Nós gostaríamos de reconhecer Anthony Bowen cujos slides foram usados como uma segunda comparação lado-a-lado humana, bem como Sabrina Nolan cujos slides foram usados como um terceiro lado-por-lado humano e segundo microscópio de comparação.

1. preparação de tinta nanquim Slide
<ol><li>Pipete 10 µ l de amostra criptocócica numa lâmina. Qualquer levedura circular irá funcionar, mas para este experimento H99 foi a única estirpe utilizada. Nota: Se a amostra for directamente a partir de meios de cultura, diluição 1:2 com PBS ou água pode ajudar a prevenir a tinta da Índia de aglutinação.</li>
	<li>Pipetar 2 µ l de mancha de tinta da Índia para a amostra e misture fisicamente empurrando a ponta da pipeta para a amostra e movendo-se em movimentos circulares até que a tinta da Índia aparece uniformemente distribuída.</li>
	<li>Coloque uma lamela sobre a amostra, pressionando a borda esquerda da lamela contra a superfície da lâmina, então delicadamente e uniformente abaixando o lado oposto da lamela da amostra.</li>
	<li>O slide para o ar deixe secar por 5 min.</li>
	<li>Aplica suavemente uma leve camada de verniz para fronteira lamela para formar um selo e preservar a mancha de tinta nanquim.</li>
</ol>2. Slide de imagem
<ol><li>Coloque slides em um microscópio de campo claro com um acessório de câmera e conversão de pixel-a-micron conhecido. Ajuste contraste, objectivos e filtros para que cápsulas de célula são claras e corpos celulares são bandas focadas, escuras. Nota: Vários filtros, objectivos e configurações de contraste vão trabalhar, mas recomenda-se um 20 x objetivo, Ph1 filtro e binning 2x2.</li>
	<li>Certifique-se que o campo de visão é denso mas não superpovoado com células criptocócica, com claro contraste entre a cápsula de célula e plano de fundo e devidamente concentrado com o corpo de célula visualizado como uma banda escura. Nota: O número exato de células para uma imagem ideal pode variar dependendo da amostra e o objetivo sendo usado. Os aspectos importantes são para células não sejam agrupados ou sobrepostos, que os aviões focal de célula não variam significativamente, e que há significativa Nanquim mancham claramente visível no plano de fundo (pelo menos 25% do campo).</li>
	<li>Salve imagens em um único diretório com títulos claros, como o algoritmo de medição será executado em imagens em um único diretório e os dados de saída serão organizados de acordo com os nomes dos arquivos de imagem.</li>
</ol>3. algoritmo Setup
<ol><li>Instalar a versão do Python 2.7 de</li>
	<li>Instalar bibliotecas python adicionais executando os comandos "pip install travesseiro" e "pip install openpyxl".</li>
	<li>Instalar o MATLAB, seguindo as instruções no</li>
	<li>Compilar a biblioteca python MATLAB, seguindo as instruções fornecidas no https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html.</li>
	<li>Baixe os três arquivos necessários incluídos em materiais suplementares a este manuscrito ("QCA.py", "Analysis2.m" e "TestRun.m"). Nota: Esses arquivos podem ser extraídos para qualquer local, mas todos os três devem estar no mesmo diretório.</li>
</ol>4. utilização do algoritmo
<ol><li>Execute o aplicativo clicando duas vezes em QCA.py. Nota: A aplicação pode levar alguns minutos para começar. O arquivo "QCA.py" contém a estrutura de programa que chama os arquivos ". m" para executar o algoritmo real.</li>
	<li>Siga as etapas descritas no programa.<ol>
<li>Entrada, o tipo de extensão de arquivos de imagem, precedido por um ponto e separados por ponto e vírgula (ex. ". TIF;. JPEG") em seguida clique no botão Enter .</li>
		<li>Escolha o diretório no qual os arquivos de imagem estão localizados clicando no botão Selecionar diretório e selecionando a pasta que contém as imagens.</li>
		<li>Gera a lista de arquivos de imagem no diretório clicando no botão Gerar lista de imagem . As imagens serão listadas na caixa de texto à direita. Revisar e assegurar que a lista é exacto e completo.</li>
		<li>Selecione uma imagem aleatória da lista para usar como uma visualização clicando no botão Selecionar imagem aleatória . Nota: Se a imagem for não é possível abrir devido a um erro de modo"imagem incorreta", o algoritmo ainda funcionará correctamente apesar de não exibir a imagem. Após a etapa 4.2.7, ainda exibirá a imagem de teste.</li>
		<li>Objetivo do microscópio e binning configurações de entrada. Se as configurações padrão não coincidem com o microscópio usado, selecione "Custom Pixel conversão" e a conversão de pixel-para-um para os arquivos de imagem de entrada. Uma vez selecionado, clique no botão Calcular conversão e assegurar que a conversão está correta de acordo com a caixa de texto à direita. Nota: Imagens representativas, mostradas na Figura 1 foram calculadas com 40 x ampliação e 2x2 binning selecionado.</li>
		<li>Parâmetros de algoritmo para a deteção do círculo de entrada.<ol>
<li>Entrada do raio máximo e mínimo detectável para a deteção da cápsula externa como as entradas de Min e Max cápsula Radius. Um intervalo menor permitirá obter resultados mais precisos.</li>
			<li>Entrada do raio mínimo e máximo detectável para detecção do corpo celular como as entradas de Min e Max corpo celular Radius. Nota: Todos os quatro dessas entradas devem ser números representando seus respectivos valores em pixels, de acordo com as imagens de origem.</li>
			<li>Mova os controles deslizantes de cápsula e sensibilidade do corpo celular para ajustar o limiar de sensibilidade do algoritmo. Uma baixa sensibilidade será rigorosa e reduzir a deteção do círculo positivo falso, mas também pode detectar círculos reais menos. Por outro lado, uma alta sensibilidade aumentará a taxa de detecção, mas também pode resultar em falsos positivos círculos. Nota: Resultados representativos foram obtidos com um raio mínimo de cápsula de 7 raio máximo de cápsulas de 45, raio de corpo mínimo de 4, raio máximo de corpo de 30, cápsula sensibilidade de 87 e a sensibilidade do corpo de 87.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Teste os parâmetros na imagem aleatoriamente selecionado clicando no botão Executar teste . O resultado será exibido no centro superior do programa, substituindo a imagem original. Se os resultados precisos, é recomendável para selecionar uma imagem aleatória adicional para tentar garantir que os parâmetros selecionados vão caber todas as imagens selecionadas também.<ol>
<li>Maximizar o número de corpos e cápsulas detectado e inspecionam visualmente se os círculos parecem caber corretamente. O número de corpos dentro de cápsulas detectados será exibido na caixa de texto à direita. Caso contrário, manipule os parâmetros de algoritmo até que os resultados são precisos. Nota: Os espesso círculos coloridos são apenas para ajudar com a visualização. Os círculos reais gerados para medição é uma curva matemática calculada pelo algoritmo HCT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Execute o algoritmo de detecção em todo o diretório de arquivos de imagem clicando no botão Iniciar análise . Cada imagem será analisada e o programa irá exibir "terminado" na caixa de texto para a direita quando todas as imagens foram analisadas.</li>
		<li>Clique no botão de partida e limpeza . Isto corresponder detectados corpos celulares para as cápsulas detectados que residem no e calcular o raio da cápsula verdadeiro subtraindo o corpo da cápsula. Nota: Se o algoritmo está sendo usado para detectar fluorescência ou outra situação em que apenas um círculo é detectado este passo é desnecessário. Em vez disso, clique os Corpos apenas puxar ou o botão de Cápsulas só puxar para coletar os dados para somente o azul ou só os círculos verdes, respectivamente. É importante notar que se apenas os dados da cápsula são recuperados o raio irá se referir o raio total da célula como o raio do corpo celular não poderia ser subtraído.</li>
		<li>Localize os dados concluídos no arquivo "CleanedOuput.csv" no diretório de imagens. Se apenas uma parte dos dados foi seleccionada, o arquivo será rotulado "CleanedBodies.csv" ou "CleanedCapsules.csv".</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508 (1985).</li><li>Rumbaugh, J., Pool, A., Gainey, L., Forrester, K., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Cryptococcal+Capsule+in+Pathogenesis+of+Cryptococcal+Meningitis.">The Role of Cryptococcal Capsule in Pathogenesis of Cryptococcal Meningitis.</a> Neurology. 80 (7), 007 (2013).</li><li>Bojarczuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Intracellular+Proliferation+and+Capsule+Size+Determines+Early+Macrophage+Control+of+Infection.">Cryptococcus neoformans Intracellular Proliferation and Capsule Size Determines Early Macrophage Control of Infection.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li><li>Robertson, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+Ex+Vivo+Capsule+Size+Is+Associated+With+Intracranial+Pressure+and+Host+Immune+Response+in+HIV-associated+Cryptococcal+Meningitis.">Cryptococcus neoformans Ex Vivo Capsule Size Is Associated With Intracranial Pressure and Host Immune Response in HIV-associated Cryptococcal Meningitis.</a> J Infect Dis. 209 (1), 74-82 (2014).</li><li>Araujo, G. d. e. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. J., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+CAP59+(or+Cap59p)+Is+Involved+in+the+Extracellular+Trafficking+of+Capsular+Glucuronoxylomannan.">Cryptococcus neoformans CAP59 (or Cap59p) Is Involved in the Extracellular Trafficking of Capsular Glucuronoxylomannan.</a> Eukaryot Cell. 3 (2), 385-392 (2004).</li><li>Guimar&#227;es, A. J., Frases, S., Cordero, R. J. B., Nimrichter, L., Casadevall, A., Nosanchuk, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+responds+to+mannitol+by+increasing+capsule+size+in+vitro+and+in+vivo:+Mannitol+impacts+the+structure+of+C.+neoformans+capsule.">Cryptococcus neoformans responds to mannitol by increasing capsule size in vitro and in vivo: Mannitol impacts the structure of C. neoformans capsule.</a> Cell Microbiol. 12 (6), 740-753 (2010).</li><li>Zaragoza, O., Fries, B. C., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Capsule+Growth+in+Cryptococcus+neoformans+by+Mammalian+Serum+and+CO2.">Induction of Capsule Growth in Cryptococcus neoformans by Mammalian Serum and CO2.</a> Infect and Immun. 71 (11), 6155-6164 (2003).</li><li>Rossi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Resistance+to+Fluconazole+on+Virulence+and+Morphological+Aspects+of+Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii+Isolates.">Impact of Resistance to Fluconazole on Virulence and Morphological Aspects of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Isolates.</a> Front Microbiol. 7, (2016).</li></ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Os passos críticos desta técnica estão preparando o slide de tinta nanquim e aquisição de imagens do microscópio. Enquanto o algoritmo foi testado com êxito com uma variedade de técnicas de slide e imagem o protocolo recomendado é descrito neste manuscrito. A cápsula de polissacarídeo é detectada com base na exclusão de partículas de tinta da Índia do domínio da cápsula como estas partículas são muito grandes para penetrar a rede de fibrila de polissacarídeo. Exclusão de Nanquim resulta em um círcul...

Cryptococcus neoformans é uma levedura patogênica ubiquitously encontrada ao redor do globo que está associado com doença humana principalmente em populações de imunossuprimidos. C. neoformans mais notavelmente representa uma importante causa de mortes anuais totais na África subsahariana devido a doenças infecciosas1. A principal manifestação clínica de infecção criptocócica é meningoencefalite, que segue a invasão do sistema nervoso central de transportes em macrófagos infectados (forma de cavalo de Troia) ou cruzamento direto da barreira sangue - cérebro. C. neoformans manifesta vários fatores de virulência, incluindo a capacidade de replicar na temperatura do corpo humano, a atividade da urease, melanização e formação de uma cápsula de polissacarídeo2. A cápsula de polissacarídeo é composta de repetição glucuronoxylomannan e glucoronoxylomannangalactan de polímeros e funções como uma barreira protetora contra fatores como estresse ambiental e de respostas imunes do hospedeiro2.
Embora o tamanho do tamanho da cápsula de polissacarídeo criptocócica não foi consistentemente associado com virulência, há provas de que é um fator na patogênese2,3,4,5, 6,7. Cápsula tamanho está associado a meningite patologia6, pode afetar a capacidade de macrófago para controlar a infecção de Cryptococcus 5e pode resultar em perda de virulência se ausente8. Daí, medições do tamanho da cápsula são comuns em pesquisa criptocócica, mas não há nenhum fieldwide padrão para um método de medição da cápsula.
Atualmente, c. neoformans polissacarídeo cápsula medida baseia-se na medição manual de imagens de microscopia, e os métodos exatos de aquisições tanto imagem e medição variam entre laboratórios9,10, 11. Uma preocupação imediata para este método é que alguns estudos exigem a aquisição de milhares de medições individuais, o que torna difícil a manutenção de precisão e confiabilidade. Além disso, mesmo quando os resultados são publicados, lá é muitas vezes insuficiente descrição do método de medição. Muitas publicações não explicam como foram obtidas as medidas, utilizou-se o que plano focal, como determinado o limiar para identificação da cápsula, se eles usaram o raio ou o diâmetro, eles utilizado uma medição ou a média de vários, ou outros detalhes. Algumas publicações único Estado seu método como qual programa foi usado, por exemplo, "Adobe Photoshop CS3 foi usado para medir as células"11. Esta falta de padronização e relatando detalhes pode dificultar a reprodutibilidade se não impossível. Diferenças na visão humana, brilho do computador, configurações do microscópio, deslize a iluminação, e outros fatores podem variar não só entre indivíduos, mas entre as amostras, Considerando que cálculos baseados em proporções de valores de intensidade do pixel permanecerá constantes e aplicáveis entre as amostras. Esta técnica foi gerada no contexto de fornecer uma técnica padronizada, precisa, rápida e simples para medir tamanhos de cápsulas para um campo em que não havia nenhum antes.
Como mencionado anteriormente, o algoritmo CHT é bem estabelecida, e scripts para detectar automaticamente os círculos foram escritos antes. Esse método melhora em duas áreas onde outros scripts que ficam aquém. Em primeiro lugar, simplesmente detectar círculos não é suficiente, porque com células criptocócica devem ser detectados dois círculos distintos em relação à outra. Esse método especificamente detecta corpos celulares dentro de cápsulas, discrimina entre os dois e realiza cálculos apenas sobre os pares de corpo-cápsula relevantes. Em segundo lugar, mesmo quando seguir o mesmo protocolo, diferentes investigadores vai acabar com diferentes adquiridas imagens. Permitindo o controle do investigador sobre cada parâmetro de algoritmo, esta ferramenta pode ser ajustada para coincidir com uma ampla gama de métodos de aquisição. Não há nenhuma necessidade para um escopo padronizado, objetivo, filtro e assim por diante.
Esta técnica pode ser aplicada facilmente a qualquer situação em que o investigador precisa detectar círculos dentro de uma imagem que contrastam com o fundo. Ambos os círculos mais leves e mais escuros do seu plano de fundo pode ser detectado, contados e medidos usando esta técnica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:875px;" width="875">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:213px;">India Ink</td>
			<td style="width:99px;">Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td style="width:119px;">261194</td>
			<td style="width:444px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-550-143</td>
			<td>25x75x1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Fisherfinest Premium Cover Glass</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-548-B</td>
			<td>22x22-1</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td>
			<td style="width:99px;">Sally Hansen</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>109 invisible</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">SAB Media</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Cryptotoccus neoformans</td>
			<td style="width:99px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">208821</td>
			<td>H99 strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Olympus AX70 Microscope</td>
			<td style="width:99px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">AX70TRF</td>
			<td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Qimaging Retiga 1300</td>
			<td style="width:99px;">Qimaging</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">MATLAB</td>
			<td style="width:99px;">MathWorks</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Python Programming Language</td>
			<td style="width:99px;">Python</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:213px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:99px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Most recent version recommended</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:213px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

O objetivo desta técnica é fornecer um processo consistente, preciso e gerenciável para grande número de medições da cápsula de polissacarídeo.
Primeiro, uma imagem de limiar é gerada com base nos valores de intensidade calculados exclusivamente para cada imagem. Em seguida, círculos são detectados com base no contraste entre o objeto e o plano de fundo usando o algoritmo de transformação de Hough de círculo (CHT) bem estabelecida. Finalmente, a célula detectado cápsulas e corpos são comparados de acordo com o tamanho do raio e as coordenadas do centro, e dados são exportados para o usuário em uma planilha gerenciável.
As vantagens desta técnica são simples, mas significativo. Primeiro, porque esses cálculos são executados por um algoritmo, ao invés de um ser humano tanto a precisão e a confiabilidade são aumentadas. Não há nenhuma diminuição na precisão ou confiabilidade independentemente de quantas amostras são analisadas. Em segundo lugar, esta abordagem estabelece um potencial o procedimento padrão para o campo de Cryptococcus em vez da situação atual onde cápsula medição varia de acordo com o laboratório. Em terceiro lugar, dado que a medição manual da cápsula é lentas e monótonas, automação permite medições rápidas em um grande número de células de levedura que por sua vez facilita a análise de dados de alta taxa de transferência e estatísticas cada vez mais poderosas.
As principais limitações desta técnica vem como as funções do algoritmo. Em primeiro lugar, o algoritmo só irá gerar círculos. Enquanto as células Cryptococcus e suas cápsulas assumem uma morfologia circular, seria difícil aplicar esta técnica para detecção de objeto não-circular. Em segundo lugar, devido a como os círculos são detectados o algoritmo CHT pode detectar enormes círculos pseudo baseados-se nas bordas exteriores de vários círculos em cluster. No entanto, qualquer deturpados corpos celulares, pego dentro do círculo de pseudo podem ser facilmente detectados e removidos os conjuntos de dados resultantes.
Esta técnica é destinada a medir as cápsulas circulares polissacarídeo de espécies de Cryptococcus baseado em microscopia de campo claro tinta nanquim; Embora poderia ser aplicada para outro contraste com base em medições objeto circular.

Imagens primeiro são obtidas pela microscopia de Nanquim slides usando um microscópio de campo claro, juntamente com uma câmera (Figura 1A). É importante que as células separadas e em densidade suficientemente baixa para não sobrecarregar o campo de visão, bem como como usar bastante mancha para criar contraste entre células e plano de fundo. Conforme o protocolo, o número exato de células para uma óptima imagem irá variar depende...

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Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Automáticos de medição de criptocócica espécie polissacarídeo cápsula e corpo celular

Esta técnica descreve um processador de imagem de lote automatizado projetado para medir raios de cápsula e corpo de polissacarídeo. Embora inicialmente projetado para medições de Cryptococcus neoformans cápsula o processador de imagem automático também pode ser aplicado a outra detecção de contraste à base de objetos circulares.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

7.2K visualizações.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. Esta técnica descreve um processador de imagem de lote automatizado projetado para medir raios de cápsula e corpo de polissacarídeo. Embora inicialmente projetado para medições de Cryptococcus neoformans cápsula o processador de imagem automático também pode ser aplicado a outra detecção de contraste à base de objetos circulares.

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Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Imagens de células vivas de Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Usando Microscopia lapso de tempo Automated

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Imunologia e Infecção

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

Medição de γHV68 Infecção em Camundongos

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

As células T de enriquecimento de células automatizado de citomegalovírus específico-para aplicações clínicas usando o Sistema de captura de citocinas

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Ensaio altamente sensível para a medição do Anexo de células Arenavirus

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Medição do T celular aloreactividade usando imagens de Citometria de Fluxo

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

Bioquímico celular-free fluorométrica ensaio enzimático para medição do elevado-throughput de peroxidação lipídica em lipoproteína de alta densidade

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualização da formação de biofilmes de Candida albicans , usando um dispositivo Microfluidic automatizada

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

Size Matters: Medição do diâmetro da cápsula em Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Mouse Body Temperature Measurement Using Infrared Thermometer During Passive Systemic Anaphylaxis and Food Allergy Evaluation

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature readings is common, and they have been proven to be accurate and invaluable in this regard. However, this method of temperature measurement requires the mice to be anesthetized in order to insert the probe without injury to the animal. This limits the ability to observe other phenotypes of the mouse simultaneously. In order to investigate other phenotypes while measuring temperatures, rectal probes are not ideal, and another method is desired. Here, we introduce a noninvasive method of temperature measurement that foregoes the requirement for mouse anesthesia while maintaining equal reliability to rectal probes in measuring body temperature. We use an infrared thermometer that detects body surface temperatures at ranges between 2 and 150 mm. This method of body temperature measurement is successful in reliably replicating temperature change trends during passive system anaphylaxis experiments in mice. We show that body surface temperatures are about 2.0 &#176;C lower than rectal probe measurements, but the degree of temperature drop follows the same trend. Furthermore, we use the same technique to observe mice in a food allergy model to evaluate temperature and activity levels simultaneously.

Here we present a new method to accurately measure body temperature differences in passive systemic anaphylaxis (PSA) and food allergy mouse models using an infrared thermometer. This procedure has been accurately duplicated in previous PSA results.

Medição de temperatura de corpo do mouse usando o termômetro infravermelho durante passiva anafilaxia sistêmica e avaliação de alergia alimentar

Mouse body temperature measurement is of paramount importance for investigating allergies and anaphylactic symptoms. Rectal probes for temperature ...

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various pathologies such as cancer, atherosclerosis and diabetes. We have previously shown that dysfunction of the Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (Nrf2)/ Kelch-like erythroid cell-derived protein 1 (Keap1) signaling pathway leads to extreme ROS imbalance during cutaneous wound healing in diabetes. Since ROS levels are an important indicator of progression of wound healing, specific and accurate quantification techniques are valuable. Several in vitro assays to measure ROS in cells and tissues have been described; however, they only provide a single cumulative measurement per sample. More recently, the development of protein-based indicators and imaging modalities have allowed for unique spatiotemporal analyses. L-012 (C13H8ClN4NaO2) is a luminol derivative that can be used for both in vivo and in vitro chemiluminescent detection of ROS generated by NAPDH oxidase. L-012 emits a stronger signal than other fluorescent probes and has been shown to be both sensitive and reliable for detecting ROS. The time lapse applicability of L-012-facilitated imaging provides valuable information about inflammatory processes while reducing the need for sacrifice and overall reducing the number of study animals. Here, we describe a protocol utilizing L-012-facilitated in vivo imaging to quantify oxidative stress in a model of excisional wound healing using diabetic mice with locally dysfunctional Nrf2/Keap1.

In Vivo Imaging of Reactive Oxygen Species in a Murine Wound Model

We describe a non-invasive in vivo imaging protocol that is streamlined and cost-effective, utilizing L-012, a chemiluminescent luminol-analog, to visualize and quantify reactive oxygen species (ROS) generated in a mouse excisional wound model.

Na Vivo Imagens de espécies reativas de oxigênio em um Murine ferida modelo

The generation of reactive oxygen species (ROS) is a hallmark of inflammatory processes, but in excess, oxidative stress is widely implicated in various ...