Name: methods for the extraction of endosymbionts from the whitefly bemisia tabaci
Uploaded: 2017-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
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Die finanzielle Unterstützung für diese Studie wurde durch das National Key Research and Development Program (2016YFC1200601) und die National Natural Science Foundation von China (31390421) zur Verfügung gestellt.

1. Whitefly Aufzucht und kryptische Arten Identifizierung <ol><li> Halten Sie die Whitefly- Spezies auf Baumwolle Gossypium Hirsutum (Malvaceae) (cv. Zhe-Mian 1973) in Käfigen unter Standardbedingungen von 27 ± 1 ° C, 70 ± 10% Feuchtigkeit und 14 h Licht: 10 h dunkles Regime. </li><li> Sammeln Sie einen einzelnen erwachsenen Weißfarbstoff und homogenisieren Sie in 30 μl Lysepuffer (10 mM Tris, pH 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt / vol] Tween-20, 0,2% [wt / vol] Gelatine, 0,45% [vol / Vol] Nonidet P 40, 60 g / ml Proteinase K). </li><li> Inkubieren des Homogenats bei 65 ° C für 1 h und dann 100 ° C für 10 min. HINWEIS: Die Inkubationszeit bei 65 ° C kann bei Bedarf erhöht werden. Die Inkubationszeit bei 100 ° C sollte kritisch kontrolliert werden, um Proteinase K ausreichend zu inaktivieren und DNA-Schäden zu vermeiden. </li><li> Führen Sie die Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Whitefly-DNA (gewonnen in Abschnitt 1.3) auf der Basis von mitochondrialen Cytochromoxidase I-Primern durch. COI-F: 5&#39;-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3 &#39; COI-R: 5&#39;-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3 &#39; <ol><li> Führen Sie die PCR-Reaktionen in einem Endvolumen von 25 μl mit 1 U Taq- DNA-Polymerase, 2,5 μl 10x Puffer, 0,2 mM dNTP, 0,2 mM jedes Primers und 2 μl Whitefly-DNA durch. </li><li> Verwenden Sie die folgenden PCR-Verfahrensbedingungen: anfängliche Denaturierung 95 ° C für 3 min, gefolgt von 35 Zyklen von 95 ° C für 45 s (Denaturierung), 50 ° C für 45 s (Glühen) und 72 ° C für 1 min (Verlängerung) und Weitere 10 min bei 72 ° C für weitere verlängerung </li></ol></li><li> Reinigen Sie das PCR-amplifizierte Produkt mit einem DNA-Gel-Extraktionskit mit dem empfohlenen Protokoll. </li><li> Sequenzieren Sie die gereinigten DNA-Proben mit einem DNA-Proben-Sequenzierungssystem nach der Anweisungen des Herstellers. </li><li> Analysieren Sie die Sequenzen mit dem Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), um die kryptischen Arten von Whitefly zu identifizieren und eine Kontamination anderer Spezies zu vermeidenEs </li></ol> 2. Endosymbiont Identifizierung und Lokalisierung <ol><li> Führen Sie die PCR auf der Whitefly-DNA aus (in Schritt 1.3 erworben), um die spezifischen Gene jedes Endosymbionts innerhalb des Whitefly zu amplifizieren (das PCR-Rezept ist in Abschnitt 1.4 beschrieben und PCR-Verfahren und Primer sind in Tabelle 1 aufgelistet). </li><li> Bezeichnen Sie die amplifizierte Probe einer Agarose-Gelelektrophorese gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll 20 (1% Agarosegel, Tris-Acetat-EDTA als Laufpuffer, Spannung 5 V / cm), um das spezifische Gen jedes Bakteriums zu identifizieren. </li><li> Wiederholen und Sequenz jedes Bandes, um die Bakterienarten innerhalb von whitefly zu bestimmen (siehe Abschnitte 1.5-1.7). </li><li> Führen Sie Fluoreszenz in situ Hybridisierungen (FISH) auf Whiteflies durch, um den Ort der Endosymbionten gemäß dem zuvor veröffentlichten Protokoll zu identifizieren. HINWEIS: Erhöhung der Konzentration der fluoreszierenden Sonden bei Bedarf. </li></oL&gt; 3. Transmission Electron Microscopy (TEM) <ol><li> In Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0), enthaltend 2,5% [vol / vol] Glutaraldehyd, für 4 h einwischen und fixieren. </li><li> Waschen Sie die Proben in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0) dreimal, jeweils 15 min. </li><li> Tauchen Sie ein und fixieren Sie die Proben erneut in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,0), enthaltend 1% [wt / vol] OsO 4 für 2 h. </li><li> Dehydrieren Sie die Proben mit einer abgestuften Reihe von Ethanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% und 100%), jeweils 15 min. </li><li> Übertragen und die Proben 20 Minuten in 100% Aceton eintauchen. </li><li> Legen Sie die Proben in Mischung aus 100% Aceton und 100% Spurr Harz (1: 1) für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Übertragen Sie die Proben 3 Minuten lang bei Raumtemperatur auf Mischung aus 100% Aceton und 100% Spurrharz (1: 3). </li><li> Übertragen und tauchen die Proben in 100% Spurr-Harz (inkubiert bei 70 ° C) für mehr als 9 h. </li><li> Sektion der Whitefly-Proben mit einem Mikromir. </li><li> Färben Sie die ultradünnen Filme (gewonnen in Abschnitt 3.9) durch Eintauchen in absolutes Uranylacetat für 5-10 min, gefolgt von Eintauchen in 50% iges alkalisches Bleibitrat für weitere 5-10 min. HINWEIS: Die in Abschnitt 3.1-3.10 genutzten Reagenzienmengen reichen von den Proben ab. Stellen Sie sicher, dass die Proben in die Reagenzien eingetaucht sind. </li><li> Beobachten Sie Proben unter Transmissionselektronenmikroskopie (15.000X), um die Lokalisierung, Form und Größe der Bakterien zur weiteren Verwendung zu bestimmen (siehe Abschnitt 4.6). </li></ol> 4. Whitefly Bakteriome Dissektion und Reinigung <ol><li> 100 μl 1x PBS-Lösung auf einen Objektträger geben. Wählen Sie aus den Baumwollblättern die 3. oder 4. Instanz-Nymphen und tauchen sie in die PBS-Lösung ein. </li><li> Verwenden Sie feine entomologische Nadeln unter einem Stereomikroskop und ziehen Sie die Bakterien aus dem Whitefly-Körper. <ol><li> Schon mal ein Loch auf die eine Seite der Nymphe schneiden und das andere leicht drückenSeite, um die Bakterien auszulassen. </li></ol></li><li> Montieren Sie einen 20 μL Mikroloader (mit dem führenden Endschnitt, um die Größe des Bakterioms zu erfüllen) auf einer 0,5-10 μl Pipette. Extrahieren Sie das einzelne Bakteriom aus der PBS-Lösung in den Mikroloader. </li><li> Waschen Sie das Bakteriom, um die Kontamination von anderen Whitefly-Geweben zu eliminieren, indem Sie das Bakteriom in die PBS-Lösung pipettieren und das Bakteriom extrahieren. Wiederholen Sie dreimal. </li><li> Das gewaschene Bakteriom sofort in ein Zentrifugenröhrchen pipettieren, das 60 μl 1x PBS-Lösung enthält. </li><li> Spritzen Sie das zusammengesetzte Bakteriom durch eine 5 μm Filtermembran (bestimmt durch Größen von Bakterien und Kern von Bakteriocyten in Whitefly). Wiederholen Sie mehrmals, um die gemischte Flüssigkeit durch die Filtermembran gründlich zu bewegen. HINWEIS: Um ein besseres Ergebnis der Amplifikation und Sequenzierung zu erreichen, montieren Sie über 100 Bakterien. Netzen Sie die Filtermembran zuerst durch die Verwendung von 1x PBS-Lösung, um den Verlust von Bakterien zu verringernBindung an die Membran. </li></ol> 5. Verstärkung von Endosymbiont-Genomen <ol><li> Verstärken Sie das Filtrat (hauptsächlich enthaltende Endosymbionten der Whitefly) mit einem DNA-Amplifikations-Kit durch das empfohlene Protokoll mit einigen Modifikationen. <ol><li> Wählen Sie das empfohlene Protokoll der Amplifikation von genomischer DNA aus Blut oder Zellen und bereiten Puffer D2 für nachfolgendes Experiment vor. </li><li> Direkt zu 1,5 μl Filtrat (siehe Abschnitt 4.6) zum Zentrifugenröhrchen geben, gefolgt von 1,5 μl des Puffers D2 und gut vermischen. </li><li> Inkubieren auf Eis für 10 min und füge 1,5 μl der Stopplösung hinzu. </li><li> Fügen Sie 15 μl des Reaktionspuffers und 1 μl der DNA-Polymerase hinzu und mischen Sie vorsichtig. </li><li> Inkubieren Sie die Mischung bei 30 ° C für 16 h, gefolgt von 3 min bei 65 ° C. </li></ol></li><li> Führen Sie PCR direkt auf dem amplifizierten Filtrat aus (verdünnen Sie die amplifizierten Proben, falls erforderlich), indem Sie spezifische Primer verwenden, die für bac entworfen sindUm die Bakterienarten zu bestätigen (siehe Abschnitt 2.1). </li><li> Durchführen von PCR, um zu bestätigen, ob eine Kontamination des Wirtsgenoms durch die Verwendung von Whitefly-Gen- Beta- Actin- und EF1- Primern gemäß der zuvor veröffentlichten Methode 21 vorliegt (das PCR-Rezept ist in Abschnitt 1.4 beschrieben). </li></ol> 6. Endosymbiont Metagenome Sequenzierung <ol><li> Das amplifizierte Filtrat einem Spektrophotometer und einem Fluorometer (gemäß den Anweisungen des Herstellers) vor der Sequenzierung zur Prüfung der Probenqualität und ob die Proben die Kriterien für die Sequenzierung erfüllen. </li><li> Betreff der Verstärker zu einem Genom-Sequenzer gemäß den Anweisungen des Herstellers. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga...

Bakterien, die eine intime symbiotische Beziehung mit relativen Wirten bilden, sind bei Arthropoden weit verbreitet 1 . Es wurde gezeigt, dass die Endosymbionten in fast allen Entwicklungsstadien die Aspekte von Wirten, wie den Stoffwechsel, die Reproduktion, die Reaktionen auf die Umweltbelastungen 2 , 3 , 4 usw. beeinflussen. Der Mechanismus, der die Verbände untermauert, bleibt jedoch weitgehend unbekannt. Genomik ist von Priorität und Bedeutung beim Studium der möglichen Funktionen und Rollen von Bakterien. Über die Genomsequenzen, die den potentiellen Rollen der Symbionten in der Symbiose beleuchten, können einige fundamentale Informationen, dh der taxonomische Status, funktionale Gene, Stoffwechselwege, Sekretionssysteme, abgeleitet werden. Mit der Entwicklung der Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde eine große Anzahl von bakteriellen Genomen sequenziertMit diversen Funktionen zeigte sich 6 . Endosymbionten sind von entscheidender Bedeutung bei Hämipteren, wie Blattläuse 7 , Wanzen 8 , Psyllids 9 , braune Pflanzenpflege 10 und Zikaden 11 . So wurde zum Beispiel Buchnera in Blattläuse als obligates symbiont gezeigt, dass es in die essentielle Aminosäurebiosynthese involviert ist, zusammen mit den Genen aus Blattlausgenom 12 . Darüber hinaus zeigt sich auch die Transkriptionsregulation von Buchnera 13 . In Psylliden wird Carsonella sequenziert und rangiert das kleinste bakterielle Genom, das jemals gefunden wurde 14 . Alle diese Kennzeichen von Endosymbionten basieren und werden aus den Genomsequenzen abgeleitet. Da diese Endosymbionten nicht in vitro kultiviert werden können, wurden mehrere Ansätze angewendet, um adäquate Bakterien für seq. Zu isolierenUning Bei Blattläusen werden Endosymbionten durch Zentrifugation und Filtration extrahiert und einer weiteren genomischen und transkriptomischen Analyse unterzogen. In braunen Pflanzern werden Endosymbionten zusammen mit dem ganzen Insektengenom 10 sequenziert. Whitefly B. tabaci ist ein Spezieskomplex mit mehr als 35 morphologisch nicht unterscheidbaren Spezies (kryptische Spezies), unter denen zwei invasive Arten auf der ganzen Welt eingedrungen sind und der landwirtschaftlichen Produktion enorme Schäden verursacht haben 15 . Bemerkenswert, Endosymbionten innerhalb der B. tabaci- Arten haben bei der Entwicklung der Schädlinge Bedeutung geweckt 16 . Bisher wurden acht Endosymbionten in der Whitefly identifiziert, darunter der obligatorische Symbiont, Candidatus Portiera aleyrodidarum und sieben sekundäre Symbionten Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , &lt;Em&gt; Wolbachia, Fritschea und Hemipteriphilus definiert 17 , 18 . Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Hemipterern ist die Whitefly B. Tabaci ein äußerst winziges Insekt, das nur 1 mm lang ist. Die meisten Endosymbionten beschränken sich auf Bakteriozyten 19 (spezialisierte Zellen, die Symbionten enthalten, die Bakterien in B. tabaci weiter bilden). Darüber hinaus können diese Endosymbionten nicht in vitro kultiviert werden. Der einzige Weg, um Endosymbionten von B. tabaci zu erhalten, besteht darin, das Bakteriom zu sezieren. Allerdings gibt es Schwierigkeiten in der Sektion. Zuerst verbindet sich das zerbrechliche Bakteriom immer mit anderen Geweben der Whitefly, die schwer zu trennen ist. Zweitens begrenzt die winzige Größe der Whitefly die Isolierung von genügend Bakterien. Drittens gruppieren sich Endosymbionten im Bakteriom, was es äußerst kompliziert macht, eine einzige Bakterienart zu erwerben. <p clAss = &quot;jove_content&quot;&gt; Hier berichten wir über ein einfaches und kostengünstiges Protokoll, um Whitefly Endosymbionten für die anschließende Metagenomsequenzierung zu isolieren. Durch Dissektion, Reinigung und Amplifikation konnte adäquate Endosymbiont-DNA erhalten und die Bakterienarten bestätigt werden. Das beschriebene Protokoll kann in anderen Arthropoden ähnlich verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA polymerase</td><td>Takara</td><td>R001A</td><td>including rTaq, 10&amp;times;Buffer and dNTP</td></tr><tr><td>Gel DNA extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>DNA sample sequencing system</td><td>ABI</td><td>ABI-3730XL</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscopy</td><td>Hitachi</td><td>H-7650 TEM</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;mu;L microloader</td><td>Eppendorf</td><td>F2771951</td><td></td></tr><tr><td>Filter holder</td><td>Millipore</td><td>SX0001300</td><td></td></tr><tr><td>Filter membrane filter</td><td>Millipore</td><td>SMWP001300</td><td>5.0 &amp;mu;m SMWP</td></tr><tr><td>REPLI-g UltraFast Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>150033</td><td>DNA amlification kit</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Genome Sequencer</td><td>Illumina</td><td>Hiseq 2000</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the extraction of endosymbionts from the whitefly bemisia tabaci

Bakterielle Symbionten bilden eine intime Beziehung zu ihren Gastgebern und verleihen den Gastgebern in den meisten Fällen Vorteile. Genomische Informationen sind entscheidend, um die Funktionen und die Entwicklung von bakteriellen Symbionten in ihrem Wirt zu studieren. Da die meisten Symbionten nicht in vitro kultiviert werden können, sind Methoden zur Isolierung einer adäquaten Menge an Bakterien für die Genomsequenzierung sehr wichtig. In der Whitefly Bemisia tabaci wurde eine Anzahl von Endosymbionten identifiziert und vorausgesetzt, dass sie bei der Entwicklung und Reproduktion der Schädlinge durch mehrere Ansätze von Bedeutung sind. Der Mechanismus, der die Verbände untermauert, bleibt jedoch weitgehend unbekannt. Das Hindernis kommt teilweise aus der Tatsache, dass die Endosymbionten in whitefly, meist in Bakteriocyten zurückgehalten, schwer von den Wirtszellen zu trennen sind. Hier berichten wir ein schrittweises Protokoll zur Identifizierung, Extraktion und Reinigung von Endosymbionten aus dem Whitefly B. Tabaci vorwiegend durch DissectiAuf und filtration. Endosymbiont-Proben, die nach dieser Methode hergestellt wurden, obwohl immer noch eine Mischung aus verschiedenen Endosymbiont-Spezies, eignen sich für die anschließende Genomsequenzierung und die Analyse der möglichen Rollen von Endosymbionten in B. tabaci . Diese Methode kann auch verwendet werden, um Endosymbionten von anderen Insekten zu isolieren.

Im Nahen Osten Kleinasien 1 (MEAM1) Spezies des B. tabaci- Komplexes wurde als Beispiel für die Beschreibung genommen. Baumwolle für die Aufzucht von Weißfliegen und mehrere Entwicklungsstadien von Weißfliegen sind in Abbildung 1 gezeigt, darunter eine Baumwollpflanze, eine erwachsene Whitefly und die 1., 2. und 4. Instar-Nymphe von Whitefly (die 3. Instar-Nymphe sieht ähnlich wie die 4. Instar-Nymphe aus ). Es ...

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Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von Endosymbionten aus der Whitefly Bemisia tabaci durch Dissektion und Filtration. Nach der Amplifikation eignen sich die DNA-Proben für die anschließende Sequenzierung und Untersuchung des Mutualismus zwischen Endosymbionten und Whitefly.

Methoden zur Extraktion von Endosymbionten aus der Whitefly<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

methods-for-extraction-endosymbionts-from-whitefly-bemisia

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

9.8K Aufrufe.  Zhejiang University.  Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von Endosymbionten aus der Whitefly Bemisia tabaci durch Dissektion und Filtration. Nach der Amplifikation eignen sich die DNA-Proben für die anschließende Sequenzierung und Untersuchung des Mutualismus zwischen Endosymbionten und Whitefly. 

Serie: Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and rates of mortality in populations, which has a variety of applications in ecology, including agricultural ecosystems. Horizontal, or cohort-based, life tables provide for the most direct and accurate method of quantifying vital population rates because they follow a group of individuals in a population from birth to death. Here, protocols are presented for conducting and analyzing cohort-based life tables in the field that takes advantage of the sessile nature of the immature life stages of a global insect pest, Bemisia tabaci. Individual insects are located on the underside of cotton leaves and are marked by drawing a small circle around the insect with a non-toxic pen. This insect can then be observed repeatedly over time with the aid of hand lenses to measure development from one stage to the next and to identify stage-specific causes of death associated with natural and introduced mortality forces. Analyses explain how to correctly measure multiple mortality forces that act contemporaneously within each stage and how to use such data to provide meaningful population dynamic metrics. The method does not directly account for adult survival and reproduction, which limits inference to dynamics of immature stages. An example is presented that focused on measuring the impact of bottom-up (plant quality) and top-down (natural enemies) effects on the mortality dynamics of B. tabaci in the cotton system.

Methodology for Developing Life Tables for Sessile Insects in the Field Using the Whitefly, Bemisia tabaci, in Cotton As a Model System

Life tables allow quantification of the sources and rates of mortality in insect populations and contribute to understanding, predicting and manipulating population dynamics in agroecosystems. Methods for conducting and analyzing cohort-based life tables in the field for an insect with sessile immature life stages are presented.

Methodik zur Entwicklung von Sterbetafeln für festsitzende Insekten im Feld mit der Mottenschildläuse Tabak Tabaci, in Baumwolle als ein Modellsystem

Life tables provide a means of measuring the schedules of birth and death from populations over time. They also can be used to quantify the sources and ...

Forschung

Umwelt

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms to questions surrounding insect's interactions with their host plants. Genomic resources are available for several aphid species, and with advances in the next-generation sequencing, transcriptomic studies are being extended to non-model organisms that lack genomes. Furthermore, aphid cultures can be collected from the field and reared in the laboratory for the use in organismal and molecular experiments to bridge the gap between ecological and genetic studies. Last, many aphids can be maintained in the laboratory on their preferred host plants in perpetual, parthenogenic life cycles allowing for comparisons of asexually reproducing genotypes. Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid, provides one such model to study insect interactions with toxic plants using both organismal and molecular experiments. Methods for the generation and maintenance of the plant and aphid cultures in the greenhouse and laboratory, DNA and RNA extractions, microsatellite analysis, de novo transcriptome assembly and annotation, transcriptome differential expression analysis, and qPCR verification of differentially expressed genes are outlined and discussed here.

Maintaining Biological Cultures and Measuring Gene Expression in Aphis nerii: A Non-model System for Plant-insect Interactions

The aphid Aphis nerii colonizes on highly-defended plants in the dogbane family (Apocyanaceae) and provides numerous opportunities to study plant-insect interactions. Here, we present a series of protocols for the maintenance of plant and aphid cultures, and the generation and analysis of molecular and -omic data for A. nerii.

Aufrechterhaltung der biologischen Kulturen und Messung der Genexpression in Aphis Nerii: Non-Modellsystem für Pflanzen-Insekten-Interaktionen

Aphids are excellent experimental models for a variety of biological questions ranging from the evolution of symbioses and the development of polyphenisms ...

Genetik

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Festsetzung des Ei Befruchtung Tabak Tabaci mit einer zytogenetischen Technik

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

Ein Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe) Assay für schnelle Identifizierung von Tabak tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluoreszenz<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierungen (FISH) für die Lokalisierung von Viren und Bakterien in Endosymbiotic Pflanzen-und Insekten Gewebe

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Immunologie und Infektion

Parasitierung des künstlichen Wirts durch Trichogramma dendrolimi und Giftextraktion

Extracting Venom from the Parasitoid Wasp Trichogramma dendrolimi Using an Artificial Host

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, parasitoid wasps inject venom into their hosts to suppress their hosts&#39; immunity, modulate hosts&#39; development, metabolism, and even behavior. With over 600,000 estimated species, the diversity of parasitoid wasps surpasses that of other venomous animals, such as snakes, cone snails, and spiders. Parasitoid wasp venom is an underexplored source of bioactive molecules with potential applications in pest control and medicine. However, collecting parasitoid venom is challenging due to the inability to use direct or electrical stimulation and the difficulty in dissection because of their small size. Trichogramma is a genus of tiny (~0.5 mm) egg parasitoid wasps that are widely used for the biological control of lepidopteran pests in both agriculture and forests. Here, we report a method for extracting venom from T. dendrolimi using artificial hosts. These artificial hosts are created with polyethylene film and amino acid solutions and then inoculated with Trichogramma wasps for parasitism. The venom was subsequently collected and concentrated. This method enables the extraction of large amounts of Trichogramma venom while avoiding contamination from other tissues caused by dissection, a common issue in venom reservoir dissection protocols. This innovative approach facilitates the study of Trichogramma venom, paving the way for new research and potential applications.

Autor im Rampenlicht: Effiziente Methode zur Extraktion von Gift aus Trichogramma parasitoiden Wespen 

Here, we present a protocol for extracting venom from Trichogramma dendrolimi using an artificial host created with polyethylene film and amino acid solution.

Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

Parasitoid wasps are a diverse group of hymenopteran insects that serve as invaluable resources for pest biocontrol. To ensure successful parasitism, ...

Biochemie

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Gründung der Virusinfektion und Analyse von Host-Virus-Wechselwirkung in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several genera of these whitefly-transmitted plant viruses (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus) include several hundred species of emerging and economically significant pathogens of important food and fiber crops (reviewed by9,10,16). These viruses do not replicate in their vector but nevertheless are moved readily from plant to plant by the adult whitefly by various means (reviewed by2,6,7,9,10,11,17). For most of these viruses whitefly feeding is required for acquisition and inoculation, while for others only probing is required. Many of these viruses are unable or cannot be easily transmitted by other means. Therefore maintenance of virus cultures, biological and molecular characterization (identification of host range and symptoms)3,13, ecology2,12, require that the viruses be transmitted to experimental hosts using the whitefly vector. In addition the development of new approaches to management, such as evaluation of new chemicals14 or compounds15, new cultural approaches1,4,19, or the selection and development of resistant cultivars7,8,18, requires the use of whiteflies for virus transmission. The use of whitefly transmission of plant viruses for the selection and development of resistant cultivars in breeding programs is particularly challenging7. Effective selection and screening for resistance employs large numbers of plants and there is a need for 100% of the plants to be inoculated in order to find the few genotypes which possess resistance genes. These studies use very large numbers of viruliferous whiteflies, often several times per year.
Whitefly maintenance described here can generate hundreds or thousands of adult whiteflies on plants each week, year round, without the contamination of other plant viruses. Plants free of both whiteflies and virus must be produced to introduce into the whitefly colony each week. Whitefly cultures must be kept free of whitefly pathogens, parasites, and parasitoids that can reduce whitefly populations and/or reduce the transmission efficiency of the virus. Colonies produced in the manner described can be quickly scaled to increase or decrease population numbers as needed, and can be adjusted to accommodate the feeding preferences of the whitefly based on the plant host of the virus.
There are two basic types of whitefly colonies that can be maintained: a nonviruliferous and a viruliferous whitefly colony. The nonviruliferous colony is composed of whiteflies reared on virus-free plants and allows the weekly availability of whiteflies which can be used to transmit viruses from different cultures. The viruliferous whitefly colony, composed of whiteflies reared on virus-infected plants, allows weekly availability of whiteflies which have acquired the virus thus omitting one step in the virus transmission process.

Improving our understanding of and our ability to manage many of the insect-transmitted plant viruses requires the use of the vector. Insect transmission of plant viruses is a tritrophic interaction, and as such requires the manipulation of insects, virus, and plant. Vectors must be reared in large numbers and manipulated in such a way as to insure high rates of transmission to test plants. The basics of rearing and manipulating the whitefly, Bemisa tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), a vector of plant viruses belonging to several emerging plant virus genera, representing a large number of economically significant viruses is presented.

Sendeanlage Viren Mit Weiße Fliegen

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, a complex of morphologically indistinquishable species5, are vectors of many plant viruses. Several ...

Methoden zur Extraktion von Endosymbionten aus der Whitefly

Zusammenfassung

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Methodik zur Entwicklung von Sterbetafeln für festsitzende Insekten im Feld mit der Mottenschildläuse Tabak Tabaci, in Baumwolle als ein Modellsystem

Aufrechterhaltung der biologischen Kulturen und Messung der Genexpression in Aphis Nerii: Non-Modellsystem für Pflanzen-Insekten-Interaktionen

Festsetzung des Ei Befruchtung Tabak Tabaci mit einer zytogenetischen Technik

Ein Loop-vermittelten isothermen Verstärkung (Lampe) Assay für schnelle Identifizierung von Tabak tabaci

Fluoreszenz

Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

Extraktion von Gift aus der parasitoiden Wespe Trichogramma dendrolimi mit Hilfe eines künstlichen Wirts

Gründung der Virusinfektion und Analyse von Host-Virus-Wechselwirkung in Drosophila Melanogaster

Sendeanlage Viren Mit Weiße Fliegen