Questo protocollo può essere utilizzato per preparare materiali fungini e vegetali per la risonanza magnetica nucleare allo stato solido, o NMR, e la polarizzazione nucleare dinamica, o DNP, esperimenti per la caratterizzazione di biosistemi complessi. Questa tecnica ci permette di studiare i biomateriali a un livello di risoluzione atomica nel loro ambiente nativo, ad esempio, in intere cellule. L'acquisizione di informazioni strutturali ad alta risoluzione sui materiali fungini contribuirà allo sviluppo di farmaci antifungini.
Il metodo fornisce informazioni sulla composizione e la struttura dei carboidrati complessi nelle pareti cellulari fungine e può essere applicato a molti organismi ricchi di carboidrati, tra cui piante, funghi, alghe e batteri. Alcuni investigatori possono lottare con la contaminazione fungina nelle loro colture cellulari. Il mio consiglio è di sterilizzare accuratamente il mezzo e le attrezzature prima dell'uso per prevenire questa contaminazione.
Questa dimostrazione aiuterà gli investigatori con poca esperienza nella coltura NMR o cellulare a imparare come implementare queste tecniche nei sistemi fungini e vegetali. Per preparare un mezzo di crescita liquido non etichettato, sciogliere 6,5 grammi di estratto di lievito peptone destrosio o polvere YPD in 100 millilitri di acqua distillata, quindi autoclavare la soluzione risultante per 25 minuti a 134 gradi Celsius. Per preparare un mezzo di crescita solido senza etichetta, aggiungere 6,5 grammi di polvere di agar YPD a 100 millilitri di acqua distillata e autoclavare il mezzo per 25 minuti a 121 gradi Celsius, prima di raffreddare il mezzo a circa 50 gradi Celsius.
Quindi, trasferire da 13 a 15 millilitri del mezzo di crescita solido fuso in singole piastre di Petri di plastica sterile e posizionare immediatamente i coperchi sui piatti. Per preparare il mezzo di crescita liquido etichettato carbonio-13, etichettato azoto-15, regolare un volume di 100 millilitri di mezzo minimo contenente isotopi a un pH di 6,6 con acido o base, se necessario. Successivamente, sciogliere i sali elencati nella tabella in 100 millilitri di acqua distillata, aggiungere al carbonio-13, al mezzo di crescita liquido etichettato azoto-15 e autoclavare la soluzione risultante per 25 minuti a 121 gradi Celsius.
Quando la soluzione si è raffreddata a temperatura ambiente, aggiungere 100 microlitri di oligoelementi soluzione all'intero volume di carbonio-13, mezzo minimo etichettato azoto-15. Per far crescere i materiali fungini, utilizzare un anello inoculato per trasferire una piccola quantità di funghi dallo stoccaggio su una piastra YPD e coltivare il fungo per due giorni in un incubatore Celsius di 30 gradi. Alla fine dell'incubazione, utilizzare un nuovo anello inoculante per trasferire un bordo fungino in crescita attiva sul mezzo di crescita liquido etichettato carbonio-13, etichettato azoto-15, e posizionare la coltura a 30 gradi Celsius e 220 rotazioni al minuto per tre o cinque giorni in un incubatore di scuotimento.
Quando grandi quantità del fungo coprono il fondo del pallone e galleggiano nel liquido, raccogliere i funghi per centrifugazione e scartare il supernatante. Idratare il pellet con una soluzione appropriata e utilizzare le forcep per raccogliere circa 0,5 grammi del pellet ben idratato per le analisi NMR e DNP. Quindi, mescolare il materiale rimanente con una soluzione di glicerolo al 20% in un tubo conico e posizionare il campione fungino a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.
Per preparare l'A.fumigatus per l'analisi NMR allo stato solido, utilizzare prima un sacchetto di dialisi con un taglio del peso molecolare di 3,5 kilodalton per dializzare il campione fungino etichettato da 0,5 grammi di carbonio-13, etichettato azoto-15 contro un litro di tampone fosfato 10 millimolare a quattro gradi Celsius per tre giorni per rimuovere piccole molecole dal mezzo di crescita. Al termine della dialisi, trasferire il campione in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione e imballare da 70 a 80 milligrammi della pasta campione uniformemente etichettata al carbonio-13 e ben idratata in un rotore di biossido di zirconio di quattro millimetri. Utilizzare un'asta metallica per spremere delicatamente e ripetutamente il campione, usando la carta per assorbire l'acqua in eccesso.
Quindi, limitare saldamente il rotore e inserire il campione nello spettrometro per la caratterizzazione NMR allo stato solido. Per preparare l'A.fumigatus per l'analisi DNP, aggiungere 100 microlitri di matrice DNP in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri per campione fungino etichettato carbonio-13 e sciogliere 0,7 milligrammi di agente polarizzante in ogni tubo per formare una soluzione di calcio radicale da 10 millimolare. Dopo aver vortice per due o tre minuti per garantire che i radicali siano completamente sciolti nella soluzione, immergere 10 milligrammi di carbonio dializzato-13, campione fungino etichettato azoto-15 in 50 microlitri della soluzione di agente polarizzante e utilizzare un pestello e una malta per macinare delicatamente la miscela per garantire la penetrazione dei radicali nelle pareti cellulari porose.
Aggiungere altri 30 microlitri della soluzione radicale al pellet macinato per idratare ulteriormente il campione fungino e imballare il pellet in un rotore di zaffiro da 3,2 millimetri. Spremere leggermente e rimuovere il solvente DNP in eccesso come dimostrato e aggiungere una spina in silicone da 3,2 millimetri per prevenire la perdita di idratazione. Quindi, aggiungere il rotore a uno spettrometro NMR per esperimenti di routine o uno spettrometro DNP per la misurazione dello spettro potenziato da DNP sotto irradiazione a microonde.
Per preparare i materiali vegetali per gli studi DNP, utilizzare una lama di rasoio per tagliare il materiale vegetale etichettato in uniforme carbonio-13 in pezzi da uno a due millimetri. Utilizzare un mortaio e un pestello per macinare i pezzi in particelle più piccole fino a quando la polvere finale non ha un aspetto omogeneo. Aggiungere 40 microlitri di soluzione di massa radicale da 10 millimolare al materiale vegetale e macinare leggermente il campione per altri cinque minuti per garantire una miscelazione omogenea con il radicale.
Idratare il campione macinato con altri 20 microlitri di soluzione di calcio radicale e imballare il campione di piante equilibrate in un rotore di zaffiro da 3,2 millimetri per l'analisi DNP. Quindi, inserire una spina in silicone per evitare la perdita di idratazione e caricare il campione sullo spettrofotometro DNP. L'etichettatura isotopica migliora sostanzialmente la sensibilità NMR e consente di misurare una serie di spettri di correlazione bidimensionali carbonio-13-carbonio-13 e carbonio-13-azoto-15 per analizzare la composizione, l'idratazione, la mobilità e l'imballaggio dei polimeri per la loro integrazione per la costruzione di un modello tridimensionale di architettura della parete cellulare.
Se i segnali off-diagonali sono difficili da ottenere nello spettro 2D carbonio-13-carbonio-13, potrebbe essersi verificata un'etichettatura statistica. I due picchi di carbonio-13 a 96 e 92 parti per milione sono segnali caratteristici di carbonio-1 di glucosio. Pertanto, le loro forti intensità negli spettri quantitativi di polarizzazione diretta carbonio-13 misurati con lunghi ritardi di riciclo di 35 secondi indicano tipicamente il predominio di piccole molecole a causa di dialisi o lavaggio incompleti.
Con campioni ben etichettati, le correlazioni a lungo raggio possono essere ulteriormente misurate per rilevare le prossimità spaziali delle biomolecole e per costruire un modello strutturale delle pareti cellulari intatte. Questa tecnica consente di esplorare la funzione di struttura in molti materiali naturali e ingegnerizzati, facilitando studi futuri su biomateriali ricchi di carboidrati e polimeri funzionalizzati. Poiché alcuni funghi possono causare infezioni o malattie sistematiche nell'uomo, assicurarsi di gestire materiali fungini in una cappa di flusso laminare per la protezione e ridurre al minimo l'esposizione.
