Diese Forschung wurde in Teilen von NIH-Stipendien HL66299 TS, RB und SL, HL60024, TS und HL136869 MF finanziert.

Alle tierische Verfahren wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle und Animal Care Committee von der University of South Alabama und wurden in Übereinstimmung mit allen Bundes-, Landes- und lokalen Vorschriften durchgeführt. Primärkulturen von Ratte pulmonalen mikrovaskuläre Endothelzellen (PMVECs) wurden von der Zelle Kultur Core Facility der University of South Alabama Center für Lunge Biologie erhalten. Zellen wurden mit der zuvor beschriebenen Verfahren16zubereitet.
1. Generation von zytotoxischen Überstände
Hinweis: Hier verwenden wir zwei verschiedene Stämme von p. Aeruginosa: PA103, die verfügt über eine intakte Typ III-Sekretion in der Lage, die Exoenzymes ExoU und ExoT auf Zielzellen zu übertragen, während der Infektion und ∆PcrV, die einen Typ-III-Sekretion System fehlt und ist nicht in der Lage Exoenzymes auf Zielzellen nach Impfung zu übertragen.
<ol><li>Bakterien auf Vogel-Bonner (VB) Agar-Platten17 Streifen und wachsen über Nacht bei 37 ° C.<ol>
<li>Um Platten vorzubereiten, machen die folgenden Stammlösung (Vogel-Bonner Salze; 10 X Lager): 2 g MgSO4, 20 g Zitronensäure (freie Säure), 100 g K2PO4und 35 g NaH2PO4zu messen. 1 L und Autoklaven für 15 min mit langsamen Auspuff DdH2O hinzufügen.</li>
		<li>Platzieren Sie 7,5 g Agar in 450 mL DdH2O und Autoklaven wie oben beschrieben.</li>
		<li>Legen Sie nach Autoklavieren beide Lösungen in ein Wasserbad von 50 ° C abkühlen lassen.</li>
		<li>50 mL der 10 X VB Salz Vorratslösung zu Agar hinzufügen.</li>
		<li>400 µg/mL (für die Stämme von p. Aeruginosa verwendet wird) Carbenicillin hinzu und mischen Sie gut durch Schütteln der Flasche.</li>
		<li>Platz 5 mL der VB-Agar-Lösung in einzelnen sterilen Kultur Gerichte erlauben das Agar zu festigen, und dann bei 4 ° C bis zum Tag der bakterielle Aussaat aufbewahren.</li>
		<li>Am Tag der bakterielle Aussaat wärmen Sie eine Platte auf 37 ° C vor und dann Streifen Sie Bakterien auf die Platte mit einer sterilen Schleife. Ort der Platte in einem Inkubator 37 ° C über Nacht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PMVEC Reinheit überprüfen, indem Sie positive Färbung mit fluoreszierenden Griffonia Simplicifolia Lektine und negative Färbung mit fluoreszierenden Helix Pomatia Lektin (ein Marker für arterielle Endothelzellen). Aliquoten Zellen und Einfrieren in flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Pflegen Sie für Experimente Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum und wachsen Sie Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 % CO2. Verwenden Sie Zellen bei Passagen 5-15.<ol>
<li>Für die Erzeugung von zytotoxischen Überstände Platte 2 x 106 Zellen in einzelne 150 cm Gerichte und wachsen für 3-4 Tage bis Zusammenfluss erreicht ist. Verwenden Sie zwei Platten pro Experiment (siehe unten).</li>
		<li>Für die Analyse von zytotoxischen Überstände Platte 1 x 105 Zellen in einzelnen Vertiefungen eines 6-gut austeilen und für vier Tage, bis Zusammenfluss erreicht wird wachsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um überstand zu produzieren, eines der zwei 150 cm Gerichte des PMVECs aus Schritt 1.3.1 mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung waschen, trypsinize und dann zählen die Zellen (wir verwenden einen automatisierte Zelle Zähler und Folgen des Herstellers Protokoll; sehen Sie Tabelle der Materialien). Das andere Gericht des PMVECs mit Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS) waschen und dann mit beiden Stamm von p. Aeruginosa bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 20:1 zu infizieren. Dies wird folgendermaßen erreicht:<ol>
<li>Für p. Aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 KBE/mL. Zur Vorbereitung dieser Verdünnung fügen Sie 1 mL HBSS eine 1 mL-Einweg-Küvette hinzu. Kratzen Sie genug Bakterien aus der Platte, die in Schritt 1.1 vorbereitet wurde, bis ein OD-540 von 0,25 erreicht ist, wenn mit einem Spektralphotometer gemessen. Im nächste Schritt wird eine Berechnung der wieviel Bakterien benötigt werden bieten.</li>
		<li>Sobald die Anzahl der PMVECs in der Kulturschale bestimmt ist (Schritt 1.4 oben), bestimmen die entsprechende Anzahl von Bakterien, die zweite, nicht trypsiniert Kulturschale mit der PMVECs hinzugefügt werden soll. Beispielsweise, wenn feststeht, dass der Kulturschale PMVECs 1,3 x 107 Zellen enthält, dann bereiten Sie 1,3 x 107 Zellen X 20 Bakterien/Zelle X 1 mL/2 x 108 KBE = 1,3 mL Bakterien.</li>
		<li>Verdünnen Sie die 1,3 mL Bakterien in HBSS zu einem Endvolumen von 20 mL, so dass die gesamte Oberfläche des einen 150 cm Schüssel kann mit Flüssigkeit bedeckt sein, dann fügen Sie die verdünnten Bakterien auf die Platte des PMVECs.</li>
		<li>Die PMVECs beimpft mit den Bakterien bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator für 4-5 Std. bis Lücken zu sehen in der Zelle monomolekularen Film bilden, wenn die Platte mikroskopisch beobachtet wird (siehe Abbildung 1 für die richtige Ebene der Spaltbildung) inkubieren.</li>
		<li>Den überstand zu sammeln, dann Zentrifugieren für 10 min bei 2.000 x g in einer Tischplatte Zentrifuge, zelltrümmer zu entfernen. Hinweis: Jede Tischplatte Zentrifuge in der Lage, erzeugen ausreichend g zwingen, pellet-unlysed Zellen und großzellige Fragmente können für diesen Schritt verwendet werden.</li>
		<li>Gießen Sie den überstand in eine Spritze, die einen 0,2 µm-Filter angebracht zu seinem Ende, dann den Überstand durch den Filter zu entfernen Bakterien übergeben hat.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Aliquot des sterilen Überstands Zytotoxizität zu testen (siehe 2.1) und den Rest des Überstands bei-80 ° C zur späteren Verwendung einfrieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Analyse der zytotoxischen Überstände
<ol><li>Zytotoxizität Assay<ol>
<li>PMVECs in 6-Wohlen Teller bis Zusammenfluss wachsen. Wash-Brunnen hinzufügen, einmal mit HBSS, dann 1,5 mL Filter sterilisiert überstand (gesammelt von entweder geimpft PA103 oder ∆PcrV Zellen) individuelle Vertiefungen. Geben Sie sterile HBSS in einem anderen als Negativkontrolle.</li>
		<li>Legen Sie die Platte in den CO-2 -Inkubator für 21-24 h, dann Zelle Tötung/Zytotoxizität zu beobachten (siehe nächster Schritt). Überstände, die Zytotoxizität für weitere Experimente zeigen, und verwerfen Sie die Zelle Tötung nicht angezeigt werden.</li>
		<li>Quantifizierung der Zelle Tötung<ol>
<li>Maßnahme Laktat-Dehydrogenase (LDH) Entlassung aus abgestorbenen Zellen, die mit im Handel erhältlichen LDH-Assay Kits und des Herstellers empfohlenen Verfahren.</li>
			<li>Alternativ zu quantifizieren Zelle Tötung mikroskopisch mit ImageJ-Software. Dafür, mikroskopische Aufnahmen und Bereichen der Kulturschale mit intakten Zellen aufnehmen, dann quantifizieren Regionen fehlen Zellen (indikativ für Zelltod in einem monomolekularen Film) mit einem benutzerdefinierten ImageJ (National Institutes of Health)-Makro (siehe zusätzliche Codierung Datei ). Falls gewünscht, führen Sie das Makro Schritte manuell wie folgt:<ol>
<li>Bilder (RGB oder Tiff-Format) in das Makro eingegeben und Kontrast auf 15 % gesättigt Pixel. Doppelte Bilder Kontrast angepasst und führen Sie den Befehl "Subtrahieren Hintergrund", um ein kontrastreiches Bild der Zelle und Lücke in das Blickfeld zu erhalten.</li>
				<li>Dieses Bild aus dem Originalbild abziehen und das resultierende Bild mit dem Originalbild mit dem bildrechner "Und"-Funktion kombinieren. Konvertieren Sie das resultierende Bild in schwarz (Lücken) und weiß (Zellen) Maske mit der Schwelle-Funktion (mindestens 0, maximal 5), und verwenden Sie die Funktion "Binär untergraben" Lärm aus dem Bild entfernen.</li>
				<li>Messen Sie das Verhältnis von Schwarz bis weiße Pixel innerhalb des resultierenden Bildes mit "Bereich Bruchteil" Messung. Plotten und gebrochene Bereiche für jeden Zeitpunkt der Behandlung als Prozent der maximalen Spaltbereich äußern.</li>
				<li>Berechnen Sie Mittel zu und vergleichen Sie mit One-Way ANOVA mit Tukey post-hoc-Test, mit p -Werte weniger als 0,05 als bedeutende.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie Immunoblot Analyse auf um das Vorhandensein von Amyloid, Oligomere Tau und Aβ in Kultur Überstände zu etablieren. Durchführen Sie Immunoblot Analyse mit Standardverfahren10,11,12, mit Ausnahme der Konzentration Kultur Überstände mindestens 10-divisibel vor der Elektrophorese.<ol>
<li>Überstand zu konzentrieren, legen Sie 1 bis 2 mL des Überstandes in eine Zentrifugation-Filter-Einheit, deren Membran ein Molekulargewicht Cut-off von 10 kDa hat. Dann setzen Sie die Filtereinheit in eine Tischplatte Zentrifuge und Zentrifuge bei 2.000 x g bis die nötige Konzentration ist erreicht (in der Regel 45-60 min).</li>
			<li>Bestimmen Sie die Menge des Proteins in der konzentrierten überstand11 und laden Sie gleiche Mengen von Proben in einzelnen Vertiefungen des Gels zu.</li>
			<li>Gele laufen dann Sonde Blots mit A11 Anti-Amyloid Antikörper, T22 Anti-Oligomere Tau Antikörper oder MOAB2 Anti-Aβ Antikörper, gefolgt von entsprechenden Sekundärantikörper Proteine auf Nitrozellulose übertragen. Die Flecken mit standard Chemilumineszenz-Verfahren zu entwickeln.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie ein Thioflavin T Assay Thioflavin T Fluoreszenz (ThT), um amyloide in Überstände zu quantifizieren. Verwenden Sie für diese Messungen Filter sterilisiert Überstände.<ol>
<li>Bereiten Sie eine Stammlösung (50 X) von Thioflavin T die Aussetzung von 8 mg Thioflavin T (ThT) in 10 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Nach dem Mischen, Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 µm-Filter, Partikel zu entfernen.</li>
			<li>Fügen Sie für Messungen 20 µL der ThT-Lager zu 1 mL PBS in einer 1 mL-Spektralphotometer-Küvette hinzu. Legen Sie die verdünnte Probe in einem Spectrofluorimeter.</li>
			<li>Die Baseline-Fluoreszenz-Emission mit 425 nm Anregung und Scannen die Fluoreszenzemission von 450-575 nm in Schritten von 2 nm zu messen.</li>
			<li>Führen Sie einen Zeitraffer Scan mit 425 nm Anregung und 482 nm Emission mit Daten erworben jeden 0,2 s für 60 s.</li>
			<li>Die ersten 20 s der Zeitraffer Scan misst Fluoreszenz in der leere Küvette. Bei 20 s, den Scan anhalten und die Küvette 10 µL des Überstands Filter sterilisiert hinzufügen. Mischen Sie die Küvette durch Umkehrung und setzen Sie dann wieder in die Spectrofluorimeter.</li>
			<li>Wiederaufnahme den zeitbasierten Scan, Erwerb der letzten 40 s Daten.</li>
			<li>Durchführen Sie nach Abschluss des Time-Lapse Scans einen endgültigen Fluoreszenz Emissionsspektrum Scan mit identischen Einstellungen, wie in 2.1.5.3..</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+pneumonia+really+the+old+man's+friend?+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia.">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li><li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia.">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li><li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury.">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li><li>Prusiner, S. 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Nichts zu berichten.

Hier werden einfache in-vitro- Methoden beschrieben, die Demonstration der Generation von zytotoxischen amyloiden während der Infektion mit einer Lungenentzündung verursachen Organismus erlauben. Diese Methoden umfassen eine Zelle Kultur Zytotoxizität Assay, Immunoblotting, Quantifizierung der Zelle Tötung mit ein neues mikroskopische Verfahren und ThT Bindung. Analysen der Zytostatika haben gezeigt, dass sie Amyloid in der Natur (Abbildung 2 und <strong class...

Patienten, die eine Lungenentzündung zu überleben haben erhöhte Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus Entlastung1,2,3,4,5,6. In den meisten Fällen tritt der Tod durch irgendeine Art von Ende-Organversagen einschließlich Nieren-, Lungen-, Herz-, oder Leber Veranstaltungen sowie Schlaganfall5,6. Der Grund für die erhöhte Sterblichkeit bei dieser Patientengruppe wurde nie eingerichtet.
Als wird entweder ambulant erworbener Pneumonie eingestuft oder nosokomiale (nosokomiale) und Agenten, die Pneumonie verursachen können auch Bakterien, Viren, Pilze und Chemikalien. Eine der wichtigsten Ursachen der nosokomialen Pneumonie ist das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa. P. Aeruginosa ist ein gramnegatives Organismus, der eine Typ-III-Sekretion-System verwendet, um verschiedene Effektor-Molekülen, genannt Exoenzymes, direkt in das Zytoplasma der Ziel-Zellen7,8übertragen. Während der Infektion von pulmonalen endothelial Zellen gezielt die Exoenzymes verschiedene intrazelluläre Proteine, einschließlich eine endotheliale Form der Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau9,10,11,12 , was zu endotheliale Barriere Aufschlüsselung, was zu schweren Lungenödem, verringerte Lungenfunktion und oft zum Tod.
Wie bereits erwähnt, haben Patienten, die überleben die ersten Lungenentzündung Sterberaten in den ersten 12 Monaten nach Krankenhaus entlassen erhöht. Ein möglicher Mechanismus für die Erklärung dieses Phänomens ist, dass irgendeine Art von langlebigen Toxin während der anfänglichen Infektion entsteht, die schlechte Langzeitprognose führt. Zwei Beobachtungen unterstützen diese Möglichkeit. Erste, kultivierte pulmonale Endothelzellen, die ursprünglich mit p. Aeruginosa behandelt werden nicht für vermehren sich bis zu einer Woche nach der Bakterien durch Antibiotika13getötet werden. Zweite, langlebigen Prionen und Agenten mit Prion Eigenschaften wurden in verschiedene Krankheiten bei Mensch und Tier, insbesondere Erkrankungen im Zusammenhang mit dem Nervensystem14,15nachgewiesen.
Methoden für die Prüfung der möglichen Produktion von langlebigen Zytostatika in pulmonale Infektion sind nie beschrieben worden. Hier werden eine Reihe von einfachen in-vitro- Tests beschrieben, die für die Untersuchung von Zytotoxin Produktion und Aktivität nach Infektion mit einem gemeinsamen Lungenentzündung verursachen Mittel, p. Aeruginosaverwendet werden. Diese Tests sollten leicht anpassungsfähig zu untersuchen mögliche Zytotoxin Induktion nach Infektion mit anderen Agenten, die Pneumonie verursachen, und die Überstände, die generiert werden sollte auch für die Untersuchung von Auswirkungen der ZELLGIFTE ganz nützlich sein Organe oder Tiere. Schließlich werden die Assays, die hier, am ehesten beschrieben werden anpassungsfähig, tierische und menschliche biologische Flüssigkeiten zur Herstellung von Zellgiften während einer Lungenentzündung zu testen.

<table><tbody><tr><td>Rabbit anti beta amyloid</td><td>Thermo</td><td>71-5800</td><td></td></tr><tr><td>A11 amyloid oligomer antibody</td><td>StressMarq</td><td>SPC-506D</td><td></td></tr><tr><td>T22 anti-tau oligomer antibody</td><td>EMD Millipore</td><td>ABN454</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0.22 micron syringe filters</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HRP Goat antirabbit IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721-1</td><td></td></tr><tr><td>Strains PA103 and &amp;Delta;PcrV</td><td></td><td></td><td>These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td></tr><tr><td>FITC Griffonia lectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9381</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Helix pomatia lectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1261</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>0.22 micron nitrocellulose</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Type 2 collagenase</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30898.03IH</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin Disodium salt</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>795496-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium phosphate heptahydrate</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP021914221</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid</td><td>G Biosciences</td><td>50-103-5801</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Sigma</td><td>S9506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10277</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for detecting cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelial cells by pseudomonas aeruginosa

Patienten, die überleben, Lungenentzündung erhöht Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus entlassen. Es ist vermutet worden, dass Infektion des Lungen-Gewebes während der Lungenentzündung führt bei der Herstellung von langlebigen ZELLGIFTE, die nachfolgende Ende Organversagen führen kann. Wir haben in-vitro- Tests um die Hypothese zu testen, während pulmonale Infektion entstehen ZELLGIFTE entwickelt. Isolierte Ratte pulmonalen Endothelzellen und das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa dienen als Modellsysteme und die Produktion von Cytoxins nach Infektion der Endothelzellen durch Bakterien zeigt mit Zellkulturen, gefolgt von direkte Quantifizierung mit Laktat-Dehydrogenase Assays und eine neuartige mikroskopische Methode ImageJ-Technologie. Amyloid Artder diese ZELLGIFTE wurde durch Thioflavin T Bindung Assays und Immunoblotting und Immunodepletion mit A11 Anti-Amyloid Antikörper nachgewiesen. Weitere Analysen mittels Immunoblotting nachgewiesen, dass Oligomere Tau und Aβ wurden produziert und veröffentlicht von Endothelzellen nach Infektion durch p. Aeruginosa. Diese Methoden sollten leicht anpassbar an Analysen der menschlichen klinischen Proben sein.

Eine einfache in-vitro- Test wurde entwickelt, um auf das Vorhandensein von Zellgiften in Überstände von Zellen infiziert mit dem Bakterium p. Aeruginosaassay. Grundsätzlich Kulturmedium aus infizierten Zellen ist 4 h nach bakteriellen Zugabe gesammelt, die Bakterien werden durch Filter Sterilisation der Überstand Kultur entfernt und dann der sterile Überstand wird hinzugefügt, um eine neue Population von Zellen. Die Zellen sind dann 21-24 h nach der Zugabe des Üb...

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Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Einfache Methoden sind für den Nachweis der Produktion von zytotoxischen amyloide nach Infektion der Lunge Endothel von Pseudomonas Aeruginosabeschrieben.

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

methods-for-detecting-cytotoxic-amyloids-following-infection

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

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Serie: Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

Vorbereitung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Verwendung eines aktivitätsbasierte Sonde für<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Säure Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Forschung

Biochemie

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Immunologie und Infektion

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

Pneumokokken-Infektion von primären humanen Endothelzellen im konstanten Fluss

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Kultur der kleinen Kolonie Variante von Pseudomonas aeruginosa und Quantitation seines Alginats

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of bacteria in lung models can re-adapt epithelial arrangement, while immune cells coordinate an inflammatory response against the bacteria in the microenvironment. While in vivo models have been the choice for testing new anti-infectives in the context of cystic fibrosis, they still do not accurately mimic the in vivo conditions of such diseases in humans and the treatment outcomes. Complex in vitro models of the infected airways based on human cells (bronchial epithelial and macrophages) and relevant pathogens could bridge this gap and facilitate the translation of new anti-infectives into the clinic. For such purposes, a co-culture model of the human cystic fibrosis bronchial epithelial cell line CFBE41o- and THP-1 monocyte-derived macrophages has been established, mimicking an infection of the human bronchial mucosa by P. aeruginosa at air-liquid interface (ALI) conditions. This model is set up in seven days, and the following parameters are simultaneously assessed: epithelial barrier integrity, macrophage transmigration, bacterial survival, and inflammation. The present protocol describes a robust and reproducible system for evaluating drug efficacy and host responses that could be relevant for discovering new anti-infectives and optimizing their aerosol delivery to the lungs.

P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives

We describe a protocol for a three-dimensional co-culture model of infected airways, using CFBE41o- cells, THP-1 macrophages, and Pseudomonas aeruginosa, established at the air-liquid interface. This model provides a new platform to simultaneously test antibiotic efficacy, epithelial barrier function, and inflammatory markers.

P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

fDrug research for the treatment of lung infections is progressing towards predictive in vitro models of high complexity. The multifaceted presence of ...

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes susceptibility to bacterial infections in the respiratory system. However, the effects of cigarette smoking on bacterial infections in human lung epithelial cells have yet to be thoroughly studied. Described here is a detailed protocol for the preparation of cigarette smoking extracts (CSE), treatment of human lung epithelial cells with CSE, and bacterial infection and infection determination. CSE was prepared with a conventional method. Lung epithelial cells were treated with 4% CSE for 3 h. CSE-treated cells were, then, infected with Pseudomonas at a multiplicity of infection (MOI) of 10. Bacterial loads of the cells were determined by three different methods. The results showed that CSE increased Pseudomonas load in lung epithelial cells. This protocol, therefore, provides a simple and reproducible approach to study the effect of cigarette smoke on bacterial infections in lung epithelial cells.

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

Described here is a protocol to study how cigarette smoke extract affects bacterial colonization in lung epithelial cells.

Studium der Auswirkungen von Zigarettenrauch auf Pseudomonas-Infektion in Lungenepithelzellen

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic infection. The development of chronic P. aeruginosa infections is associated with a decline in lung function and increased morbidity. Therefore, there is a great interest in elucidating the reasons for the failure to eradicate P. aeruginosa with antibiotic therapy which occurs in approximately 10-40% of pediatric patients. One of many factors that can affect host clearance of P. aeruginosa and antibiotic susceptibility is variations in spatial organization (such as aggregation or biofilm formation) and polysaccharide production. Therefore, we were interested in visualizing the in situ characteristics of P. aeruginosa within the sputum of CF patients. A tissue clearing technique was applied to sputum samples after embedding the samples into a hydrogel matrix to retain the 3D structures relative to host cells. After tissue clearing, fluorescent labels and dyes were added to allow visualization. Fluorescence in situ hybridization was performed for the visualization of bacterial cells, binding of fluorescently labeled anti-Psl-antibodies for the visualization of the exopolysaccharide and DAPI staining to stain host cells to obtain structural insight. These methods allowed for the high-resolution imaging of P. aeruginosa within the sputum of CF patients via confocal laser scanning microscopy.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

This protocol provides methods for visualization of bacterial cells and polysaccharide synthesis locus (Psl) polysaccharide within the sputum of cystic fibrosis patients.

Visualisierung von Pseudomonas aeruginosa im Sputum von Mukoviszidose-Patienten

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a poor correlation between antibiotic susceptibility testing (AST) results using standard diagnostic methods (e.g., broth microdilution, disk diffusion, or Etest) and clinical outcomes after antibiotic treatment. Attempts to improve AST by the use of off-the-shelf biofilm growth platforms show little improvement in results. The limited ability of in vitro biofilm systems to mimic the physicochemical environment of the CF lung and, therefore bacterial physiology and biofilm architecture, also acts as a brake on the discovery of novel therapies for CF infection. Here, we present a protocol to perform AST of CF pathogens grown as mature, in vivo-like biofilms in an ex vivo CF lung model comprised of pig bronchiolar tissue and synthetic CF sputum (ex vivo&#160;pig lung, EVPL).
Several in vitro&#160;assays exist for biofilm susceptibility testing, using either standard laboratory medium or various formulations of synthetic CF sputum in microtiter plates. Both growth medium and biofilm substrate (polystyrene plate vs. bronchiolar tissue) are likely to affect biofilm antibiotic tolerance. We show enhanced tolerance of clinical Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolates in the ex vivo model; the effects of antibiotic treatment of biofilms is not correlated with the minimum inhibitory concentration (MIC) in standard microdilution assays or a sensitive/resistant classification in disk diffusion assays.
The ex vivo platform could be used for bespoke biofilm AST of patient samples and as an enhanced testing platform for potential antibiofilm agents during pharmaceutical research and development. Improving the prescription or acceleration of antibiofilm drug discovery through the use of more in vivo-like testing platforms could drastically improve health outcomes for individuals with CF, as well as reduce the costs of clinical treatment and discovery research.

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

This workflow can be used to perform antibiotic susceptibility testing using an established&#160;ex vivo model of bacterial biofilm in the lungs of individuals with cystic fibrosis. Use of this model could enhance the clinical validity of MBEC (minimal biofilm eradication concentration) assays.

Antibiotika-Wirksamkeitstests in einem Ex-vivo-Modell von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus Biofilmen in der Mukoviszidose-Lunge

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in bacterial infections and constitutes a hallmark of potential threat. Therefore, examining the adherence of bacteria to host cells can be used as a component of bacterial threat assessment. A standard method for enumerating bacterial adherence to host cells is to co-incubate bacteria with host cells, harvest the adherent bacteria, plate the harvested cells on solid media, and then count the resultant colony forming units (CFU). Alternatively, bacterial adherence to host cells can be evaluated using immunofluorescence microscopy-based approaches. However, conventional strategies for implementing these approaches are time-consuming and inefficient. Here, a recently developed automated fluorescence microscopy-based imaging method is described. When combined with high-throughput image processing and statistical analysis, the method enables rapid quantification of bacteria that adhere to host cells. Two bacterial species, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa and Gram-positive Listeria monocytogenes and corresponding negative controls, were tested to demonstrate the protocol. The results show that this approach rapidly and accurately enumerates adherent bacteria and significantly reduces experimental workloads and timelines.

Detection of host-bacterial pathogen interactions based on phenotypic adherence using high-throughput fluorescence labeling imaging along with automated statistical analysis methods enables rapid evaluation of potential bacterial interactions with host cells.

Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...