Il sostegno finanziario a questo studio è stato fornito dal National Key Research and Development Programme (2016YFC1200601) e dalla National Science Foundation of China (31390421).

1. Identificazione delle specie di recupero di Whitefly e delle specie crittiche <ol><li> Mantenere le specie bianche in cotone Gossypium hirsutum (Malvaceae) (c.Zhe-Mian 1973) in gabbie in condizioni standard di 27 ± 1 ° C, umidità di 70 ± 10% e luce di 14 h: regime di 10 ore scuro. </li><li> Raccogliere una singola adulte bianca e omogeneizzare in 30 μl di tampone di lisi (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt / vol] Tween-20, gelattina 0,2% [wt / vol], 0,45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 g / mL Proteinasi K). </li><li> Incubare l&#39;omogenato a 65 ° C per 1 ora e poi 100 ° C per 10 min. NOTA: il tempo di incubazione a 65 ° C può essere aumentato se necessario. Il tempo di incubazione a 100 ° C deve essere controllato in modo critico per inattivare sufficientemente la Proteinase K ed evitare danni al DNA. </li><li> Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) usando il DNA di Whitefly (acquisita nella sezione 1.3) basata su primers mitocondriali di citocromo ossidasi I. COI-F: 5&#39;-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 &#39; COI-R: 5&#39;-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 &#39; <ol><li> Eseguire le reazioni PCR in un volume finale di 25 μL contenente 1 U di Taq DNA polimerasi, 2,5 μL di 10 volte di tampone, 0,2 mM dNTP, 0,2 mM di ciascun primer e 2 μL di DNA bianca. </li><li> Utilizzare le seguenti condizioni di procedura PCR: denaturazione iniziale 95 ° C per 3 minuti seguito da 35 cicli di 95 ° C per 45 s (denaturazione), 50 ° C per 45 s (annealing) e 72 ° C per 1 min (estensione) e Altri 10 minuti a 72 ° C per ulteriore estensione. </li></ol></li><li> Pulire il prodotto amplificato PCR utilizzando un kit di estrazione del DNA con il protocollo raccomandato. </li><li> Sequenza dei campioni di DNA purificato con un sistema di sequenziamento dei campioni di DNA seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Analizzare le sequenze usando lo strumento di ricerca di allineamento locale di base (BLAST) per identificare le specie cretiche della bianca e evitare la contaminazione di altre species. </li></ol> 2. Identificazione e localizzazione endosimbiotica <ol><li> Eseguire il PCR sul DNA della bianca (acquisito nel passo 1.3) per amplificare i geni specifici di ciascuna endosymbiont all&#39;interno della bianca (la ricetta PCR è descritta nel paragrafo 1.4 e le procedure e i primer PCR sono elencati nella tabella 1 ). </li><li> Soggetto il campione amplificato all&#39;elettroforesi del gel agarosico secondo il protocollo 20 precedentemente pubblicato (1% agarosio gel, Tris-acetato-EDTA come buffer di esecuzione, tensione 5 V / cm) per identificare il gene specifico di ogni batterio. </li><li> Recuperare e sequenziare ciascuna fascia per determinare la specie batterica all&#39;interno della bianca (vedere paragrafi 1.5-1.7). </li><li> Eseguire fluorescenza in ibridizzazione in situ (FISH) in whiteflies per identificare la localizzazione degli endosymbionts secondo il protocollo 19 precedentemente pubblicato. NOTA: aumentare la concentrazione delle sonde fluorescenti se necessario. </li></ol&gt; 3. Microscopia elettronica di trasmissione (TEM) <ol><li> Immergere e fissare le bianche in tampone di fosfato (0,1 M, pH 7,0) contenenti glutaraldeide di 2,5% [vol / vol] per 4 ore. </li><li> Lavare i campioni in tampone fosfato (0,1 M, pH 7,0) tre volte, 15 minuti ogni volta. </li><li> Immergere e fissare nuovamente i campioni in tampone di fosfato (0,1 M, pH 7,0) contenenti 1% [wt / vol] OsO 4 per 2 ore. </li><li> Dehidrate i campioni con una serie di etanolo gradito (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100%), 15 minuti ogni volta. </li><li> Trasferire e immergere i campioni in acetone al 100% per 20 minuti. </li><li> Posizionare i campioni in miscela di acetone al 100% e resina 100% Spurr (1: 1) per 1 h a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire i campioni in miscela di acetone al 100% e resina 100% Spurr (1: 3) per 3 ore a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire e immergere i campioni in resina 100% Spurr (incubata a 70 ° C) per più di 9 h. </li><li> Seguire i campioni bianchi usando un microper me. </li><li> Macchiare i film ultra-sottili (acquisiti nella sezione 3.9) immersione in acetato assoluto di uranile per 5-10 min, seguita da immersione nel citrato alcalino al piombo al 50% per altri 5-10 min. NOTA: I volumi dei reagenti utilizzati nella sezione 3.1-3.10 dipendono dai campioni. Assicurarsi che i campioni siano immersi nei reagenti. </li><li> Osservare i campioni sotto microscopia elettronica di trasmissione (15.000x) per determinare la localizzazione, la forma e la dimensione dei batteri per ulteriore uso (vedere paragrafo 4.6). </li></ol> 4. Disettazione e purificazione di Whitefly Bacteriome <ol><li> Aggiungere 100 μL di soluzione 1x PBS su uno scivolo a microscopio. Scegli le ninfe di 3 o 4 ° istare dalle foglie di cotone e immergetele nella soluzione PBS. </li><li> Utilizzare aghi entomologici fine sotto uno stereomicroscopio e tirare fuori i batteri dal corpo del mulino. <ol><li> Tagliare delicatamente un foro su un lato della ninfa e premere leggermente l&#39;altroLato per lasciare i batteri fuori. </li></ol></li><li> Montare un microelaboratore da 20 μL (con il taglio finale terminato per soddisfare le dimensioni del batterioio) su una pipetta da 0,5-10 μL. Estrarre il batterioio individuale dalla soluzione PBS nel microelaboratore. </li><li> Lavare il batterio per eliminare la contaminazione di altri tessuti bianchi pipettando il batterioio nella soluzione PBS ed estraendo il batterio. Ripetere tre volte. </li><li> Immediatamente pipettare il batterio lavato in un tubo di centrifuga contenente 60 μL di soluzione 1x PBS. </li><li> Siringa-filtra il batterio assemblato attraverso una membrana filtrante da 5 μm (determinata per dimensioni di batteri e nucleo batteriociente in bianca). Ripetere più volte per spostare completamente il liquido miscelato attraverso la membrana del filtro. NOTA: Per ottenere un risultato migliore dell&#39;amplificazione e del sequenziamento, raccogliere più di 100 batteriomi. Bagnare la membrana filtrante prima utilizzando la soluzione 1x PBS per diminuire la perdita di batteriLegandosi alla membrana. </li></ol> 5. Amplificazione degli endosymbiont Genomes <ol><li> Amplificare il filtrato (contenente prevalentemente gli endosimbiotici della bianca) utilizzando un kit di amplificazione del DNA dal protocollo raccomandato con qualche modifica. <ol><li> Scegliere il protocollo di amplificazione del DNA genomico da sangue o cellule e preparare il buffer D2 per l&#39;esperimento successivo. </li><li> Aggiungere direttamente 1,5 μl di filtrato (vedi sezione 4.6) al tubo di centrifuga, seguita da 1,5 μL del Tampone D2 e ​​mescolare bene. </li><li> Incubare su ghiaccio per 10 min e aggiungere 1,5 μL della soluzione di arresto. </li><li> Aggiungere 15 μL del tampone di reazione e 1 μL della DNA polimerasi e mescolare delicatamente. </li><li> Incubare la miscela a 30 ° C per 16 h, seguita da 3 min a 65 ° C. </li></ol></li><li> Eseguire il PCR direttamente sul filtrato amplificato (diluire eventualmente i campioni amplificati) utilizzando appositi primer progettati per bacTeria per confermare le specie batteriche (vedere paragrafo 2.1). </li><li> Eseguire la PCR per verificare se vi sia contaminazione del genoma ospite mediante l&#39;uso di beta- Actin e EF1 primari di whitefly secondo il metodo 21 precedentemente pubblicato (la ricetta PCR è descritta nel paragrafo 1.4). </li></ol> 6. Endosymbiont Metagenome Sequencing <ol><li> Soddisfare il filtrato amplificato a uno spettrofotometro e un fluorometro (secondo le istruzioni del produttore) prima della sequenza per verificare la qualità dei campioni e se i campioni soddisfano i criteri di sequenziamento. </li><li> Soggetti l&#39;amplificato a un sequencer genomico secondo le istruzioni del produttore. </li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga...

I batteri che formano una relazione intima e simbiotica con i relativi padroni sono diffusi negli artropodi1. Gli endosymbionts sono stati dimostrati di influenzare gli aspetti degli ospiti, come il metabolismo nutrizionale, la riproduzione, le risposte alle sollecitazioni ambientali 2 , 3 , 4 ecc . In quasi ogni fase di sviluppo 5 . Tuttavia, il meccanismo che sostiene le associazioni resta ancora in gran parte sconosciuto. La genomica è di priorità ed importanza quando studia le potenziali funzioni ei ruoli dei batteri. Alcune informazioni fondamentali, vale a dire lo status tassonomico, i geni funzionali, i percorsi di metabolismo, i sistemi di secrezione, possono essere dedotti dalle sequenze genomiche, che spariscono le potenziali ruoli dei simbionti in simbiosi. Con lo sviluppo di sequenziamenti ad alta percentuale, sono stati sequenziati un vasto numero di genomi battericiIth diverse funzioni rivelate 6 . Gli endosimbieti sono di vitale importanza per gli emipterani, quali gli afidi 7 , i cimici 8 , i psyllids 9 , i pianthoppers marroni 10 e le cicale 11 . Per esempio, Buchnera negli afidi, come il simbiont obbligatorio, è stato dimostrato di essere coinvolto nella biosintesi essenziale di aminoacidi, insieme ai geni del genoma aphid 12 . Inoltre, viene rivelata anche la regolazione trascrizionale di Buchnera 13 . In psyllids , Carsonella viene sequenziato e classificato il genoma batterico più piccolo mai trovato 14 . Tutti questi segni distintivi degli endosymbionts sono basati e dedotti dalle sequenze del genoma. Poiché questi endosymbionts non possono essere coltivati in vitro , sono stati applicati diversi approcci per isolare batteri adeguati per sequenzare. Negli afidi, gli endosimbieti vengono estratti mediante centrifugazione e filtrazione e sottoposti ad ulteriore analisi genomica e transcriptomica 5 . Nelle piante marrone, gli endosimbieti sono sequenziati insieme a tutto il genoma degli insetti 10 . Whitefly B. tabaci è un complesso di specie che contiene più di 35 specie morfologicamente indistinguibili (specie criptiche), tra le quali due specie invasive hanno invaso in tutto il mondo e hanno causato enormi danni alla produzione agricola 15 . Da notare, endosymbionts all&#39;interno delle specie B. tabaci hanno mostrato importanza nello sviluppo dei parassiti 16 . Fino ad oggi sono stati identificati otto endosimbiotici, tra cui il simbionto obbligatorio, Candidatus Portiera aleyrodidarum e sette simbionti secondari Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium ,Em&gt; Wolbachia, Fritschea e Hemipteriphilus definito 17 , 18 . A differenza degli hemipterani descritti in precedenza, la bianca B. tabaci è un insetto estremamente piccolo solo di 1 mm di lunghezza. La maggior parte degli endosymbionts sono limitati ai bacteriosi 19 (cellule specializzate contenenti simbioni, che formano ulteriormente il batterio in B. tabaci ). Inoltre, questi endosymbionts non possono essere coltivati in vitro . L&#39;unico modo per ottenere endosymbionts da B. tabaci è quello di disseccare il batterio fuori. Tuttavia, c&#39;è difficoltà nella dissezione. Innanzitutto, il fragile batterioma si collega sempre con altri tessuti della bianca, difficilmente separabile. In secondo luogo, la piccola dimensione della bianca limita l&#39;isolamento di batteriomi sufficienti. In terzo luogo, l&#39;endosymbionts cluster nel batterio, rendendo estremamente complicato l&#39;acquisizione di una singola specie di batterio. <p clAss = &quot;jove_content&quot;&gt; Qui segnalate un protocollo semplice e poco costoso per isolare endosymbionts di whitefly per successivi sequenziamenti di metagenomi. Attraverso la dissezione, la purificazione e l&#39;amplificazione, si ottiene un adeguato DNA endosymbiont e la specie di batteri poteva essere confermata. Il protocollo descritto può essere usato in modo analogo in altri artropodi.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>R001A</td><td>including rTaq, 10&amp;times;Buffer and dNTP</td></tr><tr><td>Gel DNA extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DNA sample sequencing system</td><td>ABI</td><td>ABI-3730XL</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscopy</td><td>Hitachi</td><td>H-7650 TEM</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L microloader</td><td>Eppendorf</td><td>F2771951</td><td></td></tr><tr><td>Filter holder</td><td>Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr><tr><td>Filter membrane filter</td><td>Millipore</td><td>SMWP001300</td><td>5.0 &amp;mu;m SMWP</td></tr><tr><td>REPLI-g UltraFast Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>150033</td><td>DNA amlification kit</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Genome Sequencer</td><td>Illumina</td><td>Hiseq 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the extraction of endosymbionts from the whitefly bemisia tabaci

I simbionti batterici formano una relazione intima con i loro ospiti e conferiscono vantaggi agli ospiti nella maggior parte dei casi. Le informazioni genomiche sono fondamentali per studiare le funzioni e l&#39;evoluzione dei simbionti batterici nel loro ospite. Poiché la maggior parte dei simbionti non possono essere coltivati in vitro , sono molto importanti metodi per isolare un&#39;adeguata quantità di batteri per il sequenziamento dei genomi. Nella bianca Bemisia tabaci , sono stati identificati diversi endosymbionts e sono previsti di grande importanza nello sviluppo e nella riproduzione dei parassiti attraverso approcci multipli. Tuttavia, il meccanismo che sostiene le associazioni rimane in gran parte sconosciuto. L&#39;ostacolo deriva parzialmente dal fatto che gli endosymbionts in whitefly, perlopiù restrittivi nei batteriociti, sono difficili da separare dalle cellule ospite. Qui riportiamo un protocollo passo per passo per l&#39;identificazione, l&#39;estrazione e la purificazione di endosymbionts dalla bianca B. tabaci principalmente da dissectiOn e filtrazione. I campioni di endosimbione preparati con questo metodo, pur essendo ancora una miscela di diverse specie endosimbiotici, sono adatti per la sequenza successiva del genoma e l&#39;analisi dei possibili ruoli degli endosimbiotici in B. tabaci . Questo metodo può anche essere usato per isolare endosymbionts da altri insetti.

Le specie del complesso B. tabaci del Medio Oriente Asia Minore 1 (MEAM1) sono state prese qui come esempio per la descrizione. Il cotone per l&#39;allevamento di bianche e diverse fasi di sviluppo delle bianche sono riportate in figura 1, tra cui una pianta di cotone, la bianca adulta e le 1. , 2. e 4. ninfa installa di bianca (la nona di secondo istante sembra simile alla quarta nima ). Era ovvio che la nima del quarto</...

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Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Qui presentiamo un protocollo per isolare endosymbionts dalla whitefly Bemisia tabaci attraverso la dissezione e la filtrazione. Dopo l&#39;amplificazione, i campioni di DNA sono idonei per sequenziare e studiare successivamente il mutualismo tra endosymbionts e whitefly.

Metodi per l&#39;estrazione di Endosymbionts dalla Whitefly<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

9.8K Views.  Zhejiang University.  Qui presentiamo un protocollo per isolare endosymbionts dalla whitefly Bemisia tabaci attraverso la dissezione e la filtrazione. Dopo l'amplificazione, i campioni di DNA sono idonei per sequenziare e studiare successivamente il mutualismo tra endosymbionts e whitefly. 

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Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and rates of mortality in populations, which has a variety of applications in ecology, including agricultural ecosystems. Horizontal, or cohort-based, life tables provide for the most direct and accurate method of quantifying vital population rates because they follow a group of individuals in a population from birth to death. Here, protocols are presented for conducting and analyzing cohort-based life tables in the field that takes advantage of the sessile nature of the immature life stages of a global insect pest, Bemisia tabaci. Individual insects are located on the underside of cotton leaves and are marked by drawing a small circle around the insect with a non-toxic pen. This insect can then be observed repeatedly over time with the aid of hand lenses to measure development from one stage to the next and to identify stage-specific causes of death associated with natural and introduced mortality forces. Analyses explain how to correctly measure multiple mortality forces that act contemporaneously within each stage and how to use such data to provide meaningful population dynamic metrics. The method does not directly account for adult survival and reproduction, which limits inference to dynamics of immature stages. An example is presented that focused on measuring the impact of bottom-up (plant quality) and top-down (natural enemies) effects on the mortality dynamics of B. tabaci in the cotton system.

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Life tables allow quantification of the sources and rates of mortality in insect populations and contribute to understanding, predicting and manipulating population dynamics in agroecosystems. Methods for conducting and analyzing cohort-based life tables in the field for an insect with sessile immature life stages are presented.

Metodologia per lo sviluppo di tavole di sopravvivenza per insetti Sessile nel campo utilizzando la Whitefly, Bemisia tabaci, in cotone come un modello di sistema

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Ricerca

Ambiente

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms to questions surrounding insect's interactions with their host plants. Genomic resources are available for several aphid species, and with advances in the next-generation sequencing, transcriptomic studies are being extended to non-model organisms that lack genomes. Furthermore, aphid cultures can be collected from the field and reared in the laboratory for the use in organismal and molecular experiments to bridge the gap between ecological and genetic studies. Last, many aphids can be maintained in the laboratory on their preferred host plants in perpetual, parthenogenic life cycles allowing for comparisons of asexually reproducing genotypes. Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid, provides one such model to study insect interactions with toxic plants using both organismal and molecular experiments. Methods for the generation and maintenance of the plant and aphid cultures in the greenhouse and laboratory, DNA and RNA extractions, microsatellite analysis, de novo transcriptome assembly and annotation, transcriptome differential expression analysis, and qPCR verification of differentially expressed genes are outlined and discussed here.

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

The aphid Aphis nerii colonizes on highly-defended plants in the dogbane family (Apocyanaceae) and provides numerous opportunities to study plant-insect interactions. Here, we present a series of protocols for the maintenance of plant and aphid cultures, and the generation and analysis of molecular and -omic data for A. nerii.

Mantenimento di colture biologiche e misurazione dell'espressione genica in Aphis nerii: un sistema Non-modello per le interazioni pianta-insetto

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Genetica

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Determinare il tasso di fertilizzazione dell'uovo di Bemisia tabaci utilizzando una tecnica citogenetica

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

Un'analisi di amplificazione isotermica (lampada) mediata da Loop per la rapida identificazione di Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazioni (FISH) per la localizzazione di virus e batteri endosimbiontica a Plant e Insetti tessuti

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Immunologia e infezioni

Parassita artificiale dell'ospite mediante Trichogramma dendrolimi ed estrazione del veleno

Extracting Venom from the Parasitoid Wasp Trichogramma dendrolimi Using an Artificial Host

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, parasitoid wasps inject venom into their hosts to suppress their hosts&#39; immunity, modulate hosts&#39; development, metabolism, and even behavior. With over 600,000 estimated species, the diversity of parasitoid wasps surpasses that of other venomous animals, such as snakes, cone snails, and spiders. Parasitoid wasp venom is an underexplored source of bioactive molecules with potential applications in pest control and medicine. However, collecting parasitoid venom is challenging due to the inability to use direct or electrical stimulation and the difficulty in dissection because of their small size. Trichogramma is a genus of tiny (~0.5 mm) egg parasitoid wasps that are widely used for the biological control of lepidopteran pests in both agriculture and forests. Here, we report a method for extracting venom from T. dendrolimi using artificial hosts. These artificial hosts are created with polyethylene film and amino acid solutions and then inoculated with Trichogramma wasps for parasitism. The venom was subsequently collected and concentrated. This method enables the extraction of large amounts of Trichogramma venom while avoiding contamination from other tissues caused by dissection, a common issue in venom reservoir dissection protocols. This innovative approach facilitates the study of Trichogramma venom, paving the way for new research and potential applications.

Autore in primo piano: Metodo efficiente di estrazione del veleno dalle vespe parassitoidi Trichogramma 

Here, we present a protocol for extracting venom from Trichogramma dendrolimi using an artificial host created with polyethylene film and amino acid solution.

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, ...

Biochimica

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Istituzione dell'infezione virale e analisi dell'interazione ospite-Virus in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several genera of these whitefly-transmitted plant viruses (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus) include several hundred species of emerging and economically significant pathogens of important food and fiber crops (reviewed by9,10,16). These viruses do not replicate in their vector but nevertheless are moved readily from plant to plant by the adult whitefly by various means (reviewed by2,6,7,9,10,11,17). For most of these viruses whitefly feeding is required for acquisition and inoculation, while for others only probing is required. Many of these viruses are unable or cannot be easily transmitted by other means. Therefore maintenance of virus cultures, biological and molecular characterization (identification of host range and symptoms)3,13, ecology2,12, require that the viruses be transmitted to experimental hosts using the whitefly vector. In addition the development of new approaches to management, such as evaluation of new chemicals14 or compounds15, new cultural approaches1,4,19, or the selection and development of resistant cultivars7,8,18, requires the use of whiteflies for virus transmission. The use of whitefly transmission of plant viruses for the selection and development of resistant cultivars in breeding programs is particularly challenging7. Effective selection and screening for resistance employs large numbers of plants and there is a need for 100% of the plants to be inoculated in order to find the few genotypes which possess resistance genes. These studies use very large numbers of viruliferous whiteflies, often several times per year.
Whitefly maintenance described here can generate hundreds or thousands of adult whiteflies on plants each week, year round, without the contamination of other plant viruses. Plants free of both whiteflies and virus must be produced to introduce into the whitefly colony each week. Whitefly cultures must be kept free of whitefly pathogens, parasites, and parasitoids that can reduce whitefly populations and/or reduce the transmission efficiency of the virus. Colonies produced in the manner described can be quickly scaled to increase or decrease population numbers as needed, and can be adjusted to accommodate the feeding preferences of the whitefly based on the plant host of the virus.
There are two basic types of whitefly colonies that can be maintained: a nonviruliferous and a viruliferous whitefly colony. The nonviruliferous colony is composed of whiteflies reared on virus-free plants and allows the weekly availability of whiteflies which can be used to transmit viruses from different cultures. The viruliferous whitefly colony, composed of whiteflies reared on virus-infected plants, allows weekly availability of whiteflies which have acquired the virus thus omitting one step in the virus transmission process.

Improving our understanding of and our ability to manage many of the insect-transmitted plant viruses requires the use of the vector. Insect transmission of plant viruses is a tritrophic interaction, and as such requires the manipulation of insects, virus, and plant. Vectors must be reared in large numbers and manipulated in such a way as to insure high rates of transmission to test plants. The basics of rearing and manipulating the whitefly, Bemisa tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), a vector of plant viruses belonging to several emerging plant virus genera, representing a large number of economically significant viruses is presented.

Trasmissione di virus vegetali Utilizzo Aleurodidi

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several ...

Metodi per l'estrazione di Endosymbionts dalla Whitefly

Riepilogo

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Metodologia per lo sviluppo di tavole di sopravvivenza per insetti Sessile nel campo utilizzando la Whitefly, Bemisia tabaci, in cotone come un modello di sistema

Mantenimento di colture biologiche e misurazione dell'espressione genica in Aphis nerii: un sistema Non-modello per le interazioni pianta-insetto

Determinare il tasso di fertilizzazione dell'uovo di Bemisia tabaci utilizzando una tecnica citogenetica

Un'analisi di amplificazione isotermica (lampada) mediata da Loop per la rapida identificazione di Bemisia tabaci

Fluorescenza

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Istituzione dell'infezione virale e analisi dell'interazione ospite-Virus in Drosophila Melanogaster

Trasmissione di virus vegetali Utilizzo Aleurodidi