Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riparazione e rigenerazione dei tessuti sulle associazioni tra le vie citoprotettive, lo stress ossidativo e la risposta di guarigione delle ferite. Il vantaggio principale di questa potente tecnica è che è possibile misurare le specie reattive dell'ossigeno in una ferita, in tempo reale, per determinare il loro impatto sulla rigenerazione dei tessuti. A dimostrare la procedura con me sarà Jennifer Kwong, un'assistente di ricerca nel mio laboratorio.
Utilizzare un glucometro per misurare la glicemia di ogni topo diabetico anestetizzato di otto-12 settimane. E usa un trimmer per capelli e una crema depilatoria per rimuovere i capelli dorsali dal primo animale. Utilizzare salviette alcoliche due volte per pulire la pelle esposta e drappeggiare l'animale in modo che sia esposta solo l'area chirurgica.
Quando l'alcol si è asciugato, utilizzare punzoni sterili da 10 millimetri di biopsia per creare due ferite a pieno spessore di 10 millimetri che si estendono attraverso il panniculus carnosus secondo una ben consolidata tecnica di guarigione della ferita adcisionale. Utilizzare un foglio di silicone spesso 0,5 millimetri con ritagli circolari da 10 millimetri per steccare le ferite e fissare i stint con suture di seta interrotte 4/0. Quindi posizionare i topi su un dissipatore di calore con monitoraggio fino al pieno recupero, prima di tornare alla sua gabbia individuale, fornendo asciugamani di carta come materiale di nidificazione aggiuntivo per due settimane.
Il giorno dopo, applicare o controllare sciocchezze piccolo gel di RNA interferente o piccolo gel Keap1 interferente sperimentale sulla parte superiore della ferita di ogni animale e avvolgere ogni busto con una medicazione trasparente del film per mantenere il gel in posizione lasciando gli arti liberi. Il terzo giorno dell'esperimento, caricare una siringa da un millimetro dotata di un ago calibro 27 con soluzione L-012 preparata al momento e avvolgere la siringa per proteggere la soluzione dalla luce. Per immaginare le ferite, rimuovere delicatamente la medicazione trasparente del film da ciascuno dei topi senza disturbare le ferite e posizionare i topi nella camera di imaging di un sistema di imaging a bioluminescenza.
Impostare l'afflusso del sistema di imaging e i livelli di ossigeno della camera di induzione su un litro al minuto e immaginare i topi per bioluminescenza e campo luminoso al basale. Successivamente, pulire gli addome con salviette alcoliche, quindi iniettare cinque milligrammi di soluzione L-012 per 200 grammi di peso corporeo, IP, in ogni topo una volta che l'alcol si è asciugato. Iniettare la soluzione L-012 senza disturbare le ferite sulla pelle dorsale è fondamentale, perché qualsiasi distorsione influenzerà la traiettoria di guarigione della ferita e l'interpretazione dei dati.
Assicurarsi che l'animale sia saldamente in recumbency dorsale prima dell'iniezione. Immediatamente dopo l'iniezione, riposizionare i topi nelle rispettive posizioni nella camera di imaging e immaginare gli animali per un minuto ogni quattro minuti in un periodo di imaging di 60 minuti, definendo la ferita di 10 millimetri come la regione di interesse per determinare il livello di specie reattive dell'ossigeno. Quindi posizionare i topi su una pastiglia termica con monitoraggio fino al pieno recupero prima di riportare gli animali nelle loro gabbie individuali.
Tre giorni dopo aver creato ferite bilaterali secondo il modello di ferita adcisionale stabilito, non si osserva bioluminescenza prima dell'iniezione di L-012. A seguito dell'iniezione intraperintoneale della soluzione L-012, la bioluminescenza si osserva nelle aree della ferita in cui vengono rilevate specie reattive dell'ossigeno. La registrazione della bioluminescenza per un minuto ogni quattro o cinque minuti nel corso di 60 minuti dimostra la saturazione bioluminescente della regione di interesse nel tempo, con il tempo di imaging ottimale per raggiungere la saturazione completa di L-012 osservata a circa 50 minuti.
La bioluminescenza in ogni regione di interesse della ferita prima e dopo l'iniezione di L-012 in piccoli RNA interferenti senza senso trattati o topi trattati con RNA interferente Keap1 può quindi essere calcolata dividendo il conteggio totale dell'intensità della luce per l'area. L'analisi delle sezioni del tessuto delle ferite del giorno 10 per confermare l'accuratezza della misurazione reattiva del livello delle specie di ossigeno mediante colorazione H&E rivela una ridotta infiltrazione cellulare in piccole ferite trattate keap1 interferenti rispetto a piccoli tessuti trattati senza senso interferenti, indicando una ridotta morfologia infiammatoria negli animali sperimentali trattati con gel. L'analisi dell'immuno-reattività di F4/80, un marcatore di macrofagi proteici sulle sezioni del tessuto della ferita, indica un numero ridotto di macrofagi in piccole ferite trattate keap1 interferenti rispetto a piccole ferite trattate senza senso interferenti, sottosogliendo ulteriormente la validità di questo metodo.
Quando si tenta questa procedura, assicurarsi di confermare che l'L-012 non è scaduto e di mescolare la soluzione in un luogo protetto dalla luce. Seguendo questa procedura, sonde mirate e metodi basati su immuno-test possono essere utilizzati per studiare la localizzazione subcellulare delle specie reattive dell'ossigeno e dei loro correlati, consentendo una rapida valutazione degli interventi e dei meccanismi che influenzano le statistiche redux delle ferite.
