Reconocemos que la financiación del Consejo Europeo de investigación (FP7/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) y la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 y SFB889).

Todos los experimentos con animales descritos aquí fueron realizados siguiendo las directrices para el bienestar animal alemán.
Nota: El cronograma y pasos principales del Protocolo se ilustran en la figura 1.
1. preparaciones
<ol><li>
Preparar las siguientes soluciones.
	<ol>
<li>Preparar DMEM + cultivo poligonales astrocitos MD: DMEM con 10% FCS, 100 de U de penicilina y 100 de μg/mL estreptomicina.</li>
		<li>Preparar NB + H para el cultivo de astrocitos estrellados: neurobasal medio con 5 ng/mL HBEGF, 1 x suplemento B-27, suplemento de glutamina x 1, 100 de U de penicilina y estreptomicina μg/mL 100. Nota: Alícuotas de concentraciones más altas de HBEGF pueden ser preparados y almacenados a-20 ° C en el medio cuando sea necesario.</li>
		<li>Preparar el medio de la disección (10 mM HEPES en HBSS).</li>
		<li>Preparar alícuotas de 6-7 mL de tripsina-EDTA 0.05% y 0.25% tripsina-EDTA de 6-7 mL en tubos de 15 mL. Estos pueden ser almacenados a-20 ° C y descongelan en un baño de agua de 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>El día antes de iniciar el protocolo de capa de platos tratados con cultivo de tejidos de 10 cm con 5 mL de 0.04% polietilenimina (PEI).</li>
	<li>Al día siguiente, quitar el PEI y lavar los platos con agua destilada desionizada dos veces. Añadir 12 mL de DMEM + a cada placa y equilibrar previamente en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 durante al menos 30 minutos antes de las células de la galjanoplastia.</li>
	<li>Preparar la zona de disección: en campana de flujo laminar la disección, coloque dos platos de Petri de 10 cm llenos de medio de disección en el hielo. Para cada área del cerebro que aislado (por ejemplo, corteza, hipocampo), preparar un tubo de 15 llenado medio de disección de 14 mL y conservar en hielo. Herramientas de disección (tijeras finas, Dumont #3 y #5 pinzas) del aerosol con etanol al 70% y el lugar al lado del microscopio de disección en la campana.</li>
</ol>2. rata o disección de cerebro de ratón
Nota: Ambos ratones y ratas se pueden utilizar. Animales mayores de P8 también puede ser usada (probamos hasta P12), pero quitar las meninges se hará cada vez más difícil. Además, la producción de células y la salud disminuirá, ya que las células del cerebro de los animales más viejos habrán formado procesos intrincados y conexiones que pueden romperse durante la disociación del tejido, llevando a la muerte celular mayor. Preparación cortical se describe aquí, pero también pueden utilizarse otras regiones cerebrales.
<ol><li>Coloque 0.05% tripsina-EDTA en un baño de agua de 37 ° C.</li>
	<li>Eutanasia de animales (ratas embarazadas E19 cachorros o animales P0 P8) levantando lentamente la concentración de CO2 y aislar el cerebro. Los pasos siguientes requieren una técnica estéril.</li>
	<li>
Si trabaja con tejido embrionario, primero retire los embriones del útero y los sacos embrionarios, después inmediatamente a cortar las cabezas con las tijeras. Cuando se cortan las cabezas, transferencia en medio de disección previamente enfriado.
	<ol>
<li>Una vez que las cabezas estén sumergidas en el medio, abrir la piel y el cráneo (ambos son muy suaves en animales jóvenes) con pinzas y pizca de cerebelo. Palanca con cuidado el resto del cerebro y se salga del cráneo. Nota: Dos a cuatro embriones de E19 rendimiento suficiente tejido para por lo menos ocho platos de 10 cm de astrocitos corticales plateados a 500.000 células por plato el día de la disección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para cachorros recién nacidos o más viejo, a cortar las cabezas con las tijeras y aislar el cerebro por intermedio de corte la piel en línea recta desde la parte posterior de la cabeza hasta la punta de la nariz. Tire de la piel a un lado y con cuidado cortar la calavera izquierda y derecha, luego levantar el cráneo del hueso hacia arriba. Corte el cerebelo, y el resto del cerebro y se salga de la Calavera de la palanca. Nota: Dos a tres cachorros de P0 P8 rendimiento suficiente tejido para por lo menos ocho platos de 10 cm de astrocitos corticales plateados a 500.000 células por plato el día de la disección.</li>
	<li>Separar la corteza de la estructura subyacente del midbrain. Coloque las pinzas dentro de la fisura longitudinal entre los hemisferios, luego hacia la pinza entre las corteza y midbrain estructuras de un hemisferio (perpendicular a la fisura longitudinal) Apriete cada hemisferio libre.</li>
	<li>Usando las pinzas, quitar los meninges de cada hemisferio (y su hipocampo), luego separar los hipocampos. Si se requieren astrocitos de hipocampales, mueva cada hipocampo en un tubo de 15 mL con medio de disección de 14 mL en hielo.</li>
	<li>Eliminar aún más las zonas de corteza de cada hemisferio si regiones específicas son necesarias (por ejemplo, corteza frontal). Corte cualquier tejido cortical que se utilizará para la generación de los astrocitos en pedazos no mayores de 1 mm3. Recoger todos los pedazos de tejido cortical en un separado tubo de 15 mL con medio de disección en el hielo.</li>
</ol>3. disociación y digestión del tejido
<ol><li>Una vez recopilados todos los pedazos de tejido, esperar a colocar en la parte inferior del tubo, luego aspirar todo medio posible.</li>
	<li>Añadir 2-3 mL de 0.05% tripsina-EDTA utilizando una pipeta serológica e incubar los tubos en un baño de agua de 37 ° C por 20 min. Nota: Liberar todos tripsina-EDTA de la pipeta con rapidez para mezclar las piezas de tejido y permite colocar otra vez.</li>
	<li>Aspirar cuidadosamente el tripsina-EDTA, dejando piezas de tejido en poco líquido como sea posible, en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Añadir 5 mL de medio de disección previamente enfriado a lavar el restante tripsina-EDTA. Pipetear a un lado de la parte superior del tubo para lograr la mezcla de las piezas de tejido.</li>
	<li>Aspirar el medio de la disección y dejar las piezas de tejido como poco líquido como sea posible. Repita este paso de lavado con medio de disección previamente enfriado dos veces más.</li>
	<li>Después del paso del lavado final, añadir 1 mL de DMEM + (calentado a la temperatura ambiente) utilizando una pipeta de 1000 μl y triture el tejido mediante pipeteo arriba y abajo sin la introducción de burbujas. Nota: Es importante evitar la producción de burbujas, ya que esto puede cambiar el pH de la solución, a la que los astrocitos son muy sensibles.</li>
	<li>Coloque un filtro de la célula de 100 μm en la abertura de un tubo de 50 mL y Humedezca previamente el filtro con 4,5 mL de DMEM previamente enfriado.</li>
	<li>Pipetear 1 mL de la suspensión de tejido disociadas en el colador de la célula y añadir otros 4,5 mL previamente refrigerado por DMEM + lavar las células a través de la coladera de la célula.</li>
</ol>4. célula galjanoplastia para enriquecimiento de astrositos por pases
<ol><li>Cuenta las celdas, por ejemplo, diluyendo 10 μl de la suspensión celular con 10 μl trypan azul y pipetear la mezcla en un hemocitómetro.</li>
	<li>Placa de 500.000 células en 12 mL DMEM + por caja de 10 cm. Nota: DMEM + es útil para el crecimiento astrocytic, más que por las neuronas o microglia. Durante la agitación, las fuerzas físicas que actúan sobre cubreobjetos de vidrio dentro de pozos son mucho más fuertes que aquellos que actúan en los platos de 10 cm (sin cubreobjetos). Si las células se agitan en placas de 24 pocillos, están malsanos o moriran. Solo placa de astrocitos en placas de 24 pocillos después de agitar.</li>
	<li>Mantener cultivos celulares en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 durante siete días.</li>
	<li>El día 6, el día antes de la sacudida y pases las células, preparar el PEI recubiertos placas como se describe en el paso 5.</li>
</ol>5. pases de células
<ol><li>
El día antes pases, capa de placas celulares con PEI 0,04%.
	<ol>
<li>Para inmunocitoquímica, transducción viral o transfección del plásmido, use placas de 24 pocillos o bien de 6 (cada uno con un 12 mm esterilizado o cubreobjetos de vidrio de 25 mm, respectivamente).</li>
		<li>Esterilizar el cubreobjetos de vidrio por la incubación en etanol al 70% durante al menos 1 hora, luego lavar tres veces con agua destilada desionizada antes de colocar el cubreobjetos en los pozos.</li>
		<li>Añadir por lo menos 70 μl PEI 0,04% por 12 mm cubreobjetos en placas de 24 pocillos y 600 μl 0.04% PEI por 25 mm cubreobjetos en placas de 6 pocillos.</li>
		<li>Por Western blot o análisis de RNA-Seq, los platos de 10 cm ya que contiene las células después de la disección pueden seguir utilizándose. Platos sólo necesitan ser sacudido, después las células se lavaron con PBS 1 x y tratadas con NB + H (no se transfieren a nuevos platos).</li>
	</ol>
</li>
	<li>El día en vitro (DIV) 7 después de la disección, coloque las placas de 10 cm con células en DMEM + en un agitador de laboratorio en la incubadora y sacudir los platos a 110 rpm durante 6 h.</li>
	<li>Lave el PEI de cubreobjetos recubierto con agua destilada desionizada dos veces. Añadir medio NB + H a las placas (500 μl por pozo para placas de 24 pocillos y 2 mL por pozo para placas de 6 pocillos). Pre-equilibre las placas en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2 mientras que los platos de 10 cm están temblando, o por lo menos 30 minutos.</li>
	<li>20-30 min antes del final de la sacudida de 6 h, Precaliente 1 x PBS, DMEM + NB + H y 0.25% tripsina-EDTA a 37 ° C en el baño de agua.</li>
	<li>Después de 6 h de agitación, sacar los platos de la cultura de la coctelera y reemplace inmediatamente el medio (que contiene sacudarido apagado neuronas, oligodendrocitos y microglia) con 10 mL previamente habían calentado 1 x PBS por plato. Nota: Es importante inmediatamente aspirar el viejo medio que contiene células separadas para evitar que las células no astrocíticos volviendo a instalar.</li>
	<li>Retirar el PBS y añadir 3 mL de tripsina-EDTA precalentado por plato. Incubar cada plato por 4 min en la incubadora a 37 ° C y 5% CO2. Nota: Si la preparación de muestras para Western blot o RNA-Seq, no añadir tripsina-EDTA. En su lugar, reemplace el PBS con 12 mL previamente calentado NB + H, después de que las culturas pueden colocarse en la incubadora.</li>
	<li>Añadir 5 mL DMEM con + a lo 3 mL de tripsina-EDTA en cada plato, pipetear las células fuera el plato con una pipeta serológica de 5 mL y recoger la suspensión de células en un tubo de 50 mL. Nota: Pipeta directamente en el fondo de la fuente - el piso del plato debe quedar más claro de como separar las células. Utilice únicamente el medio que contiene el suero (en lugar de DMEM +), como suero inactiva la tripsina.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión de células a 3.220 x g a 20 ° C durante 4 minutos.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL previamente calentado NB + H.</li>
</ol>6. célula galjanoplastia para culturas de astrositos Final
<ol><li>Contar las células.</li>
	<li>Placa de 20.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos (en medio NB + H 2 mL por pozo) o 5.000 células por pocillo, en placas de 24 pocillos (en 500 μl de medio NB + H por pozo).</li>
	<li>Mantener los cultivos celulares en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 hasta análisis o tratamiento adicional.</li>
	<li>Intercambio media el medio una vez por semana. Nota: En ambientes bajos en nutrientes, dejar de astrocitos proliferan pero cualquier restante microglia proliferarán (aunque en nuestra experiencia, no microglia aparecieron en las culturas AWESAM). El intercambio de media la media una vez por semana evita el enriquecimiento de cualquier potencial restante de microglia8y los monocultivos permanecen saludables durante al menos tres semanas.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+method+for+the+purification+and+culture+of+rodent+astrocytes.">Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes.</a> Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).</li><li>Wolfes, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+culturing+stellate+astrocytes+reveals+spatially+distinct+Ca2++signaling+and+vesicle+recycling+in+astrocytic+processes.">A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes.</a> J Gen Physiol. 149 (4), (2016).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li><li>Krencik, R., Zhang, S. -. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity.">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Res. 1190, 15-22 (2008).</li><li>Malarkey, E. B., Parpura, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+characteristics+of+vesicular+fusion+in+astrocytes:+examination+of+synaptobrevin+2-laden+vesicles+at+single+vesicle+resolution.">Temporal characteristics of vesicular fusion in astrocytes: examination of synaptobrevin 2-laden vesicles at single vesicle resolution.</a> J Physiol. 589, 4271-4300 (2011).</li><li>Zamanian, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+reactive+astrogliosis.">Genomic analysis of reactive astrogliosis.</a> J Neurosci. 2 (18), 6391-6410 (2012).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+signaling+in+astrocytes+from+Ip3r2(-/-)+mice+in+brain+slices+and+during+startle+responses+in+vivo.">Ca(2+) signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo.</a> Nat Neurosci. 18 (5), 708-717 (2015).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141 (5), 633-647 (2013).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo.">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li><li>Otsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+dynamics+in+astrocyte+processes+during+neurovascular+coupling.">Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling.</a> Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).</li><li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+Opening+of+the+Mitochondrial+Permeability+Transition+Pore+Induces+Microdomain+Calcium+Transients+in+Astrocyte+Processes.">Transient Opening of the Mitochondrial Permeability Transition Pore Induces Microdomain Calcium Transients in Astrocyte Processes.</a> Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cuatro pasos en el protocolo son fundamentales: 1) preparar la concentración HBEGF y precisamente 5 ng/mL, ya que pequeños incrementos en la concentración pueden conducir a las culturas inmaduras, por ejemplo, 10 ng/mL HBEGF se diferenciará los astrocitos4; 2) evita burbujas en las soluciones que contienen tejido o células, que pueden cambiar el pH e impiden salud astrositos; 3) equilibrando los medios para alcanzar el pH óptimo y la temperatura para el cultivo de astrocitos sanos; ...

Los astrocitos influyen en función cerebral a través de soporte trófico, flujo sanguíneo, señalización sináptica y plasticidad y comunicación intercelular - todos los cuales son mecanismos que se centran en los procesos astrocytic finos. El protocolo AWESAM se describe aquí permite el estudio de estos procesos sin la interferencia de las neuronas y otros glía, que es útil por ejemplo, porque la expresión de muchas proteínas y Ca2 + señalización incluso se superponen en células cerebrales diferentes tipos. Además, este método supera limitaciones de las técnicas previamente disponibles. En particular, nuestro protocolo proporciona en vivo-como morfología (astrocitos estrellados con procesos finos) y expresión génica en un quick, easy y manera barata.
Morfología celular, expresión génica y muchos otros procesos normativos están directamente influenciadas por el medio ambiente. En una placa de cultivo, esto se refiere a factores liberados por las células circundantes, sino también el medio en que crecen las células. Por astrocitos, HBEGF fue divulgado previamente para inducir una morfología radiada1 pero también fue encontrado para diferenciar de astrocitos2. Sin embargo, concentraciones más bajas de HBEGF fueron utilizadas más adelante para generar más en vivo-como astrocitos identificados a través de la secuencia de RNA en dos protocolos diferentes de3,4. Por otra parte, cambios de morfología de astrositos con la composición del medio, sin importar el protocolo4: Neurobasal medio con una concentración baja de HBEGF es óptimo para el cultivo de astrocitos estrellados, mientras que otras composiciones medianas (p. ej., suero que contienen DMEM) producen las células poligonales (incluso en los astrocitos recién aislados por immunopanning).
El protocolo AWESAM supera los inconvenientes de las técnicas anteriores para el crecimiento de los monocultivos de astrositos4. Las técnicas anteriores para el crecimiento de los monocultivos de astrositos tienen las siguientes desventajas: morfología poligonal, que es poco característica de astrocitos estrellados en vivo (método de MD)5; la longitud y el costo del Protocolo (preparación de astrocitos de células madre pluripotentes inducidas se lleva tres meses y requiere de muchos reactivos, incluyendo costosos factores de crecimiento)6; las bajas cantidades de material (método immunopanning)3; y la la diferenciación de astrocitos y el requisito de una matriz 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. en contraste, el protocolo AWESAM proporciona: en vivo-como morfología (astrocitos estrellados con procesos finos); una rápida, fácil y barato método; grandes cantidades de material; y más en vivo-como la expresión del gen en comparación con immunopanned y astrocitos MD. Además, cultura 2D permite el estudio de Ca2 + señalización y reciclaje en los procesos de finos y en eventos cerca de la membrana de la vesícula (por ejemplo, microscopía TIRF no es posible en las culturas 3D).
El método de MD se ha utilizado extensivamente desde su publicación en 19805, ofreciendo una técnica simple y rápida para monocultivos de astrositos poligonal. En Resumen, el método MD exige creciente neuronas mezclado en el suero fetal de ternero (FCS)-que contienen DMEM, siguió agitando pasos que enriquecen de astrocitos (como todas las otras células cerebrales tipos separan del plato) y más de la cultura en el mismo medio. DMEM suplementado con FCS se utiliza para muchos otros tipos de células, que van desde fibroblastos y adipocitos a líneas celulares de cáncer diferentes, todos los cuales comparten la morfología poligonal exhibida por astrocitos MD en la cultura. Hasta el temprano 2000s7, poco pensamiento había sido dado a los medios de comunicación a la medida de los astrocitos, específicamente a favor de su típica morfología radiada encontrado en vivo. Un protocolo publicado en 2011 alcanzar tal morfología radiada: llama al método immunopanning, emplea medio libre de suero optimizado para el cultivo de astrocitos3. Usando este método, las células cerebrales recién aislados están expuestas a una serie de platos recubiertos con anticuerpos que atacan células específicas del tipo celular proteínas de la superficie, para enriquecer por astrocitos. A pesar de más en vivo-como perfil morfología y expresión de immunopanned astrocitos, la mayoría de los estudios en vitro todavía dependen del método de astrositos MD. El método de la MD es sencillo y rápido, mientras que el método immunopanning compone de pasos más complejo y desperdiciador de tiempo en el primer día de la cultura (como períodos de digestión enzimática, y cuidado de soluciones de diferentes densidades, immunopanning, y varios centrifugación pasos - todo antes de placas). Sin embargo, utilizando el medio más especializado, el método AWESAM ofrece tanto la velocidad del método de la MD y la en vivo-como morfología del protocolo immunopanning.
En general, el protocolo AWESAM es útil para estudiar más en vivo-como astrocytes en 2D monocultivos aislados de neuronas y glia de otros (como previamente caracterizados4 immunostainings, immunoblots y secuenciación del RNA). Permite el estudio de los procesos astrocytic finos y proporciona gran accesibilidad para la visualización de eventos cerca de la membrana (e.g., reflejada por microscopía TIRF) y Ca2 + señalización espontánea.

<table><tbody><tr><td>0.05% trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>warm in 37 &amp;ordm;C waterbath before use</td></tr><tr><td>0.25% trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>warm in 37 &amp;ordm;C waterbath before use</td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50X stock</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100X stock</td></tr><tr><td>Penicillin / streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &amp;micro;g/ml</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>without L-glutamine</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>HBEGF</td><td>Sigma</td><td>4643</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td>1X</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m nylon cell strainer</td><td>BD</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory shaker</td><td>Heidolph</td><td>Rotamax 120&amp;nbsp;</td><td>use inside cell culture incubator</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

El AWESAM (una low-costo easy stellate unstrocyte mmétodo) protocolo supone una forma rápida, sencilla y barata para generar grandes cantidades de en vivo-como los monocultivos de astrositos de ratón y rata : Las células cerebrales pueden ser aisladas de regiones diferentes del cerebro, y después de una semana de la cultura de célula, las células no astrocíticos son sacudidas colocando los platos de la cultura en un agitador por 6 horas en la incubadora. Los astrocitos restantes son entonces pasados en nuevas placas con un medio específico de astrositos (llamado NB + H). NB + H contiene bajas concentraciones de heparina EGF-como factor de crecimiento (HBEGF), que se utiliza en lugar de suero en el medio. Después de crecer en NB + H, los astrocitos AWESAM tienen una morfología radiada y procesos fina característica. Por otra parte, los astrocitos tienen más en vivo-como la expresión del gen de astrocitos generados por métodos previamente publicados. CA2 + la proyección de imagen, dinámica de la vesícula y otros eventos cerca de la membrana se pueden estudiar así en los procesos astrocytic bien en vitro, por ejemplo, usando células vivas confocal o microscopía TIRF. En particular, los astrocitos AWESAM también exhiben espontánea Ca2 + señalización similares a los astrocitos en vivo.

Astrocitos que son cultivados junto con las neuronas y crecidos en medio de NB + aparecen estrellados después de 2 semanas de la cultura (figura 2). Además de NB + medio, los astrocitos cultivados conjuntamente también están expuestos a factores desconocidos derivados de neurona que probablemente contribuyen a su supervivencia y su morfología. En contraste, los astrocitos MD cultivados en DMEM + como monocultivos (después de la agitación de otros tipos...

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Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

El protocolo AWESAM descrito aquí es óptimo para el cultivo de astrocitos murinos en aislamiento de otras células del cerebro de una manera rápida, sencilla y de bajo costo. Los astrocitos AWESAM exhibición espontáneo Ca2 + señalización, morfología y gene expresión perfiles similares a los astrocitos en vivo.

Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

8.4K vistas.  University of Oxford. El protocolo AWESAM descrito aquí es óptimo para el cultivo de astrocitos murinos en aislamiento de otras células del cerebro de una manera rápida, sencilla y de bajo costo. Los astrocitos AWESAM exhibición espontáneo Ca2 + señalización, morfología y gene expresión perfiles similares a los astrocitos en vivo.

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Isolation and Culture of Mouse Cortical Astrocytes

Astrocytes are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be learned about their molecular and functional characteristics. In vitro astrocyte cell culture systems can be used to study the biological functions of these glial cells in detail. This video protocol shows how to obtain pure astrocytes by isolation and culture of mixed cortical cells of mouse pups. The method is based on the absence of viable neurons and the separation of astrocytes, oligodendrocytes and microglia, the three main glial cell populations of the central nervous system, in culture. Representative images during the first days of culture demonstrate the presence of a mixed cell population and indicate the timepoint, when astrocytes become confluent and should be separated from microglia and oligodendrocytes. Moreover, we demonstrate purity and astrocytic morphology of cultured astrocytes using immunocytochemical stainings for well established and newly described astrocyte markers. This culture system can be easily used to obtain pure mouse astrocytes and astrocyte-conditioned medium for studying various aspects of astrocyte biology.

Astrocytes have been recognized to be versatile cells participating in fundamental biological processes that are essential for normal brain development and function, and central nervous system repair. Here we present a rapid procedure to obtain pure mouse astrocyte cultures to study the biology of this major class of central nervous system cells.

Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

Astrocytes  are an abundant cell type in the mammalian brain, yet much remains to be  learned about their molecular and functional characteristics. In ...

Investigación

Neurociencias

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

Modelado astrocitoma Patogénesis<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Uso cortical astrocitos o células troncales nerviosas de ratones condicionales, Genéticamente Manipulados

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of oxygen and glucose, which causes energy failure and neuronal death. After an ischemic stroke insult, astrocytes become reactive and proliferate around the injury site as it develops. Under this scenario, it is difficult to study the specific contribution of astrocytes to the brain region exposed to ischemia. Therefore, this article introduces a methodology to study primary astrocyte reactivity and proliferation under an in vitro model of an ischemia-like environment, called oxygen glucose deprivation (OGD). Astrocytes were isolated from 1-4 day-old neonatal rats and the number of non-specific astrocytic cells was assessed using astrocyte selective marker Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) and nuclear staining. The period in which astrocytes are subjected to the OGD condition can be customized, as well as the percentage of oxygen they are exposed to. This flexibility allows scientists to characterize the duration of the ischemic-like condition in different groups of cells in vitro. This article discusses the timeframes of OGD that induce astrocyte reactivity, hypertrophic morphology, and proliferation as measured by immunofluorescence using Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Besides proliferation, astrocytes undergo energy and oxidative stress, and respond to OGD by releasing soluble factors into the cell medium. This medium can be collected and used to analyze the effects of molecules released by astrocytes in primary neuronal cultures without cell-to-cell interaction. In summary, this primary cell culture model can be efficiently used to understand the role of isolated astrocytes upon injury.

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

Ischemic stroke is a complex event in which the specific contribution of astrocytes to the affected brain region exposed to oxygen glucose deprivation (OGD) is difficult to study. This article introduces a methodology to obtain isolated astrocytes and study their reactivity and proliferation under OGD conditions.

Control de reactividad astrositos y proliferación in Vitro bajo condiciones isquémicas

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through multipotent intermediates. This technique not only holds great promises in the field of disease modeling, as it allows to convert, for example, fibroblasts for patients suffering neurodegenerative diseases into neurons, but also represents a promising alternative for cell-based replacement therapies. In this context, a major scientific breakthrough was the demonstration that differentiated non-neural cells within the central nervous system, such as astrocytes, could be converted into functional neurons in vitro. Since then, in vitro direct reprogramming of astrocytes into neurons has provided substantial insights into the molecular mechanisms underlying forced identity conversion and the hurdles that prevent efficient reprogramming. However, results from in vitro&#160;experiments performed in different labs are difficult to compare due to differences in the methods used to isolate, culture, and reprogram astrocytes. Here, we describe a detailed protocol to reliably isolate and culture astrocytes with high purity from different regions of the central nervous system of mice at postnatal ages via magnetic cell sorting. Furthermore, we provide protocols to reprogram cultured astrocytes into neurons via viral transduction or DNA transfection. This streamlined and standardized protocol can be used to investigate the molecular mechanisms underlying cell identity maintenance, the establishment of a new neuronal identity, as well as the generation of specific neuronal subtypes and their functional properties.

Here we describe a detailed protocol to generate highly enriched cultures of astrocytes derived from different regions of the central nervous system of postnatal mice and their direct conversion into functional neurons by the forced expression of transcription factors.

Aislamiento y reprogramación neuronal directa de astrocitos de ratón

Direct neuronal reprogramming is a powerful approach to generate functional neurons from different starter cell populations without passing through ...

Extracción eficiente de astrocitos y microglía de la médula espinal de ratón adulto

Isolation of Pure Astrocytes and Microglia from the Adult Mouse Spinal Cord For In Vitro Assays and Transcriptomic Studies

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic cells exhibit rapid responses to environmental changes and display significant heterogeneity in terms of morphology, transcriptional profiles, and functions. While our understanding of the functions of glial cells in health and disease has advanced substantially, there remains a need for in vitro, cell-specific analyses conducted in the context of insults or injuries to comprehensively characterize distinct cell populations. Isolating cells from the adult mouse offers several advantages over cell lines or neonatal animals, as it allows for the analysis of cells under pathological conditions and at specific time points. Furthermore, focusing on spinal cord-specific isolation, excluding brain involvement, enables research into spinal cord pathologies, including experimental autoimmune encephalomyelitis, spinal cord injury, and amyotrophic lateral sclerosis. This protocol presents an efficient method for isolating astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating immediate or future analysis with potential applications in functional, molecular, or proteomic downstream studies.

Autor destacado: Aislamiento de células gliales de la médula espinal de ratón adulto 

This protocol outlines the isolation of purified astrocytes and microglia from the adult mouse spinal cord, facilitating subsequent applications such as RNA analysis and cell culture. It includes detailed cell dissociation methods and procedures designed to enhance both the quality and yield of isolated cells.

Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

Astrocytes and microglia play pivotal roles in central nervous system development, injury responses, and neurodegenerative diseases. These highly dynamic ...

Generating a Primary Culture of Astrocytes from a Rat Pup Brain

Source: Mili&#263;evi&#263;, K., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/63483">Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> J. Vis. Exp. (2022)
The video demonstrates a technique for culturing primary astrocytes from the rat cortex. The cortex is mechanically dissociated to obtain a homogeneous glial cell suspension, which is then plated on polypeptide-coated plates to promote selective proliferation of astrocytes. Subsequently, the astrocytes are enzymatically dissociated from the plates and transferred to fresh media, allowing the culture of pure astrocytes.

Generación de un cultivo primario de astrocitos a partir del cerebro de una cría de rata

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Primary cell culture preparation

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JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

A Simple Technique to Isolate and Culture Murine Astrocytes

Source: Wolfes, A. C., et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/56092">Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates a simple method to culture murine astrocytes in isolation from other brain cells. During culturing, by using astrocyte-specific media and inhibiting the adherence of non-astrocytic cells, the method selectively cultures astrocytes. These cultured astrocytes exhibit stellate morphology with fine processes.

Una técnica sencilla para aislar y cultivar astrocitos murinos

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Rat or Mouse Brain Dissection
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Cultivo In Vivo-como astrocitos murinos mediante el protocolo AWESAM rápido, sencillo y barato

Resumen

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Capítulos en este video

Aislamiento y cultivo de astrocitos corticales de ratones

Modelado astrocitoma Patogénesis

Control de reactividad astrositos y proliferación in Vitro bajo condiciones isquémicas

Cultivos primarios de astrocitos de rata y microglia y su uso en el estudio de la esclerosis lateral amiotrófica

Aislamiento y reprogramación neuronal directa de astrocitos de ratón

Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

Generación de un cultivo primario de astrocitos a partir del cerebro de una cría de rata

Una técnica sencilla para aislar y cultivar astrocitos murinos