Il metodo ritmo è stato sviluppato e ottimizzato da vari membri del gruppo di Dupree (Università di Cambridge, UK) nel corso degli anni, e apprezziamo tutti i loro contributi. Questo lavoro è stato finanziato nell'ambito del DOE Joint BioEnergy Institute (http://www.jbei.org) sostenuto da u. s. Department of Energy, Office of Science, ufficio di biologico e ricerca ambientale, attraverso contratto DE-AC02-05CH11231 tra Lawrence Berkeley National Laboratory e il u. s. Department of Energy. Ringraziamo anche Thea Pick e Vy Ngo per aiuto per preparare i campioni di csla9 .

1. raccolta di materiale vegetale <ol><li>raccolto materiale vegetale fresco (~ 20 mg) e immediatamente immergerlo in etanolo al 96% (v/v) e incubare a 70 ° C per 30 min; questo disattiva qualsiasi parete cellulare presenti enzimi degradativi. Per materiale secco, iniziare dal passaggio 2. 
	Attenzione: L'etanolo è infiammabile. 
	Nota: Una singola foglia di staminali o Rosetta fornirà abbastanza materiale per l'analisi. Tuttavia, meno errori derivano se una maggiore quantità di tessuto è riunite e analizzate dal momento che questo è più facile da pesare e gestire.</li>
	<li>Registrare accuratamente tessuto tipo e Stadio di sviluppo, come struttura di polisaccaride varia con entrambi. Ad esempio, con thaliana di Arabidopsis (usato qui), fase il tessuto secondo i metodi da Boyes et al. 15 Nota: nel presente protocollo, abbiamo usato la metà inferiore del fusto infiorescenza, dove il primo anemofila è completamente allungato ma non ingiallimento.</li></ol>
 2. residuo insolubile preparazione dell'alcool (aria) <ol><li>preparare aria, seguendo il metodo di Mortimer et al. 9 o un altro metodo simile, al fine di produrre una polvere priva di zuccheri solubili, come saccarosio e amido.</li>
</ol> 3. Aliquotare e pre-trattamento dell'aria Nota: l'esatta quantità di aria necessaria per ogni campione dipenderà (a) l'abbondanza di polisaccaride di interesse nel materiale e (b) la dimensione media degli oligosaccaridi rilasciato da il GH. Il metodo aggiunge una singola molecola fluorescente alla fine di ogni oligosaccaride, riducendo così il numero degli oligosaccaridi determina la sensibilità dell'esperimento. Indicativamente, per glucomannano in Arabidopsis staminali digerito con GH5/GH26 (come descritto), 500 µ g è consigliato 11, considerando che per xilano in Arabidopsis staminali digerito con GH11, 100 µ g è raccomandato come Mortimer &#39; Studio s 3. <ol><li>pesare aria (10-15 mg) in una provetta da centrifuga 15 mL e aggiungere H 2 O a una concentrazione finale di 2 mg/mL. Vortice per ottenere una sospensione anche. Se questo è problematico, quindi utilizzare un omogeneizzatore di vetro per aiutare questo processo.</li>
	<li>Aliquot 500 µ g in microfuge tubi. Asciugare le aliquote utilizzando una centrifuga vuoto (Vedi la Tabella materiali) durante la notte a 30 ° C.</li>
	<li>Pre-trattamento aria con 1 M NaOH (20 µ l) per 1 h a temperatura ambiente; questo de-acetila i polisaccaridi e gonfia le microfibrille di cellulosa, interrompendo la struttura di biomassa e consentendo l'accesso di GH. 
	Nota: Questo passaggio può essere ignorato per polisaccaridi purificati. ATTENZIONE &#8211; forte acido/base.
	<ol><li>Includono un'aliquota per un controllo di aria no-enzima (trattati allo stesso modo come tutti i campioni, eccetto il passaggio 4.1. è escluso).</li>
	</ol></li> <li>Aggiungere 200 µ l di H 2 O e 20 µ l 1 M HCl per neutralizzare. Prova che il pH è ~ 6-7 rimuovendo 1 µ l e spotting sulla carta nastri di indicatore di pH.</li>
	Tampone di acetato di ammonio 1 M di aggiungere 50 µ l di <li>, pH 6.0 (o qualunque pH è appropriato per il GHs utilizzato nello studio) e H 2 O per ottenere un volume totale di 500 µ l. 
	Nota: Acetato di ammonio è usato poiché esso sublima durante l'essiccazione, e quindi non aggiunge ulteriori sale al campione. Un eccesso di sale può portare a scarsa forma di banda e ad alta risoluzione sul gel ritmo.</li>
</ol> 4. Idrolisi dell'aria con Glycosyl Hydrolases (GHs) Nota: come accennato nella discussione, la purezza del GHs è critica. Utilizzare solo heterologously espressi, enzimi purificate per affinità. Al ricevimento di ogni lotto dal produttore, idrolizzano le aliquote definite di substrato (ad es., 500 µ g aria) con aumento della quantità di GH durante la notte (ad esempio, 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µ l) (3 unità / µ l). Quando c'è un eccesso di GH, l'impronta PACE avrà un aspetto identico. Un eccesso di enzima è necessario per fornire un risultato riproducibile perché deve essere certo che la reazione di idrolisi si sta avvicinando l'endpoint.
<ol><li>Aggiungi un importo predeterminato (Vedi sopra) di mannanases (GH5 e GH26 11) per le aliquote di aria nel buffer da passo 3.5, nonché un positivo controllo (30 µ g di glucomannano di konjac) e un controllo negativo no-aria (enzima mix in un tubo vuoto). Vortice e spin poi brevemente a raccogliere la miscela di reazione nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Incubare per una notte a 37 ° C (oppure la temperatura appropriata per il GH di scelta) con movimentazione delicata (~ 100 giri/min).</li>
	<li>Fermare la reazione incubando a 95 ° C per 20 min. 
	Nota: Le chiusure Cap possono essere utilizzate per sigillare tubi del microfuge flip-top.
	<ol><li>Centrifugare utilizzando un panca superiore microfuge alla massima velocità per 10 min e conservare il surnatante.</li>
	</ol></li> <li>Risospendere il pellet in 250 µ l di H 2 O, centrifuga come sopra e conservare il surnatante.</li>
	<li>Combinare entrambi i surnatanti e asciugare in una centrifuga vuoto (Vedi la Tabella materiali) a 30 ° C (~ 3 h o durante la notte senza riscaldamento).</li>
</ol> 5. Preparazione di standard di oligosaccaride <ol><li>magazzino di 1 mM di preparare soluzioni in H 2 O di mannosio (uomo), mannobiose (Man 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (Man 4), mannopentaose (Man 5) e mannohexaose (Man 6), tutti i β, 1-4 collegati. Aliquotare e conservare a-20 ° C fino a quando richiesto.</li>
	<li>Preparare 3 diverse concentrazioni di un uomo 1-6 miscela combinando 1 µ l (Standard S1), 2 µ l (S2) o 5 µ l (S3) di tutti e sei.</li>
	<li>Secco in una centrifuga vuoto (Vedi Tabella materiali) a 30 ° C (~ 1 h).</li>
</ol> 6. Derivitization di oligosaccaridi <ol><li>preparare una soluzione stock di 0,2 M formiche (acido 8-amminonaftalen-1,3,6-trisulfonic) in H 2 O: acido acetico 17:3. Brodo caldo a 60 ° C per sciogliere completamente il solido. Conservare a-20 ° C, al riparo dalla luce, per 2-3 mesi.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di 0,2 M di 2-Picolina borano (2-PB) in DMSO. Questo è estremamente igroscopico, quindi immediatamente risospendere tutta polvere al ricevimento in DMSO. Aliquotare e conservare a-20 ° C per 1-2 anni. Disgelare aliquote come richiesto (conservare a 4 ° C per 2 settimane e poi scartare).</li>
	<li>Preparare il tampone di derivatizzazione di H 2 O: acido acetico: DMSO alle 17:03:20.</li>
	<li>Per ogni campione, aggiungere 5 µ l di formiche, 5 µ l di 2-PB e 10 µ l di tampone di derivatizzazione. Spin brevemente per raccogliere sul fondo del tubo, vortice accuratamente e poi girare di nuovo brevemente. Vedere la Figura 1 per reazione descrizione.</li>
	<li>Incubare i campioni durante la notte a 37 ° C, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Secco in una centrifuga vuoto (Vedi Tabella materiali) a 30 ° C (~ 2 h).</li>
	<li>Risospendere campioni e standard in 100 µ l 3 M urea. Conservare a-20 ° C, al riparo dalla luce fino a quando richiesto.</li>
</ol> 7. Preparazione del ritmo gel Nota: montaggio dell'attrezzatura di colata di gel dipenderà molto il marchio. Qui, abbiamo uSe un sistema di elettroforesi verticale (Vedi Tabella materiali), dotato di distanziali lastre di vetro di 18 x 24 cm e 1,5 mm.
<ol><li>Montare l'attrezzatura della colata gel per il produttore &#39; istruzioni s.</li>
	Buffer di ritmo di 10 x <li>make (1 M Tris-borato, pH 8.2) come segue: aggiungere 121,14 g di Tris-Base a ~ 400 mL di H 2 O e mescolare per sciogliere. Aggiustare il pH a 8.2 mediante aggiunta di acido borico solido (circa 60 g) e quindi rendere il volume fino a 1 L.</li>
	<li>Fare un 10% (p/v) di ammonio persolfato (APS) magazzino H 2 O. aliquota e memorizzare una volta alle aliquote di disgelo di-20 ° C., conservare a 4 ° C e scartare dopo 2 settimane.</li>
	<li>Fare e versare il gel di risoluzione. Per l'attrezzatura di cui sopra, 1 gel equivale a 50 mL. In una provetta da centrifuga 50 mL, mescolare H 2 O (20,2 mL), 5 mL di tampone per ritmo 10x, 24,6 mL 40% di acrilammide/Bis-acrilammide (29: 1 acrylamide:Bis). (Attenzione: tossici).
	<ol><li>Aggiungere 200 µ l di APS e 20 µ l di N, N, N, n-tetrametil-etilendiammina (TEMED). Invertire delicatamente per mescolare (per evitare di introdurre bolle d'aria). Versare il gel utilizzando un sierologici o altri pipetta di grande volume, a ~ 4 cm sotto la parte superiore delle lastre vetrate. Prestare attenzione alla possibilità di essere intrappolati nel gel le bolle d'aria. Se essi fare, smettere di versare e tilt/toccare il gel per liberarli.</li>
	</ol></li> <li>Il gel con isopropanolo (infiammabile cautela :) o, con attenzione, con H 2 O. Consenti gel per polimerizzare (20-30 minuti), poi versare lo strato superiore di overlay. Se è stato utilizzato isopropanolo, quindi lavare 2x con H 2 O. a secco liquido in eccesso con carta assorbente.</li>
	<li>Fare e versare il gel d'impilamento. Mix di 6,8 mL H 2 O, 1 mL di tampone di ritmo 10x, 2,8 mL acrilammide/Bis-acrilammide (Attenzione: tossici), 80 µ l APS e 8 µ l di TEMED in una provetta da centrifuga da 15 mL. Inverti per mescolare e overlay sopra gel polimerizzato di risoluzione. Inserire delicatamente pettini, evitando bolle d'aria intrappolamento sotto i denti del pettine.</li>
	<li>Consenti gel per polimerizzare (20-30 min.), avvolgere in tessuto umido e poi nella pellicola trasparente e conservare a 4 ° C fino a quando richiesto. Negozio con i pettini in luogo. 
	Nota: Ritmo gel possono essere memorizzati per un massimo di 2 settimane (anche se meno di una settimana è l'ideale), se sono mantenuti umidi.</li>
</ol> 8. In esecuzione di un ritmo Gel <ol><li>utilizzare un pennarello indelebile per etichettare le posizioni bene sul vetro, che aiuterà a tenere traccia di ordine di caricamento, e nell'individuare dove i pozzi sono una volta rimosso il pettine.</li>
	<li>Rimuovere il pettine. Riempire i pozzetti con buffer di ritmo di 1 x.</li>
	<li>Utilizzare un 10 µ l microsiringa per caricare 2 µ l di standard e campioni nei pozzetti. Evitare di utilizzare le corsie più esterne, che tendono a correre campioni poco.</li>
	<li>Montare la camera superiore dell'apparato gel-esecuzione e inserire il gel in un serbatoio in esecuzione raffreddato (~ 10 ° C) (° C 10) contenente 1 x ritmo tampone. Riempire la camera superiore con buffer di ritmo di 1 x.</li>
	<li>Accendere il potere ed eseguire il gel a 200 V (costante V) per 30 minuti e quindi aumento di tensione fino a 1000 V per 1h 40 min. Proteggere il gel dalla luce (ad esempio, eseguendo il wrapping serbatoi in sacchi neri della spazzatura). 
	Nota: Controllare i gel ~ 5 min dopo aver acceso la tensione e poi un altro 5 minuti dopo l'aumento della tensione fino a 1000 V. Se l'alimentatore è in grado di mantenere la tensione, poi c'è probabilmente un problema di buffer. Rimuovere il gel dal serbatoio. Rimontare l'alloggiamento superiore, verificare attentamente il posizionamento di tutte le guarnizioni. Un grande chip sul bordo superiore della lastra di vetro può impedire la piastra formando una buona tenuta con la guarnizione. Questo di solito può essere temporaneamente risolto aggiungendo una goccia di agarosio fuso 5% (p/v) per la parte scheggiata del vetro, prima di aggiungere l'alloggiamento superiore.</li>
</ol> 9. Visualizzazione di un gel di ritmo Nota: utilizzare un gel dotato di lungo-fluttuano UV bulbi nel transilluminatore e un filtro di emissione per la fotocamera che è adatto per il fluoroforo, qui 530 nm sistema di imaging. In alternativa, uno scanner laser può essere utilizzato anche, come descritto in Goubet 2.
<ol><li>Garantire il gel sistema di imaging è privo di polvere pulendo con tessuto umido privo di lanugine.</li>
	<li>Rimuovere il gel nel serbatoio di ritmo e mostra brevemente mentre il gel è ancora nelle lastre di vetro (&#60; 80 ms) per determinare se la parte anteriore della tintura è ancora sul gel.</li>
	<li>Aprire il gel utilizzando uno strumento di Cuneo e mentre il gel è ancora su un vetro piatto, utilizzare una taglierina della pizza per rimuovere sia il gel d'impilamento e, se la parte anteriore della tintura è ancora sul gel, il fondo del gel.</li>
	<li>Mettere ~ 5 mL H 2 O sulla superficie del transilluminatore e quindi trasferire il gel direttamente sul transilluminatore. Impostare il filtro UV 605 e accendere il transilluminatore UV longwave (Vedi Tabella materiali) utilizzando il software. 
	Nota: Il fluoroforo formiche qui utilizzato ha un'eccitazione/emissione di 353/520 nm.</li>
	<li>Prendere diverse immagini a diversi tempi di esposizione (per esempio, 100 ms a 10 s). Accertarsi che la luce UV è spento tra le immagini cliccando sul pulsante di luce UV (per disattivarlo) per evitare di degradare la fluorescenza. Non garantire che almeno 2 delle immagini bande saturi (il software di imaging di gel lo indicherà).</li>
	<li>Salva file come immagini ad alta-resolution.tif. 
	Nota: Immagini possono essere analizzati utilizzando il software fornito con il gel sistema di imaging, o utilizzando software di analisi di immagine liberamente disponibili, come ad esempio ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Vedere la sezione di risultati per una discussione di quantificazione.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

PACE è un metodo semplice per caratterizzare la struttura del polisaccaride. Può essere applicato a qualsiasi polisaccaride per cui sono noti GHs con attività caratterizzate, vedere numerosi esempi nella letteratura1,6,9,11. TT è stato applicato anche alla caratterizzazione di romanzo GHs12,13,18 e glicosiltrasferasi9, facendo uso di substrati definito polisaccaride e accettori.
Risultati riproducibili, interpretabili dipendono dai tre passaggi chiave. In primo luogo, il GHs utilizzato dovrebbe essere esente da contaminanti attività. Questo è il miglior ottenuta utilizzando solo heterologously espressi, purificate per affinità, enzimi. In secondo luogo, per la maggior parte degli esperimenti, è importante che l'idrolisi enzimatica dei substrati è al completamento. Questo farà sì che la stessa biomassa idrolizzata con il GH stesso dà la stessa impronta in ogni esperimento. Infine, ci dovrebbe essere un eccesso di fluoroforo nella reazione di derivatizzazione. Questo assicura che le estremità riducente disponibili siano etichettate al vicino al 100%. Questo si tradurrà in alta riproducibilità dei risultati, nonché i dati quantitativi.
Gel e reagente di qualità sono fondamentali per garantire dati riproducibili. Buffer di scarsa qualità, soprattutto del pH errato, aria bolle nel gel, e campioni con un eccesso di sale possono tutti fattore di risoluzione e ritenzione effetto di oligosaccaridi. Tuttavia, l'inclusione dei controlli consigliati descritti nella sezione protocollo e risultati permetteranno di risoluzione dei problemi.
RITMO è limitata dalla sua capacità di identificare gli oligosaccaridi. Per alcuni esperimenti, un'impronta digitale semplice è tutto ciò che è necessario. Tuttavia, per veramente quantificare la quantità di glucomannano in un campione di aria, ad esempio, l'identità di tutti gli oligosaccaridi rilasciati è richiesto, che è un processo che richiede tempo. Questo è più semplice per meno polisaccaridi complessi come xilano3. Poiché esistono pochi oligosaccaride standard disponibile in commercio, non essere sempre possibile o desiderabile per identificare tutte le bande. In questo caso, ritmo può fornire dati molto gratuiti alla spettrometria di massa (cioè, MALDI-CID9 o ESI-MS7e NMR6). Per questi metodi, è spesso utile fare una preparazione su larga scala, separare dalla cromatografia di esclusione dimensionale e quindi analizzare ciascuna frazione da entrambi PACE prima del MS o NMR. Mentre è stato segnalato che bande possono essere asportati e identificati dal MALDI-CID, in pratica abbiamo trovato che questo ha un basso tasso di successo (probabilmente a causa di interazioni di oligosaccaridi etichettati con il gel di acrilammide quando esposto ai raggi UV).
L'altra limitazione importante del ritmo è la velocità effettiva. Per ottenere una buona qualità, interpretabile gel con gli opportuni controlli, ogni gel avrà solo ~ 10 campioni sperimentali, e un ricercatore può aspettare eseguire ~ 4 ritmo gel al giorno. Recentemente, una versione del ritmo mediante elettroforesi capillare (CE) è stato sviluppato19, che permette la preparazione di campioni in piastre da 96 pozzetti. Esso è stato utilizzato con successo per caratterizzare le attività enzimatiche glycosyltransferase e polisaccaride strutture6,19, anche se richiede l'accesso a una macchina CE, che possa essere costosa da acquistare e mantenere.

Polisaccaride analisi mediante elettroforesi su gel (PACE) è un metodo per la caratterizzazione dettagliata di polisaccaridi1,2,3. Polisaccaridi di parete delle cellule vegetali sono notoriamente difficili da analizzare, e la maggior parte dei metodi richiedono attrezzature costose, operatori specializzati e grandi quantità di materiale purificato. Qui, descriviamo un semplice metodo per ottenere dettagliate informazioni strutturali polisaccaride, compresa la risoluzione di isomeri strutturali.
Comprensione pianta parete cellulare polisaccaride struttura è necessaria per quei ricercatori esplorare la biosintesi della parete cellulare di pianta o il ruolo della parete delle cellule vegetali in via di sviluppo di pianta. Recentemente, tuttavia, è diventato interessante per un più ampio gruppo di ricercatori a causa del fuoco sull'utilizzo di biomasse vegetali (essenzialmente la parete cellulare) come materia prima per produrre biocarburanti e prodotti biochimici4composizione parete cellulare vegetale. Ad esempio, efficiente saccarificazione enzimatica di questo materiale richiede una comprensione dettagliata delle strutture polisaccaride, affinché cocktail enzimatico ottimizzato può essere selezionato5.
PACE ha diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi che lo rendono ideale per l'analisi rapida di glycan complesse strutture. In primo luogo, non richiede purificazione del polisaccaride in questione, come è richiesto per la soluzione dello stato a risonanza magnetica nucleare (NMR)6. In secondo luogo, il ritmo può risolvere isomeri strutturali, a differenza di spettrometria di massa (MS, ad es., matrix-assistita laser desorption/ionization (MALDI) e ionizzazione electrospray (ESI)), che può anche essere difficile da eseguire mediante cromatografia liquida (LC) 7. in terzo luogo, il ritmo è molto sensibile, con risoluzione bassa-picomole, a differenza di cromatografia di strato sottile (TLC) o cromatografia su carta. Infine, non richiede costose attrezzature o specialista conoscenza, come è il caso per MS, NMR e LC.
Il metodo di ritmo si basa sulla specificità degli enzimi di glicosil idrolasi (GH), che prendono di mira alcuni legami glicosidici in una miscela di polisaccaridi. Quando l'enzima GH agisce sulla catena polisaccaride, rivela una riduzione fine che può quindi essere chimicamente derivatizzati, in questo caso con un'etichetta fluorescente. La mangiavano parte del campione è pertanto sottoposta a rendering non rilevabile da questo metodo. Gli oligosaccaridi con etichettati vengono quindi separati in un gel di acrilammide grande formato tramite l'elettroforesi. Questo dà un'eccellente risoluzione di molecole molto simili, ad esempio, i trisaccaridi Glc-uomo-uomo e uomo-Glc-Glc avrà un diverso Rf.
RITMO è stato usato estesamente per caratterizzare xilano diverse strutture attraverso pianta specie8, per identificare glycosyltransferase mutanti di Arabidopsis6,9,10,11 , per eseguire analisi di glycosyltransferase9e caratterizzare nuovi GH attività12,13. Abbiamo anche recentemente ha utilizzato per caratterizzare mannan della parete cellulare lievito (mensa e Mortimer, in preparazione). Qui descriviamo un metodo per la caratterizzazione di struttura della pianta parete cellulare glucomannano, basata su precedenti rapporti11,14.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Oligosaccaharide Standards&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS 3458-28-4</td><td></td></tr><tr><td>Mannobiose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 14417-51-7</td><td></td></tr><tr><td>Mannotriose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 28173-52-6</td><td></td></tr><tr><td>Mannotetraose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 51327-76-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannopentaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-35-5</td><td></td></tr><tr><td>Mannhexaose</td><td>Megazyme</td><td>CAS: 70281-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Glucomannan (Konjac; Low Viscosity)</td><td>Megazyme</td><td>P-GLCML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other specialty chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid</td><td>(Molecular probes) Thermo</td><td>A350</td><td></td></tr><tr><td>2-picoline borane</td><td>TCI</td><td>B3018</td><td></td></tr><tr><td>40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis)</td><td>Bio-rad</td><td>1610146</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Specialty Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel casting kit</td><td>Hoefer</td><td>SE660 kit</td><td>18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers</td></tr><tr><td>Cooling recirculating water bath&amp;nbsp;</td><td>Hoefer</td><td>RCB20-plus 115v</td><td>Needs to be able to maintain temperature at ~10 C</td></tr><tr><td>G:Box Chemi XRQ Imaging System</td><td>Syngene</td><td>05-GBOX-CHEMI-XRQ</td><td>Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs</td></tr><tr><td>High Voltage Power Pack</td><td>Thermo</td><td>EC1000XL</td><td>1000V&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum centrifuge(Speedvac)</td><td>Savant</td><td>SPD131</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Gel electrophoresis system</td><td>Hoefer</td><td>SE660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Glycosyl hydrolases&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lab supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning)</td><td>VWR</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel imaging software ( Genesys)</td><td>Syngene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

structural characterization of mannan cell wall polysaccharides in plants using pace

Polisaccaridi di parete delle cellule vegetali sono notoriamente difficili da analizzare, e la maggior parte dei metodi richiedono attrezzature costose, operatori specializzati e grandi quantità di materiale purificato. Qui, descriviamo un semplice metodo per ottenere dettagliate informazioni strutturali polisaccaride, compresa la risoluzione di isomeri strutturali. Analisi di polisaccaride tramite elettroforesi del gel (PACE), materiale della parete cellulare vegetale è idrolizzato con glicosil idrolasi specifici per il polisaccaride di interesse (ad esempio, mannanases per mannan). Gel di poliacrilammide di grande formato vengono quindi utilizzati per separare gli oligosaccaridi rilasciati, che sono stati etichettati fluorescente. Gel possono essere visualizzati con un gel modificato sistema di imaging (Vedi Tabella materiali). L'impronta di oligosaccaride risultante sia paragonabile qualitativamente o, con la replica, quantitativamente. Sollevatore e ramificazione informazioni può essere stabilite utilizzando ulteriori glicosil idrolasi (ad es., mannosidases e galactosidases). Mentre questo protocollo descrive un metodo per analizzare la struttura di glucomannano, può essere applicato a qualsiasi polisaccaride per cui esistono caratterizzato glicosil idrolasi. In alternativa, può essere utilizzato per caratterizzare nuovi glicosil idrolasi utilizzando substrati definito polisaccaride.

Qui vi mostriamo un gel di ritmo esempio eseguito per ogni protocollo, insieme alla descrizione di assistervi nell'interpretazione dei dati e risoluzione dei problemi, e questo è seguito da una guida generale per successo ritmo gel interpretazione13,16. Un gel rappresentativo di un ritmo standard è illustrato nella Figura 2analisi del contenuto di mannano parete cellulare ed è descritto lane di corsia.
Standard Corsie 1, 2 e 3 mostrano una scaletta di oligosaccaridi acquistati in commercio (Man1- Man6) a 5 (S1), 10 (S2) e 50 (S3) pmol concentrazione. Quando si riceve un nuovo lotto di un oligosaccaride commerciale, è importante controllare la purezza su un gel. Molti oligosaccaridi, particolarmente tetrasacccharides e più a lungo, può avere una contaminazione significativa con oligosaccaridi di altri gradi di polimerizzazione (DPs), come mostrato qui per Man6 (contrassegnati con *). Mentre la quantificazione di un gel, è importante avere almeno 3 concentrazioni degli standard, poiché è necessario per il calcolo della curva standard. Calcolo della curva standard può anche essere utile per garantire che la reazione di derivatizzazione è essenzialmente al completamento. Standard di concentrazioni note consentire confronti tra gel e un controllo utile per qualità di separazione e derivatizzazione.
Controllo positivo Corsia 4 Mostra una digestione mannanasi di glucomannano di konjac. Glucomannano di konjac è disponibile commercialmente, e mentre non ha la stessa struttura che, ad esempio, è trovato in Arabidopsis, serve a due scopi. In primo luogo, è un controllo importante per la digestione enzimatica. Il ricercatore deve stabilire che cosa un substrato commerciale digerito con loro GHs di scelta sembra quando digerito a completamento (cioè, un vasto eccesso di GH viene aggiunto alla reazione). Se in futuro esperimenti il modello cambia, questo può indicare sia una perdita di attività o contaminazione dello stock GH. In secondo luogo, serve come controllo per la reazione di derivatizzazione in presenza di sali di enzima e buffer. Se le norme sembrano buone, ma il controllo positivo è scarso, quindi questo potrebbe indicare che un componente della reazione di idrolisi è inibitorio per la derivatizzazione.
Wild type (WT) Arabidopsis gambo aria + mannanasi cocktail (GH5 + GH26) Lane 5 Mostra l'impronta di ritmo di uno stelo di Arabidopsis WT (confronta con riferimenti11,14).
csla9 Arabidopsis gambo aria + mannanasi cocktail (GH5 + GH26) Lane 6 Mostra l'impronta del ritmo dello stelo da un Arabidopsis pianta carente i principali spettacoli mannano sintasi11del gambo. Confrontare il WT e controllo negativo le impronte digitali. Mentre la maggior parte del mannan è assente in questa pianta, rimane una piccola quantità, come testimoniano le intensità di banda ridotto per tutti gli oligosaccaridi mannanasi-derivato questo è sintetizzato da ulteriori mannano sintasi (CSLA2, 3)11.
Controllo negativo - enzima solo Lane 8 mostra bande sul gel che non sono specifiche che derivano da contaminanti nella mannanasi cocktail e dovrebbero essere esclusi dall'analisi (contrassegnati con *).
Controllo negativo - WT aria solo Lane 9 Mostra bande sul gel che non sono specifici e devono essere esclusi dall'analisi (contrassegnati con *).
Controllo negativo- csla9 Aria solo Lane 10 Mostra bande sul gel che non sono specifici e devono essere esclusi dall'analisi (contrassegnati con *).
Pino legno aria + mannanasi cocktail (GH5 + GH26) Corsia 7 Mostra l'impronta di ritmo di legno di pino, che contiene galactoglucomannan. Questo ha chiaramente un diverso modello di oligosaccaridi rilasciati per Arabidopsis, grazie alla sua struttura diverso.
Controllo negativo - pino aria solo Lane 11 Mostra bande sul gel che non sono specifici e devono essere esclusi dall'analisi (contrassegnati con *).
Interpretare un gel di ritmo è relativamente semplice, ma richiede la consapevolezza dei seguenti punti. Per dati affidabile, si raccomanda di effettuare ritmo su almeno 3 indipendentemente coltivati biologica replica, e si consiglia di eseguire almeno 2 tecnici replicati su ogni replica biologico. I comandi descritti sono fondamentali per l'interpretazione, come fasce non specifiche devono essere escluse. Si consiglia inoltre di caricamento di campioni in un ordine diverso sui gel di replicare, per escludere effetti derivanti dall'illuminazione irregolare del transilluminatore. Accurata interpretazione richiede analisi delle fasce che non sono saturi. Poiché alcune impronte oligosaccaride possono contenere entrambi polisaccaridi abbondanza molto alta e bassa, si consiglia di analizzare le esposizioni multiple del gel stesso. Gli standard possono essere utilizzati per normalizzare tra immagini diverse.
Per alcuni tipi di esperimenti, può essere desiderabile per quantificare l'importo del polisaccaride nella preparazione aria. Mentre è possibile quantificare un gel di ritmo, richiede conoscenza dell'esatta identità molecolare di ogni oligosaccaride rilasciato dal GHs e dove si trova il ritmo gel. Questo attualmente non è completamente noto per mannan, ma è stato determinato per altri polisaccaridi ad esempio xilano3. Gli standard forniscono un modo di normalizzazione tra gel, anche quando non si esegue la quantificazione e così vi assisterà in ogni analisi semi-quantitativa o qualitativa.
Individuare la struttura di oligosaccaridi individuali può essere raggiunto utilizzando cocktail di GHs. sequenziale aggiunta di ulteriore GHs può rivelare informazioni dettagliate sui collegamenti e sostituzioni di oligosaccaridi rilasciati (per esempio, l'aggiunta di β - 1,4 - glucosidasi che agisce all'estremità non riducente rivelerà quali oligosaccaridi nella miscela contengono tale funzionalità). Enzimi disponibili includono galactosidases, glucuronidases e glucosidasi (Vedi il database di Chriss16 per ulteriori informazioni); vedere Hogg, d. et al. 17 come un esempio.
Il protocollo di cui sopra può essere utilizzato per caratterizzano l'attività del GHs sconosciuto. In questo caso, una biomassa definito, come Arabidopsis staminali o konjac glucomannan, dovrebbe essere utilizzato per schermata il GHs sconosciuto13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig1.jpg"> 
Figura 1 : Questo Mostra lo schema per la derivatizzazione fluorescente di oligosaccaridi con formiche. Per l'ultima volta da Goubet2.<a href="//ecsource.jov href=""></a href="//ecsource.jov>e.com/files/ftp_upload/56424/56424fig1large.jpg"target = blank" &gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56424/56424fig2.jpg"> 
Figura 2 : Gel rappresentante ritmo mostrando l'impronta di mannano da Arabidopsis, pino e un mutante di Arabidopsis (csla9) che ha alterato la biosintesi di mannano. AlR è idrolizzato con un cocktail di mannanasi, e gli oligosaccaridi rilasciati sono stati derivatizzati con un fluoroforo. Gli oligosaccaridi sono stati separati mediante elettroforesi in base a dimensione, forma e carica. Una scaletta di manno-oligosaccaridi (Man1-6) è indicata per aiutare a identificare la relativa mobilità di oligosaccaridi rilasciati, e un'idrolisi di mannano purificato (derivato da konjac) è indicata come controllo positivo. * = fasce non specifiche. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56424/56424fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Un protocollo per l'analisi strutturale dei polisaccaridi mediante elettroforesi su gel (APCE), utilizzando mannano come esempio, è descritto.

Caratterizzazione strutturale di Mannan polisaccaridi di parete cellulare nelle piante usando passo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

structural-characterization-mannan-cell-wall-polysaccharides-plants

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K Views.  Joint BioEnergy Institute. Un protocollo per l'analisi strutturale dei polisaccaridi mediante elettroforesi su gel (APCE), utilizzando mannano come esempio, è descritto.

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Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

Combinazione di Raman Imaging e analisi multivariata per la visualizzazione di lignina, cellulosa e emicellulosa nella parete cellulare delle piante

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Ricerca

Biochimica

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Il sequenziamento di Plant parete Heteroxylans Utilizzando enzimatica, chimica (metilazione) e (Spettrometria di Massa, Risonanza Magnetica Nucleare) tecniche fisiche

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Chimica

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

Completa l&#39;analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte I: lignina

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Biologia

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Completa l&#39;analisi della composizione delle pareti cellulari delle piante (biomassa lignocellulosica) Parte II: Carboidrati

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

Immunolocalizzazione fluorescente delle proteine arabinogalactane e delle pectine nella parete cellulare dei tessuti vegetali

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Biologia dello sviluppo

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

Oligo Profiling di massa (OLIMP) di polisaccaridi extracellulari

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profiling Glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Chiarire la struttura e la presenza dei glicani utilizzando la profilazione dei polimeri microarray

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

Autore in primo piano: Protocollo MAPP – Avanzamento dell'analisi dei glicani 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

Microarray Polymer Profiling (MAPP) per l'analisi dei glicani ad alto rendimento

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...

Caratterizzazione strutturale di Mannan polisaccaridi di parete cellulare nelle piante usando passo

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