Ricerca sostenuta da New Hampshire-INBRE attraverso un Premio di Sviluppo Istituzionale (IDeA), P20GM103506, presso l&#39;Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali del NIH.

Nota: le considerazioni di tempo per ogni dosaggio devono essere effettuate poiché le singole preparazioni per i supporti richiedono tempi diversi. Ad esempio, i supporti a lastre di agarro solido devono essere abbassati e asciugati (1-2 giorni). Ulteriori considerazioni di tempo ( cioè la colonia singola e la crescita della coltura durante la notte) sono specificate in ciascun protocollo e si trovano nella tabella 2 . 1. Preparazione dei supporti <ol><li> 1x salina a tampone fosfato (PBS) <ol><li> Pesare 4,0 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,72 g Na 2 HPO 4 e 0,12 g KH 2 PO 4 . Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 mL con acqua deionizzata, regolare il pH a 7,2 utilizzando un misuratore di pH e aggiungere HCl in goccia alla soluzione e sterilizzare con autoclave o filtro usando un filtro da 0,22 μm. 1x PBS può essere conservato a temperatura ambiente a tempo indeterminato. ATTENZIONE: HCl è un acido concentrato e deve essere manipolato secondoAlle norme istituzionali, locali, statali e federali. Per le linee guida appropriate per la manipolazione fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza fornita dal produttore. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) brodo <ol><li> Pesare 5,0 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito e 2,5 g di NaCl. Combinare i componenti in una bottiglia da 1 L, regolare il volume a 500 mL con acqua deionizzata, autoclave e conservare a temperatura ambiente fino a 6 mesi. Per le condizioni indotte da virulenza classica biotipo, regolare il pH a 6,5 ​​con HCl prima dell&#39;autoclavamento. </li></ol></li><li> AKI Medium contenente 0,03% (w / v) NaHCO 3 <ol><li> Per il componente 1 (medium AKI): pesare 7,5 g di peptone, 2,0 g di estratto di lievito e 2,5 g di NaCl. Combinare i componenti in una bottiglia da 1 L, regolare il volume a 450 mL con acqua deionizzata e autoclave. Il mezzo AKI può essere conservato a temperatura ambiente fino a 6 mesi. </li><li> Per il componente 2 (NaHCO 3 ): pesare 1,5 g di NaHCO 3 e regolare il volumeA 50 mL con acqua deionizzata in una vescicola sterile. Filtro sterilizzare NaHCO 3 utilizzando un filtro da 0,22 μm. NaHCO3 deve essere preparato immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Asepticamente combinare i due componenti creando un rapporto 1:10 filtrando il componente 2 nella componente 1 prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) piatti di agar <ol><li> Pesare 5,0 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito, 2,5 g di NaCl e 7,5 g di agar. Combinare i componenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 mL con acqua deionizzata, autoclave e preparare in piatti standard Petri di 100 mm x 15 mm sterili. I supporti placcati possono essere immagazzinati in plastica per un massimo di 6 mesi, con coperchio fino a 4 ° C. </li></ol></li><li> LB Agar Piatti Supplementati con Polymyxin B <ol><li> Per il componente 1 (agar LB): pesare 5,0 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito, 2,5 g di NaCl e 7,5 g di agar. Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 mL wiL&#39;acqua deionizzata e l&#39;autoclave. </li><li> Per il componente 2 (polimicina B): sciogliere la polimicina B in acqua deionizzata in un tubo sterile di microcentrifuga da 2 ml a una concentrazione di 50.000 UI / μl e sterilizzare con filtro utilizzando un filtro da 0,22 μm. </li><li> Una volta che il componente 1 è fresco al tocco, ma non ancora solidificato, aggiungere asetticamente 500 μL di componente 2 al componente 1 creando una concentrazione finale di 50 UI / μL e mescolare accuratamente. Preparare piatti standard Petri di 100 mm x 15 mm versando agar mischiati nei piatti di Petri. I supporti placcati possono essere immagazzinati in plastica per un massimo di 3 mesi, con coperchio fino a 4 ° C. </li></ol></li><li> Piatti minimi di agar di citrato <ol><li> Per il componente 1 (agar con blu bromotimolo): pesare 7,5 g di agar e 0,02 g di bromotimolo blu. Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 450 mL con acqua deionizzata e autoclave la miscela. </li><li> Per il componente 2 (10x VBMM): pesare 10,1 g di MgSO 4 7H 2 O, 10,0 g di acido citrico acido H 2 O, 50,0 g di K 2 HPO 4 anidro e 17,5 g di NaNH 4 HPO 4 4 H 2 O. Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 ml Con acqua deionizzata e sterilizzazione autoclave o filtro usando un filtro da 0,22 μm. 10x VBMM può essere conservato a temperatura ambiente fino a 6 mesi. </li><li> Aggiungere 50 ml di componente 2 al componente 1 e preparare in piatti standard Petri da 100 mm x 15 mm versando agar mischiati nei piatti di Petri. I supporti placcati possono essere immagazzinati in plastica per un massimo di 6 mesi, con coperchio fino a 4 ° C. </li></ol></li><li> Piatti di Agar Milk <ol><li> Per il componente 1 (latte): pesare 8,0 g di latte secco non grasso istantaneo in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 200 ml con acqua deionizzata e autoclave. </li><li> Per il componente 2 (agar con infusione cerebrale-cuore): pesare 3,68 g di infusione cerebrale-cuore e 6,0 g di agar. Combina il conIn un pallone Erlenmeyer da 500 mL, regolare il volume a 200 mL con acqua deionizzata e autoclave. </li><li> Combinate i due componenti versando il componente 2 nella componente 1, dopo aver autoclavato e mescolato accuratamente. Preparare in piatti di Petri sterili da 150 mm x 15 mm. Le piastre di latte possono essere conservate fino a una settimana avvolte in plastica, con coperchio verso il basso a 4 ° C. Preparare in piatti di Petri sterili da 150 mm x 15 mm versando agar mischiati nei piatti di Petri. </li></ol></li><li> Piastre di agaricità <ol><li> Per il componente 1 (LB agar): pesare 5,0 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito, 2,5 g di NaCl e 2,0 g di agar. Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 mL con acqua deionizzata e autoclave. </li><li> Per il componente 2 (1% (w / v) cloruro di trifeniltetrazolium; TTC): pesare 0,25 g di TTC. Regolare il volume a 25 ml con acqua deionizzata in una vescicola sterile e sterilizzare con filtro utilizzando un filtro da 0,22 μm. Conservare fino a 6 mesi a temperatura ambiente avvoltoIn foglio per minimizzare l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di 1% (w / v) TTC sterile ai supporti autoclavati. </li><li> Versare il mezzo più spesso possibile (≥50 mL / piastra) in grandi piatti di Petri sterili 150 mm x 15 mm. I supporti placcati possono essere immagazzinati in plastica fino a una settimana, con coperchio fino a 4 ° C. Preparare in piatti di Petri sterili da 150 mm x 15 mm versando agar mischiati nei piatti di Petri. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) <ol><li> Per il componente 1 (Methyl Red-Voges-Proskauer broth; MR-VP): pesare 1,7 g di supporto MR-VP in un pallone Erlenmeyer da 500 ml, regolare il volume a 100 ml con acqua deionizzata e autoclave. Il brodo sterile MR-VP può essere conservato a temperatura ambiente fino a 6 mesi. </li><li> Per il componente 2 (5% (w / v) alfa (α) naphtolo): pesare 1,0 g di α-naftolo in una vescicola sterile e regolare il volume a 20 ml con 95% etanolo. L&#39;α-naftolo può essere conservato a temperatura ambiente fino a 1 settimana avvolto in fogli per ridurre al minimo la luceosure. </li><li> Per il componente 3 (40% (w / v) idrossido di potassio; KOH): pesare 20,0 g di KOH in una vescicola sterile, regolare il volume a 50 ml con acqua sterile deionizzata. KOH può essere conservato fino a 6 mesi a temperatura ambiente in un recipiente di plastica. </li></ol></li></ol> 2. Manutenzione e crescita di V. Ceppi di colera <ol><li> Preparazione e utilizzo di colture congelate <ol><li> Pellet 1.8 ml di coltura di notte per 2 min per centrifugazione (≥8.600 xg) in un tubo sterile di microcentrifuga da 2 ml, rimuovere il surnatante e riposizionare il pellet cellulare in 900 μL di brodo fresco di LB pipettando. </li><li> Aggiungere 900 μL di glicerolo sterile al 60% (v / v) alla coltura e mescolare mediante vortexing. </li><li> Trasferire la miscela in un tubo criogenico sterile da 2 ml e conservare a tempo indeterminato a -80 ° C. </li><li> Per utilizzare, rimuovere una piccola quantità di stock congelata usando un ciclo inoculatore sterile e una striscia per singole colonie su LB agAr. Immediatamente rimettere a magazzino congelato a -80 ° C dopo l&#39;uso per evitare che le culture si scongiurino completamente. Incubare le piastre con il coperchio lungo il basso per 12 a 16 ore a 37 ° C. </li></ol></li><li> Crescita di culture di overnight in liquido medio <ol><li> Striature per colonie singole (secondo la sezione 2.1.4) da scorte surgelate su piastre LB agar. Incubare le piastre con il coperchio laterale per 12 a 16 ore a 37 ° C. </li><li> Inoculare 4 ml di liquido LB liquido in un tubo di coltura sterile da 10 ml con una singola colonia toccando la superficie della singola colonia con un bastone applicatore sterile e trasferendo la colonia nel brodo liquido. </li><li> Incubare con aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min per 12 a 16 h a 37 ° C. </li></ol></li><li> Curva di crescita <ol><li> Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2. </li><li> Fai una diluizione 1: 100 di coltura durante la notte trasferendo 250 μL di coltura overnight a 25 ml di brodo fresco di LB in un pallone Erlenmeyer da 250 ml sterile. </li><li> Misurare la densità ottica delle colture liquide a 600 nm (OD 600 ) ogni ora a partire dall&#39;inoculazione (T 0 ). </li><li> Incubare una diluizione 1: 100 di coltura durante la notte con aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min fino a 30 h a 37 ° C o fino a raggiungere la massima densità della coltura. </li><li> Grafico OD 600 vs. tempo e utilizzare regressione lineare per determinare il tempo di raddoppio approssimativo per ogni ceppo. </li></ol></li><li> El Tor Biotipo Virulenza Induzione delle Condizioni <ol><li> Striata per singole colonie da scorta congelata su piastre LB agar. Incubare le piastre verso il basso con coperchio, per 12 a 16 ore a 37 ° C. </li><li> Inoculare 10 mL di mezzo AKI contenente 0,03% (w / v) NaHCO 3 con una sola colonia. </li><li> Incubare la coltura senza aerazione a 37 ° C per 3,5 ore. </li><li> Rimuovere 7 mL di coltura e incubare le restanti 3 mL di cultuCon aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min per altri 4 h. </li></ol></li><li> Condizioni di inducimento della virulenza di biotipo classico <ol><li> Striata per singole colonie da scorta congelata su piastre LB agar. Incubare le piastre con il coperchio laterale per 12 a 16 ore a 37 ° C. </li><li> Inoculare 4 mL di liquido LB liquido (pH 6,5) con una singola colonia. </li><li> Incubare con aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min per 12 a 16 h a 30 ° C. </li></ol></li><li> Pellet cella di lavaggio in 1x PBS <ol><li> Pellet 1.8 ml di coltura durante la notte per 2 min per centrifugazione (≥8.600 xg) in un tubo sterile di microcentrifuga da 2 ml e rimuovere il surnatante usando una pipetta. Riposizionare il pellet di cellula in 1,8 ml di 1x PBS pipettando. </li><li> Ripetere la procedura di lavaggio tre volte seguita da una resuspensione finale in 1,8 mL di 1x PBS. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazione V. Biotipi del colera <ol><li> PSchermate genetiche basate su CR utilizzando ctxB e tcpA <ol><li> Progettare un insieme di primer, che annealizzano circa 50-70 bp a monte ea valle degli start e stop di traslazione di ctxB e tcpA. </li><li> Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2. </li><li> Isolare il DNA cromosomico utilizzando un kit commercialmente disponibile per i batteri Gram-negativi. Il DNA cromosomico purificato può essere immagazzinato indefinitamente a -20 ° C. L&#39;isolamento cromosomico del DNA usando i kit disponibili in commercio richiede generalmente circa 4 h. </li><li> Utilizzare un spettrofotometro a micro-volume per assicurare che il campione del DNA cromosomico sia di alta qualità (A 260/280 &gt; 1,8). </li><li> Per ciascun isolamento cromosomico del DNA, preparare le reazioni di polimerasi (PCR) su ghiaccio nel tubo sterile di 200 μl di PCR e amplificare le regioni di ctxB e tcpA usando componenti standard PCR: Taq polimerasi e buFfer (o equivalenti), soluzione dNTP e primer avanti / indietro. Utilizzare parametri standard PCR (~ 3 h). Ad esempio, utilizzare il seguente protocollo: <ol><li> Denatura iniziale a 95 ° C per 120 s. </li><li> Denatura a 95 ° C per 60 s. </li><li> Applicare primer a 60 ° C per 45 s. </li><li> Estendere a 72 ° C per 90 s. </li><li> Ripetere i passaggi da 3.1.5.2 a 3.1.5.4 per 34 cicli. </li><li> Estensione finale 72 ° C per 600 s. </li><li> Tenuta infinita a 4 ° C. </li></ol></li><li> Dye 5 μL di rispettivi prodotti PCR usando un colorante di caricamento a gel di DNA standard 6x e caricare circa 10 μL di scala 1 kb e 10 μL di prodotto PCR su un gel agarosico al 1% in 1x Tris-Borato-EDTA (TBE) buffer. </li><li> Eseguire l&#39;elettroforesi a gel a 130 V finché il frontale del colorante non raggiunge la fine, ma non fuori, del gel (circa 90 minuti). Si consiglia di monitorare costantemente come tensione e tempi di funzionamento possono variare a seconda dell&#39;apparecchiatura. </li><li> Alla verifica delUna amplificazione PCR di successo alla dimensione prevista, purificare il restante 45 μl di prodotto PCR usando un kit di pulizia e concentratore del DNA disponibili in commercio. </li><li> Sequenza di prodotti PCR puliti utilizzando gli stessi primer utilizzati per l&#39;amplificazione PCR e prepararsi secondo le linee guida locali di sequenziamento. </li><li> Confronta il formato FASTA di sequenze di gene da ogni isolato alla sequenza pubblicata disponibile sul sito NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), cercando i seguenti numeri di accesso nella casella della query di ricerca. </li><li> CtxB : regione (classica) tra VC0395_A1059 a VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456 </li><li> TcpA : (classico) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828 </li></ol></li><li> Analisi fenotipiche per la classificazione di biotipo mediante spotting <ol><li> Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2. </li><li> Lavare le pellicole di cellule come specificato nel protocollo 2.6. </li><li> Usare una pipetta aSpot 1 μl di coltura lavata in corrispondente mezzo. Per le specifiche di selezione e incubazione medio, fare riferimento alla Tabella 2. </li></ol></li><li> Analisi della carenza <ol><li> Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2. </li><li> Lavare le pellicole di cellule come specificato nel protocollo 2.6. </li><li> Inoculare le piastre di agarità agarico inserendo l&#39;inoculazione dello straccio nella coltura liquida lavata e &quot;pungere&quot; verticalmente nei supporti. In mezzo a ogni inoculazione, sterilizzare il coltello con un bruciatore di Bunsen e, quando pigiate l&#39;agar, assicurati che il pungo inoculato non si piega, in quanto ciò può alterare i risultati. </li><li> Incubare le piastre con il coperchio verso l&#39;alto per 14 a 24 ore a 37 ° C. Dopo 14 ore, controllare le piastre di movimento per evitare la crescita eccessiva di culture. </li></ol></li><li> Analisi Voges-Proskauer (VP) <ol><li> Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2. </li><li> Inoculare 4Ml di Voges-Proskauer rosso o rosso di metile, o brodo MR-VP, pipettando 10 μL di coltura overnight in precedenza preparata in 4 mL di brodo MR-VP in un tubo di coltura sterile e incubato con aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min per 12 a 16 H a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 150 μl di α-naftolo al 5% (w / v) e 50 μl 40% (w / v) KOH in 1 ml aliquote di coltura overnight di MR-VP in tubi di coltura sterile rispettivamente. </li><li> Brevemente vortice e lasciate stare a temperatura ambiente fino a 4 h fino a quando non cambia colore. </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Dei oltre 200 identificati V. Colerae, solo O1 e O139 hanno un potenziale epidemico. Il serogroup di O1 può essere suddiviso in due biotipi: classici e El Tor. Tuttavia, sono emersi i ceppi ibridi, denominati varianti El Tor 13 , 17 , che possiedono il background Biotipo El Tor e le caratteristiche classiche del porto 8 , 9 , 10 , ...

Il colera è una malattia dell&#39;intestino tenue distale causata dal consumo di alimenti contaminati o di acqua contenente il batterio Gram-negativo acquatico Vibrio cholerae . I sintomi del colera includono vomito e diarrea acquosa incontrollabile, portando ad una grave disidratazione che, se non trattata correttamente, provocherà la morte. V. Il colerae può essere diviso in oltre 200 serogruppi basati sulla struttura del lipopolysaccharide O-antigene della superficie cellulare. Tuttavia, solo 2 serogruppi, O1 e O139, hanno mostrato potenziale epidemico o pandemico 1 , 2 . Inoltre, il serogroup O139 è stato principalmente isolato per l&#39;Asia sud-orientale 3 , 4 , mentre il sierogruppo O1 è distribuito in tutto il mondo. Inoltre, il serogroupo O1 può essere diviso in 2 biotipi principali: classici e El Tor. Il biotipo classico era responsabile delle prime 6 pandemie del coleraTra il 1817 e il 1923. La peggiorata settima pandemia è il risultato del biotipo El Tor, che ha spostato globalmente il biotipo classico nell&#39;ambiente 5 , 6 , 7 . Sono stati recentemente presentati ceppi che contengono caratteristiche distintive di biotipi classici e El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 e da allora sono stati denominati varianti El Tor 13 , 17 . Alcune varianti di El Tor hanno dimostrato elevate capacità di virulenza con una progressione più rapida e grave della malattia rispetto a quanto precedentemente osservato, sottolineandoLa necessità di un approccio più completo all&#39;identificazione degli agenti e alla prevenzione e trattamento delle malattie 8 , 9 , 18 . Mentre l&#39;identificazione del biotipo non impone immediatamente il trattamento, ulteriori progressi nello sviluppo del vaccino e nei futuri agenti terapeutici possono beneficiare della distinzione tra biotipo. La prima serie di protocolli elencati qui consentirà agli investigatori di mantenere correttamente V. Ceppi di colera in un ambiente di laboratorio. La coerenza e l&#39;analisi successiva richiedono la preparazione e la crescita degli stock di isolati, che non dipendono dal biotipo. Tuttavia, per indurre in modo ottimale l&#39;espressione genica di virulenza, sono necessarie tecniche indipendenti di coltura biotipo 19 . Inoltre, la preparazione per diversi dosaggi genetici e biochimici è descritta in questo manoscritto. Tossina del colera (CT) e la tossina co-re(TCP) sono due principali fattori di virulenza controllati dal regolatore master ToxT in entrambi i biotipi del V. Il colerae O1 sierogruppo 20 . CT è una tossina bipartita composta da cinque CtxB Subunità che circondano una singola subunità CtxA ed è responsabile della rapida perdita di elettroliti associata al colera. Il TCP è un pilone di tipo IV codificato dal tcp operon ( tcpABQCRDSTEF ) ed è coinvolto nell&#39;attaccamento e nella colonizzazione dell&#39;intestino tenue distale. TcpA è il primo gene dell&#39;operone tcp che codifica le singole subunità piline essenziali per la costruzione del pilus 8 . La sequenza genica per ctxA è completamente conservata tra biotipi classici e El Tor, mentre ctxB e tcpA si differenziano tra i due biotipi ma sono conservati all&#39;interno di ciascun biotipo 8 . CtxB è completamente conservato tra i biotipi ad eccezione di due posi base(115 e 203). Nel biotipo El Tor, la timina risiede nelle posizioni base 115 e 203, mentre il biotipo classico contiene citosina a queste basi. TcpA è completamente conservato all&#39;interno di ogni biotipo, ma differisce da molteplici basi tra biotipi. Queste distinzioni genetiche servono come marcatori di identificazione biotipo primari, e dopo la sequenza del prodotto di amplificazione della reazione di polimerasi (PCR), inclusi questi siti, le sequenze di isolamento possono essere confrontate con il classico O395 o WT El Tor N16961 di tipo wild (WT) per determinare lo sfondo del biotipo Di CT e TCP rispettivamente, in un dato isolamento di V. cholerae . Numerosi protocolli sono stati sviluppati per caratterizzare le distinzioni fenotipiche tra i biotipi classici e El Tor 21 , 22 , 23 . Polimicina B è un antibiotico peptidico che compromette l&#39;integrità della membrana cellulare esterna in bacTeria e la resistenza alla polimicina B possono essere visualizzati attraverso il saggio di resistenza della polimigina B 21 . Il citrato è un substrato primario del ciclo di Kreb, e la capacità di metabolizzare il citrato come fonte di carbonio unica può essere determinata usando il saggio del metabolismo citrato 22 . HapR codifica un regolatore globale e il regolatore di sensori quorum master in V. cholerae, HapR, che si lega a varie regioni del promotore e regola l&#39;espressione del gene e dell&#39;operone 24 . Alcuni ceppi patogeni di V. cholerae hanno una mutazione in movimento naturale nel gene hapR che ha causato la perdita di questa regolazione dipendente dalla densità dell&#39;espressione genetica di virulenza 24 , 25 . La misurazione dell&#39;attività di proteasi regolata da HapR utilizzando il supporto agarico del latte permette al ricercatore di identificare se un particolare isolato contiene un HapR 23 funzionale. IlI test di hemolysis per una capacità del ceppo di secernere enzimi emolitici che lissano i globuli rossi; Il grado di emolisi può essere visualizzato sulle piastre di agar sangue 23 . La motilità è spesso associata alla virulenza di V. cholerae e può essere analizzata usando le piastre agarico agar 23 . Il test Voges-Proskauer esamina la capacità di uno strain di fermentare il glucosio come una sola fonte di carbonio e produrre l&#39;acetoina sottoprodotto 21 . Con l&#39;emergere di varianti di El Tor, è difficile prevedere i risultati di un determinato dosaggio fenotipico senza estesa screening genotipica e prima di dedurre lo sfondo biotipo di V. Isolati di colerae, si raccomanda di eseguire questo insieme di dosaggi 23 e confrontare i risultati con i ceppi di riferimento come nella tabella 2 . In questo contesto, abbiamo avanzato una serie di protocolli, utilizzando collettivamente l&#39;aforemeI test genotipici e fenotipici per un approccio più completo alla caratterizzazione di V. Biotipi di colera. Inoltre, abbiamo descritto le distinzioni genotipiche e fenotipiche del V noto. Varianti del colerae El Tor (MQ1795 e BAA-2163), rispetto ai ceppi di riferimento di biotipo comunemente usati (WT classico O395, WT El Tor C6706 e WT El Tor N16961, Tabella 1 ). L&#39;emergere di varianti El Tor ha presentato sfide all&#39;affidabilità dei protocolli di individuazione biotipo di singolo dosaggio precedentemente impiegati; Tuttavia, questo sistema di identificazione multipla consentirà una caratterizzazione più affidabile dei criteri clinici e ambientali. Isolati di colera .

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder</td></tr><tr><td>60% Glycerol</td><td>Calbiochem</td><td>356352</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>214030</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Agar with brain-heart infusion</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>237500</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Peqlab</td><td>732-2789</td><td>https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&amp;amp;_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&amp;amp;_dynSessConf=1766917479792147141&amp;amp;targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&amp;amp;lastLanguage=en&amp;amp;/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&amp;amp;_D%3AcurrentLanguage=+&amp;amp;currentLanguage=en&amp;amp;_D%3AlastLanguage=+&amp;amp;_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+</td></tr><tr><td>Anhydrous K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P288500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Blood Agar Plates</td><td>Remel</td><td>R01200</td><td>Store at 4 &amp;deg;C;&amp;nbsp; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=A73500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Bromothymol Blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B388-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=B38810&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Cirtric acid &amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S72836-3</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C;&amp;nbsp; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset</td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S311500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>DNA Clean &amp;amp; Concentrator&amp;trade; -25 Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4007</td><td>http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit</td></tr><tr><td>GelGreen Nucleic Acid Stain</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td>https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/</td></tr><tr><td>Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-208100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100</td></tr><tr><td>Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit</td><td>Qiagen</td><td>158567</td><td>https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Corrosive;&amp;nbsp; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=A144212&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P217500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P285500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P250500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Le Loop</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP190-25</td><td>http://deconlabs.com/products/leloop/</td></tr><tr><td>Le Stab</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP186-5</td><td>http://deconlabs.com/products/lestab/</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=M63500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1704406</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&amp;amp;WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&amp;amp;WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373</td></tr><tr><td>MR-VP Broth</td><td>Difco</td><td>216300</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S374500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S27110&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S233500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S218-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S218500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Spectrophtometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR</td></tr><tr><td>Nonfat dry milk</td><td>Nestle Carnation</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211677</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Petri Dishes (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712</td></tr><tr><td>Petri Dishes (150 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=FB0875714&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Polymyxin B sulfate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1004-10MU</td><td>Store at 2-4 &amp;deg;C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C;&amp;nbsp; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1840148</td><td>http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&amp;amp;_pageLabel=search_page&amp;amp;sfMode=search&amp;amp;sfStartNumber=1&amp;amp;clearQR=true&amp;amp;js=1&amp;amp;searchString=1840148&amp;amp;database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&amp;amp;tabName=DIVISIONNAME</td></tr><tr><td>Triphenyltetrazolium chloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10870</td><td>https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=BP1521&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211705</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>212750</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-napthol</td><td>MP Biomedicals</td><td>204189</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189</td></tr></tbody></table>

laboratory techniques used to maintain and differentiate biotypes of vibrio cholerae clinical and environmental isolates

Il batterio Gram-negativo acquatico Vibrio cholerae è l&#39;agente etiologico del colera della malattia gastrointestinale infettiva. A causa della prevalenza e gravità globali di questa malattia, V. Il colera è stato ampiamente studiato sia in ambito ambientale che in laboratorio, che richiede una corretta manutenzione e tecniche di coltura. Classici e El Tor sono due biotipi principali che compongono il V. Colerae O1, ognuno dei quali presenta caratteristiche uniche genotipiche e fenotipiche che forniscono meccanismi affidabili per la caratterizzazione del biotipo e richiedono condizioni distintive di coltura che inducono la virulenza. Indipendentemente dal biotipo del ceppo causale per qualsiasi infezione o focolaio, il trattamento standard per la malattia comprende terapia di reidratazione integrata con un regime di antibiotici. Tuttavia, la classificazione di biotipo può essere necessaria per studi di laboratorio e può avere impatti più ampi nel campo biomedico.Nei primi anni 2000 sono stati identificati isolati clinici che presentano tratti genotipici e fenotipici sia dai biotipi classici che da El Tor. Gli ibridi di nuova identificazione, chiamati El Tor, hanno causato l&#39;identificazione clinica e ambientale del biotipo di isolamento a diventare più complessi rispetto ai precedenti protocolli tradizionali di identificazione singola. Oltre a descrivere V. Le tecniche di mantenimento e tecniche di coltura del colerae, questo manoscritto descrive una serie di schermati genetici basati su PCR basati su gene ( ctxB e tcpA ) e saggi fenotipici (resistenza alla polimicina B, metabolismo citrato, attività proteolitica, attività emolitica, motilità e metabolismo del glucosio tramite Voges- Proskauer) utilizzati collettivamente per caratterizzare e / o distinguere tra biotipi classici e El Tor. Insieme, questi dosaggi forniscono un approccio sistematico efficiente da utilizzare come alternativa o, in aggiunta, a costosi esercizi di intensità lavorativa nella caratterizzazioneDi V. Cholerae isolati clinici (e ambientali).

Per una corretta manutenzione e l&#39;uso di qualsiasi ceppo batterico, è consigliabile conoscere il tempo di raddoppiamento dei ceppi di interesse. Qui, i tassi di crescita variabili dei V comunemente usati. I ceppi del colerae sono stati dimostrati attraverso una curva di crescita e sono stati calcolati approssimativi tempi di raddoppio utilizzando la regressione lineare. Il WT El Tor N16961 e la variante El Tor MQ1795 hanno dimostrato tempi di raddoppio più brevi (...

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Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Questo manoscritto descrive le appropriate tecniche di manutenzione Vibrio cholerae oltre ad una serie di dosaggi biochimici, utilizzati collettivamente per una differenziazione rapida e affidabile tra la clinica e l&#39;ambiente V. Biotipi di colera in un ambiente di laboratorio.

Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Isolati clinici ed ambientali

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

laboratory-techniques-used-to-maintain-differentiate-biotypes-vibrio

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

10.8K Views.  Plymouth State University.  Questo manoscritto descrive le appropriate tecniche di manutenzione Vibrio cholerae oltre ad una serie di dosaggi biochimici, utilizzati collettivamente per una differenziazione rapida e affidabile tra la clinica e l'ambiente V. Biotipi di colera in un ambiente di laboratorio. 

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Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

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Immunologia e infezioni

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - un metodo per modificare geneticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Sulla base di trasformazione naturale e FLP-ricombinazione

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is a significant nosocomial pathogen. C. difficile is notoriously difficult to isolate and cultivate and is extremely sensitive to even low levels of oxygen in the environment. Here, methods for isolating C. difficile from fecal samples and subsequently culturing C. difficile for preparation of glycerol stocks for long-term storage are presented. Techniques for preparing and enumerating spore stocks in the laboratory for a variety of downstream applications including microscopy and animal studies are also described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which maintains a consistent anaerobic environment to ensure proper conditions for optimal C. difficile growth. We provide protocols for transferring materials in and out of the chamber without causing significant oxygen contamination along with suggestions for regular maintenance required to sustain the appropriate anaerobic environment for efficient and consistent C. difficile cultivation.

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a pathogenic bacterium that is a strict anaerobe and causes antibiotic associated diarrhea (AAD). Here, methods for isolating, culturing and maintaining C. difficile vegetative cells and spores are described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which requires regular maintenance to ensure proper conditions for optimal C. difficile cultivation.

Coltura e manutenzione<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In un ambiente anaerobico

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Sviluppo di un più sensibile e specifica Chromogenic Agar Media per la rilevazione di<em&gt; Parahaemolyticus Vibrio</em&gt; E Altro<em&gt; Vibrio</em&gt; Specie

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In risposta al trattamento antibiotico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

Induzione della differenziazione cellulare e dell&#39;immagine delle cellule singole di<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Nuotatore e cellule Swarmer

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the aquatic environment, where it interacts with a variety of higher aquatic species. Vertebrate fish are known to be an environmental host and are a potential V. cholerae reservoir in nature. Both V. cholerae and the teleost fish species Danio rerio, commonly known as zebrafish, originate from the Indian subcontinent, suggesting a long-standing interaction in aquatic environments. Zebrafish are an ideal model organism for studying many aspects of biology, including infectious diseases. Zebrafish can be easily and rapidly colonized by V. cholerae after exposure in water. Intestinal colonization by V. cholerae leads to the production of diarrhea and the excretion of replicated V. cholerae. These excreted bacteria can then go on to colonize new fish hosts. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae-intestinal colonization in zebrafish and how to quantify V. cholerae-induced zebrafish diarrhea. The colonization model should be useful to researchers who are studying whether genes of interest may be important for host colonization and/or for environmental survival. The quantification of zebrafish diarrhea should be useful to researchers studying any intestinal pathogen who are interested in exploring zebrafish as a model system.

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish are a natural Vibrio cholerae host and can be used to recapitulate and study the entire infectious cycle from colonization to transmission. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae colonization levels and quantify diarrhea in zebrafish.

Quantificare la colonizzazione di Vibrio cholerae e diarrea nel modello Zebrafish adulto

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

Coincubation Valutazione per quantificare le interazioni competitive tra Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Rapid Protocollo per la preparazione di elettrocompetenti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; E<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di

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Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

TransFLP - un metodo per modificare geneticamente

Coltura e manutenzione

Sviluppo di un più sensibile e specifica Chromogenic Agar Media per la rilevazione di

Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di

Induzione della differenziazione cellulare e dell'immagine delle cellule singole di

Formazione di Biofilm indotta da sali biliari in patogeni enterici: tecniche di identificazione e quantificazione

Quantificare la colonizzazione di Vibrio cholerae e diarrea nel modello Zebrafish adulto

Coincubation Valutazione per quantificare le interazioni competitive tra Vibrio fischeri Isolates

Rapid Protocollo per la preparazione di elettrocompetenti