Vorremmo ringraziare Alejandro Sánchez Alvarado, che hanno sostenuto l'ottimizzazione iniziale e lo sviluppo di questa tecnica. Lavoro in laboratorio di Carolyn Adler è sostenuta da fondi di Start-up di Cornell University.

1. preparazione
<ol><li>
Preparazione di acqua planaria 17<ol>
<li>Mantenere planarie in una soluzione di sale di X Montjuïc 1. Per preparare l'acqua Planaria, rendere singole soluzioni di riserva di 1m CaCl2, 1m MgSO4, 1 M MgCl2, 1m KCl e 5 M di NaCl in acqua ultrapura. Filtro-sterilizzare con una conservazione a lungo termine del filterfor parte superiore della bottiglia di 0,2 µm. Nota: Utilizzare solo acqua deionizzata ultrapura (con una resistività di 18,2 MΩ a 25 ° C) per preparare Montjuïc sali.</li>
		<li>Per preparare un brodo di 1 L di soluzione di sale X 5, combinare 5 mL di 1 M CaCl2, 5ml di 1m MgSO4, 0,5 mL di MgCl2, 0,5 mL di KCl e 1,6 mL delle soluzioni di NaCl 5m in 900 mL di acqua ultrapura. A questa soluzione, aggiungere 0,504 g di NaHCO3 e mescolare. Regolare il pH a 7.0 con acido cloridrico.</li>
		<li>Diluire questa soluzione di riserva a una concentrazione di lavoro in acqua ultrapura in un contenitore sterile come una damigiana di grande capacità di 1x a 5x (Vedi la Tabella materiali). Utilizzare questa soluzione 1x per mantenere planarie asessuale. Nota: Come alternativa alla soluzione di sale di Montjuïc, utilizzare acqua sorgiva acquistati localmente o acqua ultrapura contenente un sale di commercialmente disponibile acquario mescolare (Vedi Tabella materiali) a una concentrazione of0.5 g/L18.</li>
		<li>Per prevenire l'infezione batterica in coltura statica19, mantenere planarie in acqua contenente un antibiotico. Preparare un 50 mg/mL di soluzione madre di gentamicina solfato in acqua ultrapura e filtro-sterilizzare. Ai contenitori dove gli animali sono mantenuti, aggiungere solfato di gentamicina a una concentrazione finale di 50 µ g/mL (diluizione 1: 1000).</li>
	</ol>
</li>
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Preparazione della pasta del fegato
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<li>Come planarie prosperano su una dieta di organico, manzo nutrito con erba epatica, acquisto di fegato fresco e processo entro 24 h. rimuovere la capsula membranosa che incapsula il fegato di staccando delicatamente. Tagliare il fegato a dadini ~ 1 cm e utilizzare una lama per raschiare e scartare tutte le arterie e le vene epatiche.</li>
		<li>Macerare i pezzi del fegato usando una passaverdure o un robot da cucina e poi passarlo attraverso un colino di cibo della maglia di filo. Combinare in sac e dispensare in siringhe o 35 mm piastre di Petri. Prima dell'alimentazione, centrifugare delicatamente per rimuovere le bolle d'aria.</li>
		<li>Conservare le aliquote del fegato a-80 ° C per fino a un anno e scongelare prima dell'utilizzo. Dopo lo scongelamento, ricongelare qualsiasi rimanente fegato una volta, o conservare a 4 ° C per 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mantenimento degli animali
	<ol>
<li>Planarie crescerà e ridursi a vari formati a seconda della frequenza di alimentazione. Feed per planarie ogni due settimane (una volta ogni 14 giorni). Per colture a lungo termine di massa, utilizzare recipienti di plastica di varie dimensioni (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Per nutrire gli animali, utilizzare una spatola di metallo o una pipetta di trasferimento in plastica per mettere una goccia di pisello di fegato in una scatola. Permettere agli animali di mangiare per 1-2 h. Remove rimanente cibo prima di pulire la casella.</li>
		<li>Pulire i vermi due volte a settimana se alimentato (una volta direttamente dopo la poppata e una volta due giorni dopo), o una volta a settimana, se non alimentati. Per pulire, drenare l'acqua in un becher plastica versando con attenzione l'acqua pur mantenendo planarie nella casella. Pulire la superficie della scatola con un tovagliolo di carta, quindi ripetere su tutti i lati fino a quando la casella è pulita.</li>
		<li>Sostituire l'acqua (a circa ¾ del volume casella) e aggiungere gentamicina a una concentrazione finale di 50 µ g/mL. Negozio animali in un armadio scuro o in un incubatore a 20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selezione di vermi
	<ol>
<li>Selezionare i vermi che sono stati alimentati 5-7 giorni prima. Nota: È molto più difficile da amputare pharynges da vermi che sono recentemente stati alimentati (1-2 giorni prima dell'amputazione). Animali nutriti sono anche più sensibili al sodio azide.</li>
		<li>Selezionare i vermi che sono circa 6 mm di lunghezza. Per stimare le dimensioni del verme, trasferirlo in una capsula Petri utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica. Posizionare un righello piatto 6 - in o la carta millimetrata 5 x 5 mm sotto la piastra di Petri e misurare la lunghezza della vite senza fine, mentre la ricerca per indicizzazione. Nota: Vermi inferiore a 6 mm di lunghezza sono più difficili da amputare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di sodio azide
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di 100 mM sciogliendo polvere di azoturo di sodio in acqua planaria. Attenzione: Sodio azide è tossica e dovrebbe essere maneggiata con cura. Non gettare via giù per lo scarico di sodio azide. Dopo l'uso, si raccolgono separatamente per lo smaltimento come rifiuti pericolosi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. faringe amputazione
<ol><li>Posto i vermi in un diametro di 35 mm di Petri. Rimuovere attentamente tutta l'acqua Planaria dal piatto utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica. Nota: Un massimo di 20 6 mm vermi possa essere comodamente alloggiato in un piatto di queste dimensioni.</li>
	<li>Mettere il recipiente sotto il microscopio e regolare ingrandimento in modo che più vermi possono essere visualizzati contemporaneamente (es. 10 ingrandimenti). Sostituire Planaria acqua con soluzione di azoturo di sodio di 100 mM. Nota: Per un piatto di Petri di 35 mm, circa 5 mL di sodio azide è sufficiente. La soluzione dovrebbe completamente sommergere planarie. Regolare il volume di soluzione per piatti più grandi come necessario.</li>
	<li>Monitorare gli animali sotto il microscopio e si astengono da spostare il piatto per i primi 3-4 min.</li>
	<li>Osservare l'estrusione della faringe attraverso il microscopio; la faringe si sporgono dal sacchetto pharyngeal ed estendere completamente (circa 1 mm di lunghezza) come mostrato in Figura 1B. Nota: È importante attendere la faringe ha terminato estendendo completamente prima di procedere ulteriormente. Una volta che la faringe emerge dall'animale, estensione completa richiede circa 1 min.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica a schizzare animali intorno il piatto. Gli animali succhiano la pipetta e forzatamente rilasciarli nel piatto un paio di volte. Se la faringe è completamente estesa, questo vigoroso pipettaggio farà sì che staccare.</li>
	<li>In alternativa, afferrare la faringe o verticalmente lungo la sua lunghezza, o orizzontalmente lungo la sua circonferenza utilizzando una coppia di una pinzetta (Vedi Tabella materiali) come mostrato in Figura 1. Con la faringe pizzicata nel forcipe, sollevare l'animale verso l'alto verso il menisco. L'animale viene generato, tensione superficiale causerà la faringe staccare dall'animale. Nota: Questo metodo può essere utilizzato per rimuovere il pharynges di animali più piccoli (1-3 mm di lunghezza) dove il forte di turbine non è adeguata. Evitare di frugare o altrimenti ferendo il corpo dell'animale.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta da trasferimento, spostare gli animali amputati un nuovo piatto contenente acqua fresca planaria.</li>
	<li>Una volta trasferiti, sciacquare amputati animali accuratamente in acqua planaria, completamente lo scambio di acqua tre volte. Trasferimento a un nuovo piatto contenente acqua planaria con 50 µ g/mL di gentamicina. Nota: Scambio di buffer completo durante questi tre lavaggi è essenziale per garantire la rimozione di sodio azide.</li>
	<li>Il giorno successivo, sostituire l'acqua nel piatto con acqua fresca planaria contenente 50 µ g/mL di gentamicina. Ripetere ogni giorno da allora in poi.</li>
</ol>3. valutazione della faringe rimozione dopo l'amputazione
<ol><li>Esaminare gli animali sotto un microscopio (con 10-20 ingrandimenti) per determinare se una macchia scura è apparso dopo la rimozione di successo del faringe, come mostrato nella Figura 2A.</li>
	<li>In alternativa, difficoltà e bleach animali secondo il protocollo descritto da Pearson et al. 20. animali di ammollo durante la notte in 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o fluorescente coniugato streptavidina (1 mg/mL diluito 1: 500 a 1 X Phosphate Buffered Saline contenenti 0,3% Triton-X). Montare gli animali sulle diapositive nel 80% glycerol/20% 1 X Phosphate Buffered Saline e immagine sotto un microscopio stereoscopico fluorescente (Figura 2B). Nota: Tutte le immagini in questo manoscritto sono state catturate su uno stereomicroscopio fluorescente con un obiettivo X 1,0.</li>
</ol>4. valutazione della faringe rigenerazione misurando il comportamento alimentare
<ol><li>
Preparazione del fegato
	<ol>
<li>Trasferire la quantità richiesta di incolla del fegato in una microcentrifuga o tubo conico. Girare brevemente per rimuovere le bolle d'aria. Stimare il volume di fegato e poi aggiungere acqua planaria al 1/5 del suo volume e il 2% del volume totale di colorante alimentare rosso. Ad esempio, a 1000 µ l di fegato incollare, aggiungere 200 µ l di acqua planaria e 24 µ l di colorante alimentare.</li>
		<li>Usando un pestello in plastica, puntale o spatola metallica, mescolare accuratamente fino a quando il colorante alimentare è distribuito uniformemente nella pasta di fegato. Girare di nuovo brevemente. Pasta di fegato può essere conservato a 4 ° C per 24 h o congelato in aliquote a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.</li>
		<li>Se il test fino a 25 animali, preparare 25 µ l di fegato incolla per ogni piatto (circa 1 µ l di fegato incolla per animale).</li>
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	<li>
Alimentazione degli animali
	<ol>
<li>Sette giorni dopo l'amputazione chimica, trasferire gli animali un nuovo piatto di Petri. Se gli esperimenti su animali 10-15, utilizzare un piatto 35 mm; più di 15 animali dovrebbero essere testati in una capsula di Petri 60mm. Tenere gli animali al buio, indisturbato, per circa 1 h prima dell'alimentazione.</li>
		<li>Utilizzando le forbici, aumentare la larghezza della punta di una pipetta di P200 tagliando circa ½ cm fuori l'estremità più stretta. Dispensare 25 µ l di pasta rossa del fegato nel piatto. Nota: Taglio alla fine rende la pasta viscosa del fegato più facile il pipettaggio. Per impedire che galleggiano sulla superficie del fegato, toccare la punta verso il basso del piatto durante l'erogazione.</li>
		<li>Permettere agli animali di feed per 30 min.</li>
		<li>Segnare il numero di animali che hanno mangiato posizionando gli animali su un fondo bianco o esaminarli al microscopio con ingrandimento X 10-20.</li>
		<li>Dopo l'alimentazione, rimuovere il fegato dal piatto e pulito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo di ablazione selettiva della faringe utilizzando sodio azide. Altri studi di ablazione mirati in planarie hanno utilizzato modificata chirurgia per rimuovere fotorecettori21 o trattamento farmacologico per l'ablazione di neuroni dopaminergici22. Un vantaggio significativo di amputazione chimico rispetto ai metodi esistenti è che non richiede intervento chirurgico. La struttura rigida della faringe rispetto al resto del corpo Planaria fa...

La rigenerazione è un fenomeno che si verifica in tutto il Regno animale, con capacità rigenerative che vanno dalla rigenerazione di corpo pieno in alcuni invertebrati a più limitate capacità in vertebrati1. Sostituzione dei tessuti funzionali è un processo complesso e spesso comporta il ripristino simultaneo di più tipi di cellule. Ad esempio, per rigenerare l'arto di Salamandra, osteoblasti, condrociti, neuroni, muscoli e cellule epiteliali c'è bisogno di essere sostituito2. Questi tipi di cellule appena generato anche bisogno di essere organizzato correttamente per facilitare la nuova funzione dell'arto. Comprensione di tali processi complessi richiede tecniche che si concentrano sulla rigenerazione di tipi cellulari specifici e la loro integrazione negli organi.
Una delle strategie impiegate per semplificare lo studio della risposta rigenerativa è l'ablazione mirata di alcuni tipi di cellule o di più grandi collezioni di tessuti. Ad esempio, in zebrafish, espressione di nitroreductase in tipi cellulari specifici conduce alla loro distruzione dopo l'applicazione di metronidazole3,4. Nelle larve di Drosophila , espressione dei geni pro-apoptotici sotto promotori tessuto-specifici possono selettivamente l'ablazione regioni specifiche del disco immaginale5,6. Entrambe queste strategie causare danni rapido ma controllato e sono state utilizzate per analizzare i meccanismi molecolari e cellulari responsabili di rigenerazione.
In questo manoscritto, descriviamo un metodo per rimuovere in modo selettivo un intero organo chiamato faringe in Planaria planarie mediterranea. Planarie sono un classico modello di rigenerazione, noto per la loro capacità rigenerativa prolifico, dove anche minuscoli frammenti possono ricrescere interi animali 7,8. Hanno una grande, eterogenea popolazione di cellule staminali che consiste di cellule pluripotenti e di progenitori lignaggio-limitata9,10,11. Queste cellule proliferano e si differenziano per sostituire tutti i tessuti mancanti, tra cui il faringe, sistema nervoso, apparato digerente ed escretore e muscolo e cellule epiteliali9,10,12. Mentre sappiamo che queste cellule staminali iniziare la rigenerazione, non comprendiamo pienamente i meccanismi molecolari che guidano loro di sostituire tutti questi tipi differenti delle cellule. Metodi definiti ferentesi che suscitano le risposte precise sulle cellule staminali possono aiutare a delineare questo complesso processo.
La faringe è un tubo grande, cilindrico, necessario per l'alimentazione e contiene neuroni, muscolo, cellule epiteliali e secretiva13,29. Normalmente nascosti in una tasca sul lato ventrale dell'animale, si estende attraverso il corpo dell'animale singolo apertura su sentendo la presenza di cibo. Per selettivamente amputare la faringe, siamo ammollo planarie in una chimico chiamato sodio azide, un anestetico usato comunemente in c. elegans14,15,16. Suo uso in planarie in primo luogo è stato segnalato da Adler et al., nel 201412. In pochi minuti di esposizione al sodio azide, planarie estrudere loro pharynges, e con agitazione delicata, la faringe si stacca dall'animale. Ci riferiamo a questa perdita completa e selettiva della faringe come "chimica amputazione". Una settimana dopo l'amputazione, una faringe completamente funzionale è restaurato12. Poiché la faringe è necessaria per l'alimentazione, rigenerazione funzionale può essere misurata monitorando il comportamento alimentare. Di seguito descriviamo il protocollo per l'amputazione di chimica e valutare la riqualificazione della faringe e del comportamento alimentare.

<table><tbody><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-3</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Chemical</td><td>M65-3</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Acros/VWR</td><td>41341-5000</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>196770010</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>207790050</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>123360010</td><td>Montju&amp;iuml;c salt solution</td></tr><tr><td>Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot</td><td>ThermoFisher Scientific/VWR</td><td>2324-0015</td><td>Storing planaria water</td></tr><tr><td>Instant Ocean Sea Salt</td><td>Spectrum Brands</td><td>Amazon</td><td>Planaria water</td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate</td><td>Gemini Bio-products</td><td>400-100P</td><td>Planaria water</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71970</td><td>Mincing liver&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Disposable pastry bags-16&amp;rdquo;, 12 pack</td><td>Wilton</td><td>Amazon</td><td>Liver aliquots</td></tr><tr><td>5 mL syringes</td><td>BD/VWR</td><td>309647</td><td>Liver aliquots</td></tr><tr><td>Petri dishes-35mm/60mm</td><td>Greiner Bio-One/VWR</td><td>82050-536/82050-544</td><td></td></tr><tr><td>Plastic containers (various sizes)</td><td>Ziploc</td><td>Amazon</td><td>Housing planarians in static culture</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipette</td><td>Globe Scientific</td><td>138030</td><td></td></tr><tr><td>Forceps - Dumont Tweezer, Style 5</td><td>Electron Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>72700-D (0203-5-PO)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-1</td><td></td></tr></tbody></table>

chemical amputation and regeneration of the pharynx in the planarian schmidtea mediterranea

Planarie sono vermi piatti che sono estremamente efficienti in rigenerazione. Devono questa capacità di un gran numero di cellule staminali che possono rispondere rapidamente a qualsiasi tipo di ferita. Modelli di lesione comune in questi animali rimuovono grandi quantità di tessuto, che danneggia gli organi multipli. Per superare questo danno di tessuto ampio, descriviamo qui un metodo per rimuovere in modo selettivo un singolo organo, la faringe, in Planaria planarie mediterranea. Raggiungiamo questo dagli animali ammollo in una soluzione contenente l'azoturo di sodio inibitore dell'ossidasi del citocromo. Breve esposizione al sodio azide provoca estrusione della faringe dall'animale, che noi chiamiamo "amputazione chimica." Amputazione chimica rimuove l'intera faringe e genera una piccola ferita, dove la faringe si attacca all'intestino. Dopo il risciacquo vasto, tutti gli animali amputati rigenerano una faringe completamente funzionale in circa una settimana. Cellule staminali nel resto del corpo di auto rigenerazione della faringe nuova. Qui, forniamo un dettagliato protocollo per amputazione chimica e descrivere i metodi sia istologici e comportamentali per valutare il successo amputazione e rigenerazione.

L'esposizione al sodio azide sconvolge la normale motilità delle planarie, causando gli animali ad allungare e si contorcono. Questi movimenti forzare la faringe ad emergere dal lato ventrale dell'animale, e dopo circa 6 min in soluzione di sodio azide, la punta bianca della faringe può essere visto (Figura 1B-pannello di sinistra). Pochi minuti dopo, animali attivamente contraggono ed estendono completamente la faringe spingendolo con forz...

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Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Chimica l'amputazione e la rigenerazione della faringe nella Planaria planarie mediterranea

La planaria planarie mediterranea è un eccellente modello per studiare le cellule staminali e rigenerazione dei tessuti. Questa pubblicazione descrive un metodo per rimuovere selettivamente un solo organo, la faringe, esponendo gli animali per la chimica sodio azide. Questo protocollo delinea anche metodi per il monitoraggio di rigenerazione della faringe.

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

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Universidad de Cartagena UDEC

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Cell Biology

Developmental Biology

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Unit 1

Regeneration and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

10.8K Views.  Cornell University. La planaria planarie mediterranea è un eccellente modello per studiare le cellule staminali e rigenerazione dei tessuti. Questa pubblicazione descrive un metodo per rimuovere selettivamente un solo organo, la faringe, esponendo gli animali per la chimica sodio azide. Questo protocollo delinea anche metodi per il monitoraggio di rigenerazione della faringe.

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Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Saggio popolazioni cellulari del sangue<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Indurre completa Polyp Rigenerazione dal aboral Physa della Starlet Anemone di mare<em&gt; Vectensis Nematostella</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their abundant pluripotent stem cell population and ability to regenerate all cell and tissue types after injuries that would be catastrophic for most animals. Recently, planarians have gained popularity as a model for eye regeneration. Their ability to regenerate the entire eye (comprised of two tissue types: pigment cells and photoreceptors) allows for the dissection of the mechanisms regulating visual system regeneration. Eye ablation has several advantages over other techniques (such as decapitation or hole punch) for examining eye-specific pathways and mechanisms, the most important of which is that regeneration is largely restricted to eye tissues alone. The purpose of this video article is to demonstrate how to reliably remove the planarian optic cup without disturbing the brain or surrounding tissues. The handling of worms and maintenance of an established colony is also described. This technique uses a 31 G, 5/16-inch insulin needle to surgically scoop out the optic cup of planarians immobilized on a cold plate. This method encompasses both single and double eye ablation, with eyes regenerating within 1-2 weeks, allowing for a wide range of applications. In particular, this ablation technique can be easily combined with pharmacological and genetic (RNA interference) screens for a better understanding of regenerative mechanisms and their evolution, eye stem cells and their maintenance, and phototaxic behavioral responses and their neurological basis.

This protocol shows how to consistently excise planarian eyes (optic cups) without disturbing surrounding tissues. Using an insulin needle and syringe, either one or both eyes can be ablated to facilitate investigations into the mechanisms regulating eye regeneration, the evolution of visual regeneration, and the neural basis of light-induced behavior.

Ablazione chirurgica Assay per lo studio degli occhi Rigenerazione in Planarie

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

Un'analisi planaria di Motility per misurare le proprietà biomodulanti dei prodotti naturali

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Biochimica

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

Amputazione e rigenerazione delle cifre del mouse adulto: un modello semplice per indagare sulla formazione del Blastema mammario e sull'ossificazione intramembranosa

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

I dosaggi farmacologici genetica e funzionale di manipolare Rigenerazione del Planaria Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Biologia

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Planaria immobilizzazione, irradiazione parziale, e di tessuti

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Planarian Scrunching come una lettura comportamentale quantitativa per il rilevamento di stimoli nocivi

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Planarian Ovary Dissection for Ultrastructural Analysis and Antibody Staining

Accessibility to germ cells allows the study of germ cell development, meiosis, and recombination. The sexual biotype of the freshwater planarian, Schmidtea mediterranea, is a powerful invertebrate model to study the epigenetic specification of germ cells. Unlike the large number of testis and male germ cells, planarian oocytes are relatively difficult to locate and examine, as there are only two ovaries, each with 5-20 oocytes. Deeper localization within the planarian body and lack of protective epithelial tissues also make it challenging to dissect planarian ovaries directly. 
This protocol uses a brief fixation step to facilitate the localization and dissection of planarian ovaries for downstream analysis to overcome these difficulties. The dissected ovary is compatible for ultrastructural examination by transmission electron microscopy (TEM) and antibody immunostaining. The dissection technique outlined in this protocol also allows for gene perturbation experiments, in which the ovaries are examined under different RNA interference (RNAi) conditions. Direct access to the intact germ cells in the ovary achieved by this protocol will greatly improve the imaging depth and quality and allow cellular and subcellular interrogation of oocyte biology.

<meta charset="utf8"></head><body>Dissezione ovarica planaria per analisi ultrastrutturale e colorazione anticorpale

This protocol presents steps taken to dissect ovaries in the freshwater planarians, Schmidtea mediterranea. The dissected ovaries are compatible for antibody immunostaining and ultrastructural analysis with transmission electron microscopy to study the cell biology of the oocytes and somatic cells, providing an imaging depth and quality that were previously inaccessible.

Chimica l'amputazione e la rigenerazione della faringe nella Planaria planarie mediterranea

Riepilogo

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