Riconosciamo che finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (7 ° PQ/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) e il Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 e SFB889).

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti qui sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per il benessere animale tedesco.
Nota: La linea temporale e i passaggi principali del protocollo sono illustrati nella Figura 1.
1. preparati
<ol><li>
Preparare le seguenti soluzioni.
	<ol>
<li>Preparare DMEM + per la coltura di astrociti MD poligonali: DMEM con 10% FCS, 100 U penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina.</li>
		<li>Preparare NB + H per la coltura di astrociti stellari: neurobasal medio con 5 ng/mL HBEGF, 1x supplemento B-27, integratore di glutammina x 1, 100 U penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. Nota: Le aliquote di più alte concentrazioni di HBEGF possono essere preparate e conservate a-20 ° C per essere aggiunto al mezzo quando necessario.</li>
		<li>Preparare il supporto di dissezione (10 mM HEPES in HBSS).</li>
		<li>Preparare aliquote di 6-7 mL di tripsina-EDTA 0,05% e 6-7 mL 0,25% tripsina-EDTA in provette da 15 mL. Questi possono essere conservati a-20 ° C e scongelati a bagnomaria a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno prima di iniziare il protocollo, cappotto piatti di coltura del tessuto-trattati di 10 cm con 5 mL di 0,04% polyethylenimine (PEI) ogni.</li>
	<li>Il giorno successivo, rimuovere il PEI e lavare i piatti con acqua deionizzata, distillata due volte. Aggiungere 12 mL di DMEM + ad ogni piatto e pre-equilibrare nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per almeno 30 min prima celle di placcatura.</li>
	<li>Preparare l'area di dissezione: In una cappa a flusso laminare dissezione, posizionare due 10cm di Petri riempito con il mezzo di dissezione su ghiaccio. Per ogni area del cervello ad essere isolato (ad es., corteccia, ippocampo), preparare un 15-tubo riempito di 14 mL liquido di dissezione e tenere sul ghiaccio. Spray strumenti di dissezione (forbice, Dumont #3 e #5 pinze) con etanolo al 70% e posto accanto al microscopio di dissezione nella cappa.</li>
</ol>2. rat o dissezione del cervello del Mouse
Nota: Entrambi i topi e ratti possono essere utilizzati. Gli animali più vecchi di P8 possono anche essere utilizzati (abbiamo testato fino a P12), ma rimuovendo le meningi diventerà sempre più difficile. Inoltre, il rendimento delle celle e salute diminuirà, poiché le cellule cerebrali da più vecchi animali avranno formato intricati processi e connessioni che possono rompersi durante la dissociazione del tessuto, che conduce alla morte aumentata delle cellule. Corticale preparazioni sono descritte qui, ma possono essere utilizzati anche altre regioni del cervello.
<ol><li>Posto 0.05% tripsina-EDTA in bagnomaria a 37 ° C.</li>
	<li>Eutanasia di animali (ratti incinti per E19 cuccioli o animali di P0-P8) alzando lentamente la concentrazione di CO2 e isolare i cervelli. La procedura seguente richiede una tecnica sterile.</li>
	<li>
Se lavora con tessuto embrionale, innanzitutto rimuovere gli embrioni dall'utero e aprire i sacchi embrionali, quindi immediatamente tagliato le teste con le forbici. Quando tutti i capi sono tagliati fuori, trasferirli nel mezzo di dissezione pre-raffreddata.
	<ol>
<li>Una volta che le teste sono sommersi nel mezzo, aprire il cranio (entrambi sono molto morbidi in animali giovani) e pelle con forcipe e pizzico fuori il cervelletto. Leva con attenzione il resto del cervello fuori dal cranio. Nota: Due-quattro E19 embrioni resa abbastanza tessuto per almeno otto piatti di 10cm di astrociti corticali placcati a 500.000 cellule per piatto del giorno di dissezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per i cuccioli appena nati o più anziani, tagliare le teste con le forbici e isolare i cervelli di medialmente tagliando la pelle in linea retta dalla parte posteriore della testa fino alla punta del naso. Tirare la pelle da parte e accuratamente tagliata il cranio sinistra e destra, poi ascensore le ossa fino. Tagliare il cervelletto, e leva il resto del cervello fuori dal cranio. Nota: Due o tre cuccioli di P0-P8 resa abbastanza tessuto per almeno otto piatti di 10cm di astrociti corticali placcati a 500.000 cellule per piatto del giorno di dissezione.</li>
	<li>Separare la corteccia dalla struttura sottostante del midbrain. Collocare la pinza entro la fessura longitudinale tra gli emisferi, quindi spostare la pinza tra le strutture del midbrain corteccia di un emisfero (perpendicolare alla fenditura longitudinale) pizzicare ogni emisfero gratis.</li>
	<li>Utilizzando le pinze, rimuovere tutte le meningi da ogni emisfero (e l'ippocampo), quindi separare ippocampi. Se gli astrociti ippocampali sono necessari, è possibile spostare ogni ippocampo in una provetta da 15 mL riempita con 14 mL di terreno di dissezione su ghiaccio.</li>
	<li>Rimuovere ulteriori aree dalla corteccia di ciascun emisfero se regioni specifiche sono necessari (ad es., corteccia frontale). Tagliare qualsiasi tessuto corticale da utilizzare per la generazione di astrociti in pezzi non più grande di 1 mm3. Raccogliere tutti i pezzi di tessuto corticale in un tubo separato 15 mL riempito con il mezzo di dissezione su ghiaccio.</li>
</ol>3. tessuto digestione e dissociazione
<ol><li>Una volta che tutti i pezzi di tessuto sono raccolti, attendere per loro di stabilirsi sul fondo del tubo, quindi aspirare tanto supporto, per quanto possibile.</li>
	<li>Aggiungere 2-3 mL di tripsina EDTA 0,05% utilizzando una pipetta sierologica e incubare le provette in bagnomaria a 37 ° C per 20 min. Nota: Rilasciare tutti tripsina-EDTA dalla pipetta a mescolare i pezzi di tessuto e permettono di depositare ancora rapidamente.</li>
	<li>Aspirare accuratamente la tripsina-EDTA, lasciando pezzi di tessuto in come poco liquido possibile, nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di mezzo di dissezione pre-raffreddata per lavare via il restante tripsina-EDTA. Pipettare al lato della parte superiore del tubo per ottenere i pezzi di tessuto di miscelazione.</li>
	<li>Aspirare il mezzo di dissezione e lasciare i pezzi di tessuto in come poco liquido possibile. Ripetere questo passaggio di lavaggio con il mezzo di dissezione pre-raffreddata altre due volte.</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, aggiungere 1 mL di DMEM + (riscaldato a temperatura ambiente) utilizzando un puntale di 1.000 µ l e triturare il tessuto pipettando su e giù senza introdurre bolle. Nota: È importante evitare la produzione di bolle, come questo può cambiare il pH della soluzione, a cui gli astrociti sono molto sensibili.</li>
	<li>Collocare un colino di cella di 100 µm nell'apertura di un tubo da 50 mL e pre-bagnato il filtro con 4,5 mL di pre-raffreddata DMEM +.</li>
	<li>Pipettare 1 mL di sospensione di tessuto dissociata sul filtro cella e aggiungere un altro 4,5 mL pre-raffreddato DMEM + per lavare le cellule attraverso il filtro delle cellule.</li>
</ol>4. cellula placcatura per arricchimento di astrociti di passaggio
<ol><li>Contare le celle, ad esempio, da diluire 10 µ l della sospensione delle cellule con 10 µ l di blu di trypan e pipettaggio il mix su un emocitometro.</li>
	<li>Piastra di 500.000 cellule in 12 mL DMEM + per ogni piatto di 10 cm. Nota: DMEM + è utile per la crescita astrocytic, tanto più rispetto per i neuroni o microglia. Durante l'agitazione, le forze fisiche che agiscono sulle lamelle di vetro all'interno di pozzi sono molto più forti di quelli che agiscono sui piatti 10 cm (senza lamelle). Se le cellule sono scossi su piastre da 24 pozzetti, diventano insalubri o morire. Solo piastra astrociti su piastre da 24 pozzetti dopo l'agitazione.</li>
	<li>Mantenere colture cellulari nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per sette giorni.</li>
	<li>Il giorno 6, il giorno prima agitazione e passaggio di cellule, preparare le piastre rivestite con PEI cultura come descritto nel passaggio 5.</li>
</ol>5. cellule di passaggio
<ol><li>
Il giorno prima di passaggio, cappotto piastre per colture cellulari con 0,04% PEI.
	<ol>
<li>Per immunocitochimica, trasduzione virale o trasfezione di plasmide, utilizzare piastre 24 pozzetti o 6 pozzetti (ciascuno contenente un sterilizzato 12 mm o 25 mm vetrino coprioggetti, rispettivamente).</li>
		<li>Sterilizzare le lamelle di vetro tramite incubazione in etanolo al 70% per almeno 1 h, quindi lavare tre volte in acqua deionizzata, distillata prima di mettere i coprioggetti nei pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere almeno 70 µ l 0,04% PEI al vetrino coprioggetti 12mm in piastre da 24 pozzetti e 600 µ l 0,04% PEI al vetrino coprioggetti 25mm in piastre da 6 pozzetti.</li>
		<li>Per Western blot o l'analisi di RNA-Seq, i piatti di 10cm già contenente le celle dopo la dissezione possono continuare ad essere utilizzati. Piatti solo bisogno di essere scosso, quindi le cellule vengono lavate con PBS 1X e trattate con NB + H (non si trasferiscono a nuovi piatti).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno in vitro (DIV) 7 dopo la dissezione, collocare i piatti di 10 cm con cellule in DMEM + su un agitatore di laboratorio nell'incubatrice e scuotere i piatti a 110 giri/min per 6 h.</li>
	<li>Lavare il PEI da lamelle rivestite con acqua deionizzata, distillata due volte. Aggiungere mezzo NB + H alle piastre (500 µ l per pozzetto per piastre da 24 pozzetti e 2 mL per pozzetto per piastre da 6 pozzetti). Pre-equilibrare le piastre nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 mentre tremano i piatti di 10 cm, o per almeno 30 min.</li>
	<li>20-30 min prima della fine dello scuotimento 6h, pre-riscaldare 1 x PBS, DMEM + NB + H e 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C nel bagno d'acqua.</li>
	<li>Dopo 6 h di agitazione, togliere i piatti di cultura shaker e sostituire immediatamente il mezzo (che contiene microglia, oligodendrociti e neuroni scosso-off) con 10 mL pre-riscaldati 1X PBS per ogni piatto. Nota: È importante aspirare immediatamente il vecchio mezzo contenente cellule indipendente per evitare le cellule non-astrocytic ricollegare.</li>
	<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 3 mL pre-riscaldato tripsina-EDTA per ogni piatto. Incubare ogni piatto per 4 min in incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Nota: Se la preparazione dei campioni per Western blot o RNA-Seq, non aggiungere tripsina-EDTA. Al contrario, sostituire il PBS con 12 mL pre-riscaldati NB + H, dopo di che culture possono essere posizionate indietro nell'incubatrice.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL pre-riscaldato DMEM + per la tripsina-EDTA 3 mL in ogni piatto, dispensare le cellule fuori il piatto utilizzando una pipetta sierologica di 5ml e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 50 mL. Nota: Pipetta direttamente dalla parte inferiore del piatto - il piano del piatto dovrebbe diventare più chiaro come staccano le cellule. Solo uso contenenti siero medio (al posto di DMEM +), come siero inattiva la tripsina.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 3.220 x g a 20 ° C per 4 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL pre-riscaldati NB + H.</li>
</ol>6. cella placcatura per finale Astrocyte culture
<ol><li>Contare le celle.</li>
	<li>Piastra di 20.000 cellule per pozzetto in piastre da 6 pozzetti (in 2 mL di terreno di NB + H per pozzetto) o 5000 cellule per pozzetto in piastre da 24 pozzetti (in media 500 di NB + H di µ l per pozzetto).</li>
	<li>Mantenere le colture di cellule nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 fino ad ulteriore trattamento o analisi.</li>
	<li>Cambio di mezzo il mezzo una volta a settimana. Nota: In ambienti basso-sostanza nutriente, astrociti interrompere proliferano ma qualsiasi restante microglia prolifereranno (sebbene nella nostra esperienza, nessun microglia apparvero nelle culture AWESAM). Lo scambio mezza il mezzo una volta a settimana previene arricchimento di qualsiasi microglia potenzialmente rimanenti8, e le monocolture rimangano sane per almeno tre settimane.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Quattro passi all'interno del protocollo sono fondamentali: 1) preparare la concentrazione di HBEGF e precisamente 5 ng/mL, poiché piccoli aumenti nella concentrazione possono condurre a culture immature, ad esempio, 10 ng/mL HBEGF de-differenziare astrociti4; 2) evita bolle nelle soluzioni che contengono il tessuto o le cellule, che possono cambiare il pH e ostacolare la salute di astrociti; 3) pre-riequilibranti media per raggiungere il pH ottimale e la temperatura per la crescita sani...

Astrociti influenzano la funzione del cervello attraverso supporto trofico, flusso sanguigno, segnalazione sinaptica e plasticità e comunicazione intercellulare - che sono tutti meccanismi che centro attorno i processi astrocitari sottili. Il protocollo AWESAM descritto qui permette lo studio di questi processi senza interferenze da parte di neuroni e glia altri, che è utile per esempio, perché l'espressione di molte proteine e anche di Ca2 + segnalazione si sovrappongono in tutto cellula cerebrale diversa tipi. Inoltre, questo metodo supera i limiti delle tecniche precedentemente disponibili. In particolare, il nostro protocollo prevede in vivo-come morfologia (astrociti stellari con sottili processi) e l'espressione genica in un veloce, facile e modo a buon mercato.
Morfologia delle cellule, espressione genica e molti altri processi normativi sono direttamente influenzati dall'ambiente. In una piastra di coltura, si riferisce a fattori rilasciati dalle cellule circostanti, ma anche il mezzo in cui le cellule sono cresciute. Per gli astrociti, HBEGF precedentemente è stata segnalata per indurre una morfologia stellari1 ma è stato anche trovato per-differenziare gli astrociti2. Tuttavia, concentrazioni più basse di HBEGF più successivamente sono state utilizzate per la generazione di più nel vivo-come astrociti come identificato tramite sequenziamento di RNA in due differenti protocolli3,4. Inoltre, la morfologia del astrocyte cambia con la composizione media, indipendentemente dal protocollo4: Neurobasal medio con una bassa concentrazione di HBEGF è ottima per la coltivazione di astrociti stellari, mentre altre composizioni medie (ad es., contenenti siero DMEM) produrre cellule poligonali (anche negli astrociti appena isolati di immunopanning).
Il protocollo AWESAM sormonta gli svantaggi delle precedenti tecniche per la coltivazione del astrocyte monocolture4. Tecniche precedenti per la coltivazione di monocolture Astrocita presentano i seguenti svantaggi: morfologia poligonale, che è inconsueta che gli astrociti stellari in vivo (MD metodo)5; la lunghezza e il costo del protocollo (preparazione astrociti da prende le cellule staminali pluripotenti indotte tre mesi e richiede molti reagenti, compresi costosi fattori di crescita)6; la bassa quantità di materiale (metodo immunopanning)3; e la de-differenziazione degli astrociti e requisito di una matrice 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. al contrario, fornisce il protocollo AWESAM: in vivo-come la morfologia (astrociti stellari con sottili processi); un veloce, facile e a buon mercato metodo; grandi quantità di materiale; e di più nel vivo-come espressione genica rispetto a immunopanned e astrociti di MD. Inoltre, cultura 2D consente lo studio di segnalazione di Ca2 + e riciclaggio in sottili processi e in eventi vicino la membrana della vescicola (ad es., microscopia TIRF non è possibile in 3D culture).
Il metodo di MD è stato ampiamente utilizzato dalla sua pubblicazione nel 19805, che offre una tecnica semplice e veloce per monocolture Astrocita poligonale. In breve, il metodo di MD comporta crescita cellule cerebrali misto nel siero fetale di vitello (FCS)-contenente DMEM, seguita da agitazione passaggi che arricchiscono per gli astrociti (come tutte le altre cellule di cervello tipi staccano dal piatto) e ulteriormente cultura sullo stesso supporto. DMEM completate con FCS è utilizzato per molti altri tipi di cellule, che vanno dai fibroblasti e adipociti a linee cellulari tumorali differenti, tutti condividono la morfologia poligonale esibita da astrociti MD nella cultura. Fino al primi anni 20007, piccolo pensiero era stato rilasciato ai media su misura per gli astrociti, in particolare per favorire la loro tipica morfologia stellare trovato in vivo. Un protocollo pubblicato nel 2011 raggiungere tale morfologia stellare: chiamato il metodo immunopanning, impiega medium senza siero, ottimizzato per la coltura di astrociti3. Utilizzando questo metodo, le cellule cerebrali di recente isolate sono esposti a una serie di piatti rivestiti con anticorpi destinati a proteine di superficie delle cellule di tipo-specific cella, per arricchire per gli astrociti. Nonostante il più in vivo-come profilo di morfologia ed espressione dei astrocytes immunopanned, la maggior parte degli studi in vitro si basa ancora sul metodo Astrocita MD. Il metodo di MD è semplice e veloce, mentre il metodo di immunopanning comprende più lunghe e complesse fasi il primo giorno della cultura (ad esempio lunghi periodi di digestione degli enzimi, attenta stratificazione delle soluzioni di diversa densità, immunopanning stesso, e diversi centrifugazione passi - tutto prima di placcatura). Tuttavia, utilizzando il mezzo più specializzato, il metodo AWESAM offre sia la velocità del metodo MD e lo in vivo-come la morfologia del protocollo immunopanning.
Nel complesso, il protocollo AWESAM è utile per studiare più in vivo-come astrociti in 2D monocolture isolate da neuroni e glia altri (come precedentemente caratterizzati4 immunostainings, immunoblots e sequenziamento di RNA). Esso consente lo studio dei processi astrocitari sottili e fornisce grande accessibilità per la visualizzazione di Ca2 + segnalazione spontanea ed eventi vicino la membrana (ad es., ripreso da microscopia TIRF).

<table><tbody><tr><td>0.05% trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>warm in 37 &amp;ordm;C waterbath before use</td></tr><tr><td>0.25% trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>warm in 37 &amp;ordm;C waterbath before use</td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50X stock</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100X stock</td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>without L-glutamine</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>HBEGF</td><td>Sigma</td><td>4643</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>1X</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m nylon cell strainer</td><td>BD</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory shaker</td><td>Heidolph</td><td>Rotamax 120&amp;nbsp;</td><td>use inside cell culture incubator</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

Il AWESAM (un low-costo easy stellate unstrocyte metodo) protocollo comporta un modo veloce, semplice e poco costoso per generare grandi quantità di in vivo-piace monocolture di astrociti di topo e di ratto : Le cellule cerebrali possono essere isolate da diverse regioni del cervello, e dopo una settimana di coltura delle cellule, cellule non-astrocytic sono scrollate di dosso inserendo i piatti di cultura su un agitatore per 6 h nell'incubatrice. Gli astrociti rimanenti sono quindi attraversati in nuove piastre con un mezzo di Astrocita-specifici (chiamato NB + H). NB + H contiene basse concentrazioni di eparina-legante EGF-like growth factor (HBEGF), che viene utilizzato al posto del siero in mezzo. Dopo essere cresciuto in NB + H, gli astrociti AWESAM hanno una morfologia stellare e processi impercettibili e funzionalità. Inoltre, questi astrociti hanno più in vivo-come l'espressione genica di astrociti generati dai metodi precedentemente pubblicati. CA2 + imaging, dinamiche della vescicola e altri eventi vicino la membrana possono essere studiati così nello bene processi astrocytic in vitro, ad esempio, utilizzando cellule vive confocale o microscopia TIRF. In particolare, gli astrociti AWESAM inoltre esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione simile a astrociti in vivo.

Gli astrociti che sono co-coltivati con i neuroni e sviluppati in NB + medium appaiono stellari dopo 2 settimane di cultura (Figura 2). Oltre a NB + medio, gli astrociti co-coltivati sono anche esposti a fattori sconosciuti del neurone-derivato che probabilmente contribuiscono alla loro sopravvivenza e la morfologia. Al contrario, gli astrociti MD coltivati in DMEM + come monocolture (dopo aver agitato fuori altri tipi di cella prima del passaggio) appaiono p...

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Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Il protocollo AWESAM descritto qui è ottimo per la coltura di astrociti murini in isolamento da altre cellule del cervello in modo veloce, semplice ed economica. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione, morfologia e gene expression profili simili a astrociti in vivo.

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

8.3K Views.  University of Oxford. Il protocollo AWESAM descritto qui è ottimo per la coltura di astrociti murini in isolamento da altre cellule del cervello in modo veloce, semplice ed economica. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione, morfologia e gene expression profili simili a astrociti in vivo.

Video: Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Ricerca

Neuroscienze

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modellazione Astrocitoma Patogenesi<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Utilizzo corticale astrociti o cellule staminali neurali da condizionale, topi geneticamente ingegnerizzati

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of oxygen and glucose, which causes energy failure and neuronal death. After an ischemic stroke insult, astrocytes become reactive and proliferate around the injury site as it develops. Under this scenario, it is difficult to study the specific contribution of astrocytes to the brain region exposed to ischemia. Therefore, this article introduces a methodology to study primary astrocyte reactivity and proliferation under an in vitro model of an ischemia-like environment, called oxygen glucose deprivation (OGD). Astrocytes were isolated from 1-4 day-old neonatal rats and the number of non-specific astrocytic cells was assessed using astrocyte selective marker Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and nuclear staining. The period in which astrocytes are subjected to the OGD condition can be customized, as well as the percentage of oxygen they are exposed to. This flexibility allows scientists to characterize the duration of the ischemic-like condition in different groups of cells in vitro. This article discusses the timeframes of OGD that induce astrocyte reactivity, hypertrophic morphology, and proliferation as measured by immunofluorescence using Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Besides proliferation, astrocytes undergo energy and oxidative stress, and respond to OGD by releasing soluble factors into the cell medium. This medium can be collected and used to analyze the effects of molecules released by astrocytes in primary neuronal cultures without cell-to-cell interaction. In summary, this primary cell culture model can be efficiently used to understand the role of isolated astrocytes upon injury.

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex event in which the specific contribution of astrocytes to the affected brain region exposed to oxygen glucose deprivation (OGD) is difficult to study. This article introduces a methodology to obtain isolated astrocytes and study their reactivity and proliferation under OGD conditions.

Monitoraggio del Astrocyte reattività e proliferazione in Vitro in condizioni ischemiche-come

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through multipotent intermediates. This technique not only holds great promises in the field of disease modeling, as it allows to convert, for example, fibroblasts for patients suffering neurodegenerative diseases into neurons, but also represents a promising alternative for cell-based replacement therapies. In this context, a major scientific breakthrough was the demonstration that differentiated non-neural cells within the central nervous system, such as astrocytes, could be converted into functional neurons in vitro. Since then, in vitro direct reprogramming of astrocytes into neurons has provided substantial insights into the molecular mechanisms underlying forced identity conversion and the hurdles that prevent efficient reprogramming. However, results from in vitro&#160;experiments performed in different labs are difficult to compare due to differences in the methods used to isolate, culture, and reprogram astrocytes. Here, we describe a detailed protocol to reliably isolate and culture astrocytes with high purity from different regions of the central nervous system of mice at postnatal ages via magnetic cell sorting. Furthermore, we provide protocols to reprogram cultured astrocytes into neurons via viral transduction or DNA transfection. This streamlined and standardized protocol can be used to investigate the molecular mechanisms underlying cell identity maintenance, the establishment of a new neuronal identity, as well as the generation of specific neuronal subtypes and their functional properties.

Here we describe a detailed protocol to generate highly enriched cultures of astrocytes derived from different regions of the central nervous system of postnatal mice and their direct conversion into functional neurons by the forced expression of transcription factors.

Isolamento e riprogrammazione neuronale diretta degli astrociti di topo

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

Estrazione efficiente di astrociti e microglia dal midollo spinale del topo adulto

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

Autore in primo piano: Isolamento delle cellule gliali dal midollo spinale del topo adulto 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Generating a Primary Culture of Astrocytes from a Rat Pup Brain

Source: Mili&#263;evi&#263;, K., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63483">Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> J. Vis. Exp. (2022)
The video demonstrates a technique for culturing primary astrocytes from the rat cortex. The cortex is mechanically dissociated to obtain a homogeneous glial cell suspension, which is then plated on polypeptide-coated plates to promote selective proliferation of astrocytes. Subsequently, the astrocytes are enzymatically dissociated from the plates and transferred to fresh media, allowing the culture of pure astrocytes.

Generare una coltura primaria di astrociti dal cervello di un cucciolo di ratto

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Primary cell culture preparation

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JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

A Simple Technique to Isolate and Culture Murine Astrocytes

Source: Wolfes, A. C., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56092">Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates a simple method to culture murine astrocytes in isolation from other brain cells. During culturing, by using astrocyte-specific media and inhibiting the adherence of non-astrocytic cells, the method selectively cultures astrocytes. These cultured astrocytes exhibit stellate morphology with fine processes.

Una tecnica semplice per isolare e coltivare gli astrociti murini

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Rat or Mouse Brain Dissection
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Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Isolamento e la coltura di astrociti corticali mouse

Modellazione Astrocitoma Patogenesi

Monitoraggio del Astrocyte reattività e proliferazione in Vitro in condizioni ischemiche-come

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

Isolamento e riprogrammazione neuronale diretta degli astrociti di topo

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Generare una coltura primaria di astrociti dal cervello di un cucciolo di ratto

Una tecnica semplice per isolare e coltivare gli astrociti murini