Vorremmo ringraziare Anthony Bowen cui vetrini sono stati utilizzati come un secondo confronto side-by-side umano così come Sabrina Nolan cui vetrini sono stati utilizzati come un terzo umano side-by-side e un secondo microscopio confronto.

1. preparazione dell'inchiostro di India Slide
<ol><li>Pipettare 10 µ l di campione criptococcico in una diapositiva. Qualsiasi ceppo di lievito circolare funzionerà, ma per questo esperimento H99 era l'unico sforzo utilizzato. Nota: Se il campione è direttamente da terreni di coltura, diluizione 1:2 con PBS o acqua può aiutare a prevenire l'inchiostro di India da aggregazione.</li>
	<li>Pipettare 2 µ l di macchia di inchiostro di India sul campione e miscelare fisicamente spingendo la punta della pipetta per il campione e lo spostamento in un movimento circolare fino a quando l'inchiostro di India appare uniformemente distribuita.</li>
	<li>Porre un coprivetrino sopra il campione tenendo premuto il bordo sinistro del coprivetrino contro la superficie della diapositiva, quindi delicatamente e uniformemente abbassando il lato opposto del coprivetrino sopra il campione.</li>
	<li>Asciugare all'aria per 5 min.</li>
	<li>Applicare delicatamente un leggero strato di smalto a bordo del vetrino coprioggetti per formare un sigillo e preservare la macchia di inchiostro di India.</li>
</ol>2. imaging diapositiva
<ol><li>Mettere i vetrini in un microscopio a campo luminoso con un accessorio della fotocamera e conversione pixel-per-micron noti. Regolare contrasto, obiettivi e filtri in modo che capsule di cella sono chiari e corpi cellulari sono concentrati, scuri bande. Nota: Vari filtri, gli obiettivi e le impostazioni di contrasto funzionerà ma un 20x obiettivo, Ph1 filtro e 2 x 2 binning è raccomandato.</li>
	<li>Assicurarsi che il campo visivo è denso ma non sovrappopolata con cellule criptococciche, con netto contrasto tra cella capsula e sfondo e correttamente focalizzato con il corpo della cella visualizzato come una banda scura. Nota: Il numero esatto delle cellule per un'immagine ottimale variano a seconda dell'obiettivo utilizzato e campione. Gli aspetti importanti sono affinché le cellule non sono in cluster o sovrapposti, che i piani focali delle cellule non variano significativamente, e che non vi è significativa dell'inchiostro di India macchia chiaramente visibile sullo sfondo (almeno il 25% del campo).</li>
	<li>Salvare le immagini in una singola directory con titoli chiari, come l'algoritmo di misurazione verrà eseguito su immagini in un'unica directory e i dati di output saranno organizzati in base ai nomi dei file immagine.</li>
</ol>3. algoritmo Setup
<ol><li>Installare la versione di Python 2.7 da</li>
	<li>Installare le librerie python aggiuntive eseguendo i comandi "pip installare cuscino" e "pip install openpyxl".</li>
	<li>Installare MATLAB seguendo le istruzioni riportate in</li>
	<li>Costruire la libreria python MATLAB seguendo le istruzioni fornite alle https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.</li>
	<li>Scaricare i tre file necessari inclusi in materiali di questo manoscritto supplementari ("QCA.py", "Analysis2.m" e "TestRun.m"). Nota: Questi file possono essere estratti in qualsiasi posizione, ma tutti e tre devono essere nella stessa directory.</li>
</ol>4. utilizzo dell'algoritmo
<ol><li>Eseguire l'applicazione facendo doppio clic su QCA.py. Nota: L'applicazione potrebbe richiedere alcuni minuti per iniziare. Il file "QCA.py" contiene la struttura del programma che chiama i file di "m" per eseguire l'algoritmo effettivo.</li>
	<li>Attenersi alla procedura descritta nel programma.<ol>
<li>Input del tipo di estensione dei file di immagine preceduta da un periodo e separati da punti e virgola (ex. ". TIF;. JPEG") quindi fare clic sul pulsante di invio .</li>
		<li>Scegliere la directory in cui si trovano i file di immagine facendo clic sul pulsante Seleziona cartella e selezionando la cartella che contiene le immagini.</li>
		<li>Generare l'elenco di file di immagine nella directory facendo clic sul pulsante Generate Image List . Le immagini saranno elencate nella casella di testo a destra. Esaminare e verificare che l'elenco è accurato e completo.</li>
		<li>Selezionare un'immagine casuale dall'elenco per utilizzare come anteprima facendo clic sul pulsante Seleziona immagine casuale . Nota: Se l'immagine è in grado di aprire a causa di un "errore di modalità immagine non corretta", l'algoritmo continuerà a funzionare correttamente nonostante non visualizzazione dell'immagine. Dopo passo 4.2.7, continuerà a visualizzare l'immagine di prova.</li>
		<li>Obiettivo del microscopio e binning impostazioni di input. Se le impostazioni predefinite non corrispondono il microscopio utilizzato, selezionare "Custom Pixel conversione" e la conversione pixel-per-um per i file di immagine di input. Una volta selezionato, fare clic sul pulsante di Conversione di calcolare e verificare che la conversione viene corretta secondo la casella di testo sulla destra. Nota: Immagini rappresentative, illustrate nella Figura 1 sono state calcolate con 40 x ingrandimento e 2 x 2 binning selezionato.</li>
		<li>Inserire i parametri dell'algoritmo per il rilevamento di cerchio.<ol>
<li>Il raggio minimo e massimo rilevabile per la rilevazione di capsula esterna come voci di Min e Max capsula Radius in ingresso. Una gamma più ridotta vi permetterà di ottenere risultati più accurati.</li>
			<li>Il raggio minimo e massimo rilevabile per il rilevamento del corpo cellulare come voci di Min e Max corpo cellulare Radius in ingresso. Nota: Tutti e quattro di queste voci deve essere numeri che rappresentano i rispettivi valori in pixel, secondo le immagini sorgente.</li>
			<li>Spostare i cursori di capsula e la sensibilità del corpo cellulare per regolare la soglia di sensibilità dell'algoritmo. Una bassa sensibilità sarà rigorosa e ridurre il rilevamento di falsi positivi cerchio, ma potrebbe anche rilevare meno reale cerchi. Al contrario, un'alta sensibilità aumenterà il tasso di rilevazione, ma può anche provocare falsi positivi cerchi. Nota: I risultati rappresentativi sono stati ottenuti con un raggio minimo capsula di 7, raggio massimo capsula di 45, raggio minimo corpo di 4, raggio massimo del corpo di 30, capsula sensibilità di 87 e sensibilità del corpo dell'87.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verificare i parametri dell'immagine selezionato casualmente facendo clic sul pulsante Esegui Test . I risultati verranno visualizzati in alto al centro del programma, sostituendo l'immagine originale. Se i risultati sono accurati, si consiglia di selezionare un'immagine casuale aggiuntiva per cercare anche di garantire che i parametri selezionati si adattano a tutte le immagini selezionate.<ol>
<li>Massimizzare il numero di corpi e capsule rilevati e controllare visivamente se i cerchi sembrano adattarsi correttamente. Il numero di corpi all'interno di capsule rilevati verrà visualizzato nella casella di testo a destra. In caso contrario, modificare i parametri dell'algoritmo fino a quando i risultati sono accurati. Nota: La spessa cerchi colorati sono solo per aiutare con visualizzazione. I cerchi effettivi generati per la misura è una curva matematica calcolata dall'algoritmo HCT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire l'algoritmo di rilevamento per l'intera directory dei file di immagine facendo clic sul pulsante Analisi di iniziare . Ogni immagine sarà analizzata e il programma visualizzerà "finito" nella casella di testo a destra quando tutte le immagini sono state analizzate.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante corrispondenza e pulitura . Questo abbinare corpi cellulari rilevati alle capsule rilevati in che risiedono e calcolare il vero raggio capsula sottraendo corpo dalla capsula. Nota: Se l'algoritmo viene utilizzato per rilevare la fluorescenza o un'altra situazione in cui un solo cerchio è rilevato questo passaggio è inutile. Invece di scegliere i Corpi solo tirare o il pulsante Solo tirare capsule per raccogliere i dati per solo il blu o solo i cerchi verdi, rispettivamente. È importante notare che se solo il capsula dati viene recuperati il raggio farà riferimento al raggio totale della cella come il raggio del corpo cellulare non potrebbe essere sottratta.</li>
		<li>Individuare i dati completati nel file "CleanedOuput.csv" nella directory delle immagini. Se solo un pezzo di dati è stato selezionato, il file sarà marcato "CleanedBodies.csv" o "CleanedCapsules.csv".</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

I punti critici di questa tecnica sono preparando la diapositiva di inchiostro di India e acquisendo le immagini del microscopio. Mentre l'algoritmo è stato testato con successo con una varietà di tecniche di diapositiva e immagine il protocollo raccomandato è descritto in questo manoscritto. Capsula del polisaccaride viene rilevata basato sull'esclusione delle particelle di inchiostro di India dal dominio della capsula come queste particelle sono troppo grandi per penetrare la rete di fibrille di polisaccaride. L'esc...

Cryptococcus neoformans è un lievito patogeno trovato ubiquistmente intorno al globo che è associato con la malattia umana soprattutto in popolazioni immunosuppressed. C. neoformans in particolare rappresenta una causa significativa del totale dei decessi annuali nell'Africa subsahariana, a causa di malattie infettive1. La manifestazione clinica principale dell'infezione criptococcica è meningoencefalite, che segue l'invasione del sistema nervoso centrale con i mezzi in macrofagi infetti (Trojan horse maniera) o traversate dirette della barriera sangue - cervello. C. neoformans esprime numerosi fattori di virulenza, compresa la possibilità di replicare a temperatura del corpo umano, attività ureasica, melanizzazione e la formazione di una capsula del polisaccaride2. Capsula del polisaccaride è composto di ripetizione glucuronoxylomannan e polimeri glucoronoxylomannangalactan e funzioni come una barriera protettiva contro fattori come lo stress ambientale e host le risposte immunitarie2.
Sebbene la dimensione della dimensione della capsula del polisaccaride criptococcica non è sempre stata associata con virulenza, c'è prova che è un fattore nella patogenesi2,3,4,5, 6,7. Taglia capsula è associato con la meningite patologia6, possa influenzare la capacità dei macrofagi di controllare Cryptococcus infezione5e può provocare la perdita di virulenza se assenti8. Quindi, capsula dimensione misurazioni sono comuni nella ricerca criptococcica, ma non c'è nessun fieldwide standard per un metodo di misurazione capsula.
Attualmente, c. neoformans polisaccaride capsula misurazione si basa su misurazioni manuali di immagini di microscopia, e i metodi esatti delle acquisizioni di misura e di immagine variano attraverso laboratori9,10, 11. Un immediato interesse per questo metodo è che alcuni studi richiedono l'acquisizione di migliaia di misurazioni individuali, che rende difficile il mantenimento di accuratezza e affidabilità. Inoltre, anche quando i risultati sono pubblicati, c'è spesso insufficiente descrizione del metodo di misurazione. Molte pubblicazioni non spiegano come le loro misure sono state ottenute, che piano focale è stato utilizzato, come hanno determinato la soglia per l'identificazione di capsula, se hanno usato il raggio o il diametro, se hanno utilizzato una misurazione o una media diversi, o altri dettagli. Alcune pubblicazioni solo stato loro metodo come programma che è stato utilizzato, ad esempio, "Adobe Photoshop CS3 è stato usato per misurare le cellule"11. Questa mancanza di standardizzazione e reportistica di dettaglio può fare la riproducibilità difficile se non impossibile. Differenze di vista umana, luminosità computer, impostazioni di microscopio, far scorrere l'illuminazione e altri fattori possono variare non solo tra gli individui, ma anche tra i campioni, considerando che i calcoli basati su rapporti di valori di intensità di pixel rimarrà costanti e applicabile tra i campioni. Questa tecnica è stata generata nel contesto di fornire una tecnica standardizzata, precisa, rapida e semplice per misurare le dimensioni di capsule per un campo in cui non c'era nessuno prima.
Come accennato in precedenza, l'algoritmo CHT è consolidata e gli script per rilevare automaticamente i cerchi sono stati scritti prima. Questo metodo migliora nelle due aree dove altri script sarebbe caduta breve. In primo luogo, rilevare semplicemente cerchi non è sufficiente, perché con le cellule criptococciche due distinti cerchi devono essere rilevate in relazione reciproca. Questo metodo specificamente rileva corpi cellulari all'interno di capsule, discrimina tra i due ed esegue calcoli solo sulle coppie di corpo-capsula pertinenti. In secondo luogo, anche quando seguendo il protocollo stesso, diversi investigatori finirà con diversi acquisito immagini. Consentendo il controllo di investigatore sopra ogni parametro algorithm, questo strumento può essere regolato per soddisfare una vasta gamma di metodi di acquisizione. Non c'è nessuna necessità di un ambito standardizzato, obiettivo, filtro e così via.
Questa tecnica può essere applicata facilmente a qualsiasi situazione in cui lo sperimentatore deve rilevare cerchi all'interno di un'immagine che contrastano con il loro background. Entrambi i cerchi più leggeri e più scuri che può essere rilevato il loro background, contati e misurato utilizzando questa tecnica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

Lo scopo di questa tecnica è quello di fornire un processo coerenza, preciso e maneggevole per un gran numero di misure di capsula del polisaccaride.
In primo luogo, un'immagine di soglia viene generata in base ai valori di intensità in modo univoco calcolato per ogni immagine. Quindi, cerchi vengono rilevati basato sul contrasto tra oggetto e sfondo utilizzando l'algoritmo di trasformazione di Hough cerchio (CHT) ben consolidata. Infine, rilevato cellulare capsule e corpi sono abbinati secondo le coordinate del centro e la dimensione del raggio, e i dati vengono esportati per l'utente in un foglio di calcolo gestibile.
I vantaggi di questa tecnica sono semplici ma significativi. Primo, perché questi calcoli vengono eseguiti da un algoritmo piuttosto che un essere umano sia di precisione e di affidabilità sono aumentati. Non c'è nessun declino nella precisione o affidabilità indipendentemente da quanti campioni vengono analizzati. In secondo luogo, questo approccio costituisce una potenziale procedura operativa standard per il campo di Cryptococcus invece la situazione attuale, dove la capsula misura varia da laboratorio. In terzo luogo, dato che misure capsule manuali sono lento e monotono, l'automazione consente misure rapide su grandi numeri di cellule di lievito che a sua volta facilita l'elevato throughput dati analisi e statistiche sempre più potenti.
Le limitazioni principali di questa tecnica provengono da come le funzioni di algoritmo. In primo luogo, l'algoritmo genererà solo cerchi. Mentre le cellule Cryptococcus e loro capsule assumono una morfologia circolare, sarebbe difficile applicare questa tecnica al rilevamento di oggetti non circolare. In secondo luogo, a causa di come vengono rilevati cerchi l'algoritmo CHT può rilevare enormi pseudo-cerchi basati sui bordi esterni di parecchi cerchi in cluster. Tuttavia, eventuali corpi cellulari travisati catturati all'interno del pseudo-cerchio di possono essere facilmente rilevati e rimossi dal set di dati risultante.
Questa tecnica è destinata a misurare le capsule di polisaccaride circolare di Cryptococcus specie basato su microscopia del campo luminoso dell'inchiostro di India; anche se potrebbe essere applicato ad altri contrasto base misure oggetto circolare.

Immagini in primo luogo sono ottenute mediante microscopia di inchiostro di India diapositive utilizzando un microscopio a campo chiaro accoppiato con una macchina fotografica (Figura 1A). È importante avere cellule separate e nella densità sufficientemente bassa non per sopraffare il campo di vista, anche quanto a utilizzare abbastanza macchia per creare contrasto tra cellule e sfondo. Come indicato nel protocollo, il numero esatto delle c...

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Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Misurazione automatica delle criptococcica capsula polisaccaridica di specie e corpo cellulare

Questa tecnica viene descritto un processore di immagine automatica in batch progettato per misurare i raggi di corpo e capsula del polisaccaride. Mentre inizialmente progettato per misurazioni capsule Cryptococcus neoformans , che il processore di immagine automatizzato può essere applicato anche ad altri rilevamento del contrasto basato di oggetti circolari.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

7.2K Views.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. Questa tecnica viene descritto un processore di immagine automatica in batch progettato per misurare i raggi di corpo e capsula del polisaccaride. Mentre inizialmente progettato per misurazioni capsule Cryptococcus neoformans , che il processore di immagine automatizzato può essere applicato anche ad altri rilevamento del contrasto basato di oggetti circolari.

Video: Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

Misura della γHV68 infezione nei topi

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

Arricchimento cellulare automatizzata di Citomegalovirus specifici linfociti T per le applicazioni cliniche che utilizzano il sistema di citochine cattura

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Saggio altamente sensibile per la misura dell&#39;attaccamento Arenavirus-cell

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Misura della T cellulare alloreattività Utilizzando Imaging Citometria a Flusso

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di High-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

Size Matters: Misurare il diametro di capsula in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

Misurazione della temperatura corpo del mouse utilizzando il termometro a infrarossi durante passiva anafilassi sistemica e la valutazione di allergia alimentare

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various pathologies such as cancer, atherosclerosis and diabetes. We have previously shown that dysfunction of the Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)/ Kelch-like erythroid cell-derived protein 1 (Keap1) signaling pathway leads to extreme ROS imbalance during cutaneous wound healing in diabetes. Since ROS levels are an important indicator of progression of wound healing, specific and accurate quantification techniques are valuable. Several in vitro assays to measure ROS in cells and tissues have been described; however, they only provide a single cumulative measurement per sample. More recently, the development of protein-based indicators and imaging modalities have allowed for unique spatiotemporal analyses. L-012 (C13H8ClN4NaO2) is a luminol derivative that can be used for both in vivo and in vitro chemiluminescent detection of ROS generated by NAPDH oxidase. L-012 emits a stronger signal than other fluorescent probes and has been shown to be both sensitive and reliable for detecting ROS. The time lapse applicability of L-012-facilitated imaging provides valuable information about inflammatory processes while reducing the need for sacrifice and overall reducing the number of study animals. Here, we describe a protocol utilizing L-012-facilitated in vivo imaging to quantify oxidative stress in a model of excisional wound healing using diabetic mice with locally dysfunctional Nrf2/Keap1.

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

We describe a non-invasive in vivo imaging protocol that is streamlined and cost-effective, utilizing L-012, a chemiluminescent luminol-analog, to visualize and quantify reactive oxygen species (ROS) generated in a mouse excisional wound model.

In Vivo Formazione immagine di specie reattive dell'ossigeno in un murino ferita modello

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...