da aggiungersi alla piastra di coltura in secondo luogo, non tripsinizzate contenente il PMVECs. Ad esempio, se è accertato che la piastra di coltura del PMVECs contiene 1.3 x 107 cellule, quindi preparare 1.3 x 107 cellule x 20/cellula dei batteri x 1 mL/2 x 108 CFU = 1,3 mL batteri.</li>
		<li>Diluire i 1,3 mL di batteri in HBSS ad un volume finale di 20 mL, affinché tutta la superficie di un piatto di 150 cm può essere coperto con il liquido, quindi aggiungere i batteri diluiti alla piastra di PMVECs.</li>
		<li>Incubare il PMVECs inoculati con i batteri a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 4-5 h, fino a quando le lacune possono essere visto che formano in strato monomolecolare della cellula quando la piastra è osservata microscopicamente (Vedi Figura 1 per un livello adeguato di formazione di spacco).</li>
		<li>Raccogliere il surnatante, poi Centrifugare per 10 min a 2.000 x g in una centrifuga da tavolo per rimuovere i detriti cellulari. Nota: Qualsiasi centrifuga piano tavolo capace di generare sufficiente g forzare a pellet generare cellule e a grandi cellule frammenti possono essere utilizzati per questo passaggio.</li>
		<li>Versare il surnatante in una siringa che ha un filtro da 0,2 µm collegato alla sua estremità, quindi passare il surnatante attraverso il filtro per rimuovere i batteri.</li>
		<li>Utilizzare un'aliquota del surnatante sterile per test di citotossicità (Vedi 2.1) e congelare il resto del surnatante a-80 ° C per un uso futuro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. analisi dei surnatanti citotossici
<ol><li>Analisi di citotossicità<ol>
<li>Crescere PMVECs in piatti 6 pozzetti fino alla confluenza. Pozzi di lavare una volta con HBSS, quindi aggiungere 1,5 mL di surnatante filtro-sterilizzato (raccolti da entrambi cellule PA103 - o ∆PcrV-inoculato) singoli pozzetti. Aggiungere HBSS sterile ad un altro pozzo come controllo negativo.</li>
		<li>Posizionare la piastra nell'incubatrice di CO2 per 21-24 h, quindi osservare per uccisione/citotossicità delle cellule (Vedi punto successivo). Utilizzare i surnatanti che esibiscano una citotossicità per ulteriori sperimentazioni e scartare quelli che non mostrano uccisione delle cellule.</li>
		<li>Quantificazione di uccisione delle cellule<ol>
<li>Rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) misura dalle cellule morte usando i corredi di analisi disponibili nel commercio di LDH e di produttore procedure raccomandate.</li>
			<li>In alternativa, quantificare uccisione delle cellule microscopicamente utilizzando software ImageJ. Per questo, registrare immagini microscopiche e zone della piastra di coltura contenenti cellule intatte, quindi quantificare regioni mancano cellule (indicative della morte delle cellule in un monostrato) utilizzando una macro personalizzata di ImageJ (National Institutes of Health) (Vedi File di codifica supplementare ). Se lo si desidera, eseguire i passaggi di macro manualmente come segue:<ol>
<li>Inserire immagini (in formato RGB o Tiff) la macro e regolare il contrasto a 15% saturata pixel. Duplicare immagini regolare contrasto ed eseguire il comando "sottrarre sfondo" per ottenere un'immagine ad alto contrasto della zona sia in cella e gap all'interno del campo visivo.</li>
				<li>Sottrarre questa immagine dall'immagine originale e combinare l'immagine risultante con l'immagine originale usando il calcolatore di immagine funzione "AND". Convertire l'immagine risultante in maschera bianca (celle) con la funzione di soglia (0 minimo, massimo 5) e nero (lacune) e utilizzare la funzione «erosione di binario» per rimuovere il rumore dall'immagine.</li>
				<li>Misurare il rapporto di nero al bianco pixel all'interno dell'immagine risultante utilizzando la misurazione "frazione di zona". Trama ed esprimono frazionari aree per ogni punto del tempo di trattamento come per cento della superficie massima gap.</li>
				<li>Mezzi di calcolare e confrontare con One-way ANOVA test post-hoc di Tukey, con valori di p meno di 0,05 considerato significativo.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Utilizzare l'analisi di immunoblot per stabilire la presenza di amiloide, tau oligomerici e Aβ in surnatanti della cultura. Effettuare l'analisi di immunoblot usando11,10,procedure standard12, ad eccezione di concentrazione surnatanti almeno 10 volte prima dell'elettroforesi.<ol>
<li>Per concentrare il surnatante, inserire 1-2 mL di surnatante in un'unità filtrante di centrifugazione cui membrana ha un peso molecolare di cut-off di 10 kDa. Quindi, posizionare l'unità filtro in una centrifuga di piano d'appoggio e centrifugare a 2.000 x g fino a quando il grado di concentrazione richiesto è raggiunto (solitamente 45-60 min).</li>
			<li>Determinare la quantità di proteine nel surnatante concentrato11 e uguale quantità di campioni di carico nei singoli pozzetti del gel.</li>
			<li>Eseguire gel, le proteine di trasferimento alla nitrocellulosa, quindi le macchie con anticorpo anti-amiloide A11, anticorpo anti-oligomerici tau T22 o con anticorpo anti-Aβ MOAB2 seguita da appropriati anticorpi secondari della sonda. Sviluppare le macchie utilizzando le procedure standard di chemiluminescenza.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per fare un Tioflavina T test, utilizzare Tioflavina T fluorescenza (ThT) per quantificare amiloidi nei surnatanti. Per queste misurazioni, utilizzare surnatanti filtro-sterilizzato.<ol>
<li>Preparare una soluzione di riserva (50x) della Tioflavina T sospendendo 8mg Tioflavina T (ThT) in salino 10 mL tamponato fosfato (PBS). Dopo la miscelazione, filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 µm per rimuovere il particolato.</li>
			<li>Per misurazioni, aggiungere 20 µ l di brodo di ThT ad 1 mL di PBS in una cuvetta spettrofotometro di 1 mL. Inserire il campione diluito in un spettrofluorimetro.</li>
			<li>Misurare l'emissione di fluorescenza della linea di base con 425 nm eccitazione e scansione l'emissione di fluorescenza da 450-575 nm in incrementi di 2 nm.</li>
			<li>Eseguire una scansione di time-lapse con 425 nm eccitazione e 482 nm emissione, con dati acquisiti ogni 0.2 s per 60 s.</li>
			<li>L'iniziale 20 s della scansione time-lapse misura fluorescenza nella provetta vuota. 20 s, mettere in pausa la scansione e aggiungere 10 µ l del surnatante filtro-sterilizzati per la cuvetta. Mescolare la cuvetta di inversione e quindi inserire nuovamente lo spettrofluorimetro.</li>
			<li>Riprendere la scansione basata sul tempo, acquisendo il finale 40 s di dati.</li>
			<li>Al termine della scansione time-lapse, eseguire una scansione di spettro di emissione di fluorescenza finale utilizzando impostazioni identiche, come dettagliato nel 2.1.5.3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pneumonia+really+the+old+man's+friend?+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia.">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li><li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia.">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li><li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+exoenzymes+U+and+Y+induce+a+transmissible+endothelial+proteinopathy.">Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).</li><li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible,+cytotoxic+prion+amyloids.">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li><li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury.">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li><li>Prusiner, S. 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Nessuna relazione.

Qui, metodi semplici in vitro sono delineati che consentono la dimostrazione della generazione di citotossici amiloidi durante l'infezione con una polmonite causando organismo. Questi metodi includono analisi di citotossicità di cultura cellulare, immunoblotting, quantificazione dell'utilizzo un metodo novello al microscopio e dell'associazione ThT di uccisione delle cellule. Analisi degli agenti citotossici hanno dimostrato che sono amiloide in natura (Figura 2 e </strong...

I pazienti che sopravvivono polmonite hanno elevato i tassi di mortalità nei mesi successivi ospedale scarico1,2,3,4,5,6. Nella maggior parte dei casi, la morte si verifica da qualche tipo di organo di estremità guasto tra cui renale, polmonare, cardiaca, o eventi del fegato, come pure colpo5,6. Il motivo per l'elevato tasso di mortalità in questa popolazione di pazienti non è mai stato stabilito.
Polmonite è classificato come sia essere acquisita in comunità o nosocomiali (nosocomial) e gli agenti che possono causare la polmonite includono batteri, virus, funghi e sostanze chimiche. Una delle principali cause di polmonite nosocomiale è il batterio Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa è un organismo gram-negativo che utilizza un sistema di secrezione di tipo III per trasferire varie molecole effettrici, definite ESOENZIMI, direttamente al citoplasma delle cellule bersaglio7,8. Durante l'infezione di cellule endoteliali polmonari, gli ESOENZIMI destinazione varie proteine intracellulari, compreso un modulo endoteliale del microtubule-collegata della proteina tau9,10,11,12 , che conduce alla rottura di barriera endoteliale con conseguente edema polmonare severo, diminuita funzione polmonare e, spesso, la morte.
Come affermato in precedenza, i pazienti che sopravvivono la polmonite iniziale hanno elevati tassi di mortalità nei primi 12 mesi dopo la dimissione dall'ospedale. Un potenziale meccanismo per spiegare questo fenomeno è che qualche tipo di tossina longeva viene generato durante l'infezione iniziale che conduce al risultato a lungo termine difficile. Due osservazioni supportano questa possibilità. Prime, coltivate cellule endothelial polmonare che sono trattate inizialmente con p. aeruginosa non riescono a proliferare per fino ad una settimana dopo i batteri vengono uccisi da antibiotici13. I prioni secondo, lunga vita e agenti con caratteristiche da prioni sono stati dimostrati in varie malattie umane e animali, in particolare le malattie connesse con il sistema nervoso14,15.
Non sono mai stati descritti metodi per esaminare il potenziale di produzione di agenti citotossici longevi durante l'infezione polmonare. Qui sono descritte una serie di saggi di semplice in vitro che può essere utilizzato per indagare la citotossina produzione e attività che segue infezione usando un agente comune che causa polmonite, p. aeruginosa. Queste analisi devono essere facilmente adattabile per indagare induzione citotossina possibili dopo l'infezione con altri agenti che causano la polmonite, e i surnatanti generati anche dovrebbero essere utili per investigare gli effetti di citotossine in tutto gli organi o gli animali. Infine, i saggi che sono descritte qui molto probabilmente sarà adattabili per testare fluidi biologici umani e animali per la produzione di citotossine durante la polmonite.

<table><tbody><tr><td>Rabbit anti beta amyloid</td><td>Thermo</td><td>71-5800</td><td></td></tr><tr><td>A11 amyloid oligomer antibody</td><td>StressMarq</td><td>SPC-506D</td><td></td></tr><tr><td>T22 anti-tau oligomer antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>ABN454</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.22 micron syringe filters</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HRP Goat antirabbit IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721-1</td><td></td></tr><tr><td>Strains PA103 and &amp;Delta;PcrV</td><td></td><td></td><td>These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td></tr><tr><td>FITC Griffonia lectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9381</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Helix pomatia lectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1261</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>0.22 micron nitrocellulose</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Type 2 collagenase</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30898.03IH</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin Disodium salt</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>795496-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium phosphate heptahydrate</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP021914221</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>G Biosciences</td><td>50-103-5801</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>S9506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10277</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa

I pazienti che sopravvivono polmonite hanno elevati tassi di mortalità nei mesi successivi alla dimissione dall'ospedale. È stato ipotizzato che l'infezione del tessuto polmonare durante la polmonite provoca la produzione di citotossine longeve che può condurre a guasto dell'organo fine successive. Abbiamo sviluppato le analisi in vitro per verificare l'ipotesi che citotossine sono prodotte durante l'infezione polmonare. Cellule endoteliali polmonari isolati del ratto e il batterio Pseudomonas aeruginosa sono utilizzati come sistemi modello, e la produzione di cytoxins dopo l'infezione delle cellule endoteliali dai batteri è dimostrata mediante coltura cellulare seguita da quantificazione diretta utilizzando dosaggi di lattato deidrogenasi e un nuovo metodo al microscopio che utilizza la tecnologia di ImageJ. La natura dell'amiloide di queste citotossine è stata dimostrata dalle analisi obbligatorie di tioflavina T e di immunoblotting e immunodepletion usando l'anticorpo dell'anti-amiloide A11. Ulteriori analisi mediante immunoblotting ha dimostrato che oligomerici tau e Aβ erano prodotte e rilasciate dalle cellule endoteliali dopo l'infezione da p. aeruginosa. Questi metodi dovrebbero essere facilmente adattabili alle analisi di campioni clinici umani.

Un test semplice in vitro è stato sviluppato per analizzare la presenza di citotossine in surnatanti delle cellule infettate dal batterio p. aeruginosa. Fondamentalmente, terreno di coltura da cellule infette sono raccolti 4 h dopo aggiunta batterica, i batteri sono stati rimossi da sterilizzazione filtro del surnatante della cultura, e quindi il surnatante sterile viene aggiunto a una nuova popolazione di cellule. Le cellule sono poi osservate 21-24 h dopo l'aggiunta d...

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Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Metodi per rilevare amiloidi seguente infezione di polmonare endoteliali cellule citotossiche da Pseudomonas aeruginosa

Metodi semplici sono descritti per la dimostrazione della produzione di citotossici amiloidi che segue infezione dell'endotelio polmonare da Pseudomonas aeruginosa.

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

methods-for-detecting-cytotoxic-amyloids-following-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

5.5K Views.  University of South Alabama. Metodi semplici sono descritti per la dimostrazione della produzione di citotossici amiloidi che segue infezione dell'endotelio polmonare da Pseudomonas aeruginosa.

Video: Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Misure singole cellule di Rottura Vacuolar causate da patogeni intracellulari

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Modello

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Un'analisi di virulenza batterica basata su immagine rapida usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Bioingegneria

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

Infezione da pneumococco delle cellule primarie endoteliali nel flusso costante

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Cultura della piccola colonia Variante di Pseudomonas aeruginosa e Quantitazione del suo Alginato

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Co-cultura 3D infetta di cellule epiteliali bronchiali e macrofagi all'interfaccia aria-liquido per la valutazione preclinica degli anti-infettivi

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes susceptibility to bacterial infections in the respiratory system. However, the effects of cigarette smoking on bacterial infections in human lung epithelial cells have yet to be thoroughly studied. Described here is a detailed protocol for the preparation of cigarette smoking extracts (CSE), treatment of human lung epithelial cells with CSE, and bacterial infection and infection determination. CSE was prepared with a conventional method. Lung epithelial cells were treated with 4% CSE for 3 h. CSE-treated cells were, then, infected with Pseudomonas at a multiplicity of infection (MOI) of 10. Bacterial loads of the cells were determined by three different methods. The results showed that CSE increased Pseudomonas load in lung epithelial cells. This protocol, therefore, provides a simple and reproducible approach to study the effect of cigarette smoke on bacterial infections in lung epithelial cells.

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Described here is a protocol to study how cigarette smoke extract affects bacterial colonization in lung epithelial cells.

Studiare gli effetti del fumo di sigaretta sull'infezione da pseudomona nelle cellule epiteliali polmonari

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

Visualizzazione di Pseudomonas aeruginosa all'interno dell'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a poor correlation between antibiotic susceptibility testing (AST) results using standard diagnostic methods (e.g., broth microdilution, disk diffusion, or Etest) and clinical outcomes after antibiotic treatment. Attempts to improve AST by the use of off-the-shelf biofilm growth platforms show little improvement in results. The limited ability of in vitro biofilm systems to mimic the physicochemical environment of the CF lung and, therefore bacterial physiology and biofilm architecture, also acts as a brake on the discovery of novel therapies for CF infection. Here, we present a protocol to perform AST of CF pathogens grown as mature, in vivo-like biofilms in an ex vivo CF lung model comprised of pig bronchiolar tissue and synthetic CF sputum (ex vivo&#160;pig lung, EVPL).
Several in vitro&#160;assays exist for biofilm susceptibility testing, using either standard laboratory medium or various formulations of synthetic CF sputum in microtiter plates. Both growth medium and biofilm substrate (polystyrene plate vs. bronchiolar tissue) are likely to affect biofilm antibiotic tolerance. We show enhanced tolerance of clinical Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolates in the ex vivo model; the effects of antibiotic treatment of biofilms is not correlated with the minimum inhibitory concentration (MIC) in standard microdilution assays or a sensitive/resistant classification in disk diffusion assays.
The ex vivo platform could be used for bespoke biofilm AST of patient samples and as an enhanced testing platform for potential antibiofilm agents during pharmaceutical research and development. Improving the prescription or acceleration of antibiofilm drug discovery through the use of more in vivo-like testing platforms could drastically improve health outcomes for individuals with CF, as well as reduce the costs of clinical treatment and discovery research.

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

This workflow can be used to perform antibiotic susceptibility testing using an established&#160;ex vivo model of bacterial biofilm in the lungs of individuals with cystic fibrosis. Use of this model could enhance the clinical validity of MBEC (minimal biofilm eradication concentration) assays.

Test di efficacia antibiotica in un modello ex vivo di Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus Biofilms nel polmone della fibrosi cistica

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in bacterial infections and constitutes a hallmark of potential threat. Therefore, examining the adherence of bacteria to host cells can be used as a component of bacterial threat assessment. A standard method for enumerating bacterial adherence to host cells is to co-incubate bacteria with host cells, harvest the adherent bacteria, plate the harvested cells on solid media, and then count the resultant colony forming units (CFU). Alternatively, bacterial adherence to host cells can be evaluated using immunofluorescence microscopy-based approaches. However, conventional strategies for implementing these approaches are time-consuming and inefficient. Here, a recently developed automated fluorescence microscopy-based imaging method is described. When combined with high-throughput image processing and statistical analysis, the method enables rapid quantification of bacteria that adhere to host cells. Two bacterial species, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa and Gram-positive Listeria monocytogenes and corresponding negative controls, were tested to demonstrate the protocol. The results show that this approach rapidly and accurately enumerates adherent bacteria and significantly reduces experimental workloads and timelines.

Detection of host-bacterial pathogen interactions based on phenotypic adherence using high-throughput fluorescence labeling imaging along with automated statistical analysis methods enables rapid evaluation of potential bacterial interactions with host cells.

Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...