Grazie alla melodia Neely, Jon Allen, Basilea Abuaita e Donna Runft per il loro impegno nel contribuire a sviluppare il modello di zebrafish. La ricerca segnalata qui è stata sostenuta dal National Institute of Allergy e malattie infettive dei National Institutes of Health, sotto numeri del premio R21AI095520 e R01AI127390 (per Jeffrey H. Withey). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Wayne State University. Questo metodo è stato descritto in Runft et al. 12
1. determinazione dei livelli di colonizzazione intestinale
Nota: Colonizzazione intestinale è la metrica più utile nel modello zebrafish come può essere utilizzato per confrontare la relativa idoneità dei vari ceppi di V. cholerae o gli effetti di mutazioni o di knockout del gene.
<ol><li>Inoculazione di zebrafish per immersione Nota: Questo mezzo di esposizione è simile il corso naturale dell'infezione.<ol>
<li>Preparazione di V. cholerae
		<ol>
<li>Inoculare 5 mL di brodo di Lisogenesi (LB) con un isolato V. cholerae Colonia da un LB piastra e incubare a + 37 ° C con agitazione (180 giri/min) 6 – 8 h (cultura durante la notte).</li>
			<li>Inoculare 25 mL di terreno LB autoclavato fresco in una beuta da 250 mL con 50 µ l della coltura durante la notte precedente. Incubare per 16 – 18 h a 37 ° C con agitazione (150 rpm).</li>
			<li>Leggere la densità ottica a 600 nm (OD600) di una diluizione di 1/10 della cultura durante la notte per stimare il numero di batteri / mL (il OD600 = 1 è ~ 109 CFU/mL.)</li>
			<li>Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 6.000 g per 10 min. Rimuovi il supporto con una pipetta o versarlo fuori in una soluzione disinfettante. Risospendere le cellule in PBS sterile fino alla concentrazione desiderata, in genere tra 1 x 107 a 1 x 1010 per ml di PBS. Nota: Qui, ci riferiamo a sterilizzato nell'autoclave acqua ad osmosi inversa che contiene sali di mare di 60 mg/L come acqua sterile infezione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Inoculazione e incubazione
		<ol>
<li>Inserire quattro o cinque zebrafish in un becher da 400 mL contenente 200 mL di acqua sterile infezione.</li>
			<li>Aggiungere 1 mL di V. cholerae (dal passaggio 1.1.1.4.) per ottenere la concentrazione desiderata di infezione (in genere 5 x 104 a 5 x 107 CFU/mL) in 200 mL di acqua di infezione.</li>
			<li>Coprire il becher con un coperchio forato per impedire che il pesce che salta fuori; parte superiore di una casella di punta di 200 µ l funziona bene per questo.</li>
			<li>Etichettare ogni bicchiere e inserirli in un'incubatrice di vetro anteriore regolato a 28 ° C per la durata dell'esperimento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Procedura per l'esposizione transitoria Nota: Un'esposizione transitoria a V. cholerae (in genere 6 h) seguita dalla rimozione dei batteri da inoculo è utile per studiare la trasmissione e per la più accurata quantificazione dei batteri escreti.<ol>
<li>Dopo 6 h di esposizione, versare l'acqua Becher attraverso una rete da pesca per raccogliere i pesci. Gettare l'acqua infetto in un contenitore di candeggina per uccidere il V. cholerae.</li>
			<li>Mettere il pesce rimosso in un becher di 200 mL di acqua sterile infezione. Consentire il pesce a nuotare in questa acqua pulita per 5 min rimuovere i batteri dalla superficie del pesce.</li>
			<li>Ripetere la procedura netta (punto 1.2.2) e mettere il pesce in un becher da nuovo di 200 mL di acqua sterile infezione. Tenere i pesci in questo bicchiere per tutta la durata dell'esperimento.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Eutanasia
	<ol>
<li>Quando l'esperimento ha raggiunto il suo endpoint desiderato, prendere un campione dell'infezione dell'acqua (15 mL è in genere sufficiente) per consentire escreti conta batterica e la misurazione di diarrea (ad esempio analisi di mucina, contenuto proteico, e/o OD), se lo si desidera (sezione 2).</li>
		<li>Versare il resto dell'acqua attraverso una rete da pesca (per raccogliere il pesce) in candeggina per uccidere il V. cholerae in acqua.</li>
		<li>Mettere il pesce in un becher contenente acqua di infezione più 336 µ g/mL di etile 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaina) ed incubare il pesce in questa soluzione di tricaina per 20 minuti a TA. Nota: Le calze a rete sono stati sterilizzati con una soluzione di candeggina al 10%.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissezione
	<ol>
<li>Preparazione del pesce<ol>
<li>Scoop di un pesce dalla soluzione di tricaina con un cucchiaio di plastica usa e getta e posizionarlo sulla superficie per dissezione.</li>
			<li>Posizione il pesce con il suo lato ventrale rivolta verso l'alto e il pin attraverso la mascella inferiore, con l'estremità smussata del perno angolato lontano dal centro del corpo. Mettete un altro perno appena posteriormente all'ano, anche angolato lontano dal corpo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Esposizione del tratto intestinale<ol>
<li>Tamponare la superficie ventrale del pesce con un panno privo di lanugine tuffato in etanolo al 70%.</li>
			<li>Sterilizzare un bisturi e forbici di Allerød immergendoli in etanolo al 70% e fiammeggiante li.</li>
			<li>Praticare una piccola incisione longitudinale nella pancia appena sotto la pelle penetrando le squame e utilizzando il bisturi. Fare attenzione a non tagliare troppo in profondità, come il tratto intestinale si trova appena sotto la pelle.</li>
			<li>Usando le forbici, estendere l'incisione attentamente lungo la lunghezza del corpo, di taglio non più a livello cutaneo profondo ed evitando l'ano.</li>
			<li>Fare due tagli laterali con le forbici verso la testa del pesce per consentire un'apertura dell'incisione.</li>
			<li>Pin la pelle su ogni lato delle incisioni laterali alla superficie per dissezione, pesca i perni fuori, lontano dal corpo. Nota: Le punte dei perni sono state sterilizzate in precedenza da loro fiammeggiante con alcool.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Rimozione del tratto intestinale Nota: Il tratto intestinale dovrebbe essere visibile come un tubo pallido, molto sottile in cima gli altri organi.<ol>
<li>Fiamma-sterilizzare il forcipe e quindi utilizzarli per rimuovere l'intero tratto intestinale (in genere 12 – 15 mm di lunghezza). Posizionare l'intestino in una provetta di omogeneizzazione contenente perle di vetro (Vedi passi 1.4.1–1.4.2) e 1 mL di 1X PBS o LB, sul ghiaccio.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Omogeneizzazione
	<ol>
<li>Preparare i tubi di omogeneizzazione in anticipo da versare ~1.5 g di perle di vetro di 1 mm in 2 mL tappo a vite provette (riempirli circa a metà strada) e poi li sterilizzare in autoclave.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di LB sterile o 1X PBS.</li>
		<li>Una volta che l'intestino di zebrafish sono state vite aggiunto (passo 1.3.3.1) per i tubi, i tappi su molto strettamente e poi fissare i tubi nell'omogeneizzatore di vortice.</li>
		<li>Omogeneizzare i campioni per 1 min all'impostazione massima, poi raffreddare li sul ghiaccio per un minimo di 1 – 2 Ripetere questo ciclo di omogeneizzazione ancora una volta per una completa omogeneizzazione. Nota: Diversi metodi alternativi per omogeneizzazione funziona anche.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificare i livelli di colonizzazione intestinale
	<ol>
<li>Preparare le provette (provette di vetro piccolo o provette microcentrifuga da 1,5 mL) per la diluizione seriale dell'omogenato aggiungendo 900 µ l di LB o 1X PBS in ogni provetta. Per ogni pesce, preparare 5 – 6 provette e fai 10 volte diluizioni seriali dell'omogenato intestinale aggiungendo 100 µ l di omogenato al primo tubo, Vortex di mix e quindi aggiungendo 100 µ l dalla provetta prima il secondo tubo.</li>
		<li>Ripetere questa procedura fino a quando tutte le diluizioni sono state preparate.</li>
		<li>Piastra di 100-200 µ l di ciascuna diluizione su piastre di agar LB contenente 100 µ g/mL di streptomicina (se utilizza ceppi resistenti streptomicina) e 40 µ g/mL del X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incubare le piastre a 30 ° C per 16 – 18 h.</li>
		<li>Dopo l'incubazione overnight, conteggio V. cholerae colonie sulle piastre, utilizzando un contatore automatico oppure manualmente contando le colonie; è utile contrassegnare le colonie contate con una punta di marcatore.</li>
		<li>Determinare il CFU per intestino pesce moltiplicando il conteggio di piatto per il fattore di diluizione della sospensione, tenendo conto del volume che è stato placcato.</li>
	</ol></li>
</ol>2. misurazione del pesce diarrea
Nota: Quattro diverse metriche sono stati usati per valutare la diarrea di pesce: i livelli di mucina in acqua, i livelli di proteina escreti complessiva nell'acqua, il OD600 dell'acqua e il V. cholerae CFU nell' acqua13. Diarrea, normalmente diventa visivamente evidente circa 6 h dopo l'esposizione di zebrafish di V. cholerae come descritto sopra.
<ol><li>
Determinare i livelli di mucina Nota: Secrezione della mucina è indotta durante la colonizzazione di V. cholerae ed è una buona misura di livelli di escrezione, soprattutto nelle prime fasi di infezione13. Il dosaggio di mucina è una variazione sulla micropiastra dell'acido periodico Schiff dosaggio19.<ol>
<li>Preparare i seguenti materiali: 50% (p/v) soluzione di riserva di acido periodico e 0,1% soluzione di acido periodico lavoro (10 µ l di 50% acido periodico stock aggiunto a 5 mL di acido acetico 7% — utilizzare immediatamente dopo aver effettuato), standard di mucina, piastre microtiter a 96 pozzetti, Schiff reagente.<ol>
<li>Preparare gli standard della mucina sospendendo i seguenti importi di mucina (da un tipo di stomaco suino III) in un tampone di acetato di sodio (100 mM sodio acetato, 5mM di EDTA, pH 5,5 con acido acetico glaciale): 400 µ g/mL, 300 µ g/mL, 200 µ g/mL, 150 µ g/mL , 100 µ g/mL, 75 µ g/mL, 50 µ g/mL, 25 µ g/mL e 10 µ g/mL. Preparare il piatto aggiungendo 100 µ l di infezione acqua in ogni pozzetto che verrà utilizzato nel test come segue: blank 1X PBS; norme di mucina come descritto sopra, o un campione di acqua dall'infezione del pesce. Fare ogni campione in triplice copia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Aggiungere 50 µ l di soluzione di acido periodico 0,1% fresca di ogni bene con una pipetta multicanale e mescolare pipettando su e giù più volte.</li>
		<li>Avvolgere la piastra in involucro di plastica e incubare a 37 ° C per 1 – 1,5 h.</li>
		<li>Raffreddare la piastra a temperatura ambiente per 5 – 10 min. aggiungere 100 µ l di soluzione di fucsina (Schiff di reagente) in ciascun pozzetto e dispensare su e giù per mescolarlo.</li>
		<li>Avvolgere la piastra in involucro di plastica e incubare a temperatura ambiente su una piattaforma a dondolo fino a quando ha sviluppato il colore; il colore è generalmente sviluppato entro 20 min. leggere l'assorbanza a 560 nm utilizzando un lettore di piastra.</li>
		<li>Tracciare una curva standard di mucina (OD560vs µ g/mL della mucina standard). Determinare i livelli di mucina delle incognite identificando dove il OD560 di ogni sconosciuto cade sulla curva standard e leggere la concentrazione di mucina corrispondente per quel valore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinare i livelli di proteina Nota: A parte la mucina, livelli complessivi di proteine in acqua sono un altro proxy per i livelli di diarrea (feci nuvoloso, liquido) prodotto dal pesce. Questa procedura utilizza un'analisi di Bradford standard per stimare i livelli della proteina. I livelli della proteina sono stimati in base a una curva standard di albumina di siero bovino (BSA).<ol>
<li>Mescolare 100 µ l di uno degli standard BSA (Vedi nota sotto) o 100 µ l di infezione (acqua dal becher contenente il pesce infetto) con 900 µ l di Bradford reagente test (il reagente di analisi della proteina di Pierce funziona bene per questo) in una cuvetta monouso. Incubare tutti i campioni a temperatura ambiente per 2 min. Nota: I seguenti standard di BSA sono stati utilizzati: 1.800 µ g/mL, 1.000 µ g/mL, 750 µ g/mL, 500 µ g/mL, 250 µ g/mL, 125 µ g/mL, 50 µ g/mL e 25 µ g/mL. Gli standard di BSA sono stati diluiti in acqua distillata in autoclave.</li>
		<li>Leggere il OD660 di ogni standard o campione loro usando uno spettrofotometro.</li>
		<li>Tracciare la curva standard di BSA (OD660vs µ g/mL). Determinare i livelli di proteina delle incognite identificando dove il OD660 di ogni sconosciuto cade sulla curva standard BSA e leggere la concentrazione di mucina corrispondente per quel valore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Misura OD600 Nota: La presenza di diarrea (feci nuvoloso, liquido) è visibilmente evidente dopo diverse ore e una determinazione di600 OD semplice può essere utilizzati per quantificare questo.<ol>
<li>Capovolgere la provetta contenente l'acqua di infezione più volte per distribuire uniformemente il contenuto. Aggiungere 1 mL di campione per una cuvetta monouso. Usare 1 mL di acqua sterile infezione come controllo negativo.</li>
		<li>Eseguire una misurazione "in bianco" con lo spettrofotometro a 600 nm usando il campione di controllo negativo. Leggere ogni campione d'acqua a 600 nm e inserire i risultati.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Determinazione di secreti V. cholerae CFU/mL dopo una infezione Nota: Una componente importante della diarrea prodotto da zebrafish è escreto V. cholerae. La determinazione della CFU/mL può essere utilizzata per scopi quali stimare la replicazione batterica nel tratto intestinale di pesce e come misura di una dose infettiva negli esperimenti di trasmissione. Questa misura è meglio farlo quando un'infezione transitoria ha avuto luogo. Se viene utilizzato un infezione di 24 h, quindi questo test misurerà l'inoculo combinato più l' escreti V. cholerae.<ol>
<li>Prelevare un campione di acqua presso il punto di tempo desiderato e diluirlo in serie come descritto in precedenza.</li>
		<li>Piastra le diluizioni seriali su terreni selettivi (agar LB contenente streptomicina o un altro antibiotico appropriato o raccolte connessioni dati) e li Incubare a 30 ° C per 24 h.</li>
		<li>Contare le colonie. Calcolare il CFU per mL di acqua come descritto al punto 1.5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Zebrafish è un relativamente nuovo modello per lo studio di V. cholerae ma molto promettente per la scoperta di futura aspetti inediti di V. cholerae biologia e patogenesi11,12,13 . Il modello di zebrafish adulto ha i vantaggi di essere sia un naturale V. cholerae host che contiene il microbiota intestinale intatto, maturo e un modello dell'ambiente. Svantaggi del modello sono che i due fattori di vir...

Vibrio cholerae è un batterio gram-negativo, acquatico che causa il colera malattia umana così come diarrea sporadica1,2. V. cholerae è trovato nell'ambiente in molte aree del globo, spesso associato con altri organismi acquatici. Questi organismi associazione includono plancton, ovature di insetti, crostacei e pesci vertebrati specie3,4,5,6,7. Parecchi studi hanno isolato V. cholerae da tratti intestinali di pesce in diverse aree geografiche7,8,9,10. La presenza di V. cholerae in pesce indica che il pesce può agire come un serbatoio ambientale. Pesce potrebbe essere implicato anche nella trasmissione della malattia agli esseri umani e nella diffusione geografica di V. cholerae ceppi6.
Per comprendere meglio come V. cholerae interagisce con pesce, Danio rerio, meglio conosciuto come pesce zebra, è stato sviluppato come sistema modello per lo studio di V. colerae11. Zebrafish sono nativi di Asia del sud, compresa la regione del Golfo del Bengala, che è pensata per essere il primo serbatoio di V. cholerae. Prima del primo inizio pandemia colera nel 1817, il colera non era stato segnalato di fuori di quello che oggi è India e Bangladesh. Di conseguenza, zebrafish e V. cholerae quasi certamente associati con a vicenda su scale di tempo evolutivo, suggerendo che zebrafish sono un host V. cholerae nell' ambiente naturale12.
Il modello di zebrafish per V. cholerae è semplice da eseguire e può essere usato per studiare l'intero patogeno V. cholerae ciclo di vita. Pesci sono esposti a V. cholerae di bagnarsi in acqua che è stato inoculato con un numero noto di V. cholerae. Entro poche ore, si svolge colonizzazione intestinale, seguita dalla produzione di diarrea. Diarrea è costituito da mucina, proteine, batteri escreti e altri contenuti intestinali. Il grado di diarrea può essere quantificato utilizzando pochi semplici misurazioni13. V. cholerae che è stata escreta dai pesci infettati può quindi andare per infettare pesce ingenuo, completando il ciclo infettivo. Di conseguenza, il modello di zebrafish ricapitola le V. cholerae malattia umana processo12,14.
Il più delle volte usato V. cholerae modelli animali sono stati storicamente topi e conigli14,15,16,17,18. Questi modelli sono stati strumentali in aggiunta alla nostra conoscenza della patogenesi di V. cholerae . Tuttavia, poiché topi e conigli non sono naturali V. cholerae padroni di casa, ci sono limitazioni a quali aspetti del ciclo di vita di V. cholerae possono essere studiati. La colonizzazione di V. cholerae di topi e conigli richiede in genere l'assenza di microbiota intestinale o un pretrattamento con gli antibiotici per danneggiare il microbiota intestinale. Entrambi i modelli richiedono o sonda gastrica per introdurre i batteri al tratto digestivo o manipolazione chirurgica per iniettare direttamente i batteri nell'intestino. Zebrafish hanno un vantaggio in quanto pesce adulto con un microbiota intestinale intatto sono prontamente colonizzati e il processo infettivo avviene naturalmente, senza alcuna manipolazione necessaria.
Il lavoro attuale dimostra l'utilizzo di zebrafish come un modello di infezione da V. cholerae . L'infezione, la dissezione, enumerazione di colonizzare V. choleraee la quantificazione di diarrea causata da V. cholerae sarà descritto12,13. Questo modello rischia di essere utile agli scienziati interessati sia nel processo di malattia V. cholerae e il lifestyle di V. cholerae ambientale.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Instrument&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific, Edison, NJ</td><td>Excella E25</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>NUAIRE, Plymouth, MN</td><td>Auto Flow</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>Geaesys 6</td><td></td></tr><tr><td>Vortex homogenizer</td><td>Minibeadbeater24</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Machine</td><td>Ohaus, Columbia, MD</td><td>Adventurer Pro</td><td></td></tr><tr><td>Heat Stirer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Burner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated colony counter</td><td>REVSCI</td><td>120417B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>400 ml glass beakers</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perforated lids</td><td>Microtip holder with holes from tip box</td><td></td><td></td></tr><tr><td>disposable plastic spoons</td><td>Office Depot, Boca Raton, FL</td><td>D15-25-7008</td><td></td></tr><tr><td>Fish Tank System</td><td>Aquaneering, San Diego, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RO Water Purifier</td><td>Aqua FX</td><td>TK001</td><td></td></tr><tr><td>Fish net</td><td>Marina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fish food</td><td>Tetra fin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brine Shrimp</td><td>Red jungle brand</td><td>O.S.I. pro 80</td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpels</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>10000-10</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>15000-11</td><td></td></tr><tr><td>2 ml screw cap tubes</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>02-681-375</td><td></td></tr><tr><td>1 mm glass beads</td><td>Bio Spec</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads for spreading</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>18406-500G</td><td></td></tr><tr><td>Petri plate</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml centrifuge tube</td><td>Midsci, Valley Park, MO</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tube</td><td>Corning Falcon, Corning, NY</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Test tubes</td><td>Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pipette</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>13675K</td><td></td></tr><tr><td>Micro pipettes</td><td>Sartorius Biohit, G&amp;ouml;ttingen, Germany</td><td>m1000/m200/m20</td><td></td></tr><tr><td>Tips</td><td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td><td>24-150RS/24-412</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>VWR Life Science, Radnor, PA</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>10651745001</td><td></td></tr><tr><td>Schiff&amp;rsquo;s reagent</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>84655-250 mL</td><td></td></tr><tr><td>periodic acid</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>10450-60-9</td><td></td></tr><tr><td>Mucin from porcine stomach</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>M2378-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>9046-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660nm Protein Assay Reagent</td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LB medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Teast Extract</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NACL</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>TCBS Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>265020</td><td></td></tr><tr><td>DCLS Agar</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>70135-500gm</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft office</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying vibrio cholerae colonization and diarrhea in the adult zebrafish model

Vibrio cholerae è meglio conosciuto come l'agente infettivo che causa il colera malattia umana. All'esterno l'ospite umano, V. cholerae esiste principalmente per l'ambiente acquatico, dove interagisce con una varietà di specie acquatiche superiori. Pesci vertebrati sono noti per essere un host ambientale e sono un potenziale serbatoio di V. cholerae in natura. V. cholerae e le specie di pesci teleostei Danio rerio, comunemente note come zebrafish, hanno origine dal subcontinente indiano, suggerendo una lunga interazione in ambienti acquatici. Zebrafish sono un organismo modello ideale per studiare molti aspetti della biologia, tra cui le malattie infettive. Zebrafish può essere facilmente e rapidamente colonizzato da V. cholerae dopo l'esposizione in acqua. Colonizzazione intestinale da V. cholerae conduce alla produzione di diarrea e l'escrezione di replicata V. cholerae. Questi escreti batteri possono quindi andare a colonizzare nuovi host di pesce. Qui, dimostriamo come valutare V. cholerae-colonizzazione intestinale in zebrafish e come quantificare V. cholerae-indotto diarrea di zebrafish. Il modello di colonizzazione dovrebbe essere utile per i ricercatori che stanno studiando se geni di interesse possono essere importanti per la colonizzazione di host e/o per la sopravvivenza dell'ambiente. La quantificazione di zebrafish diarrea dovrebbe essere utile ai ricercatori di studiare qualsiasi agente patogeno intestinale che sono interessati ad esplorare zebrafish come sistema modello.

V. cholerae colonizzazione dei tratti intestinali zebrafish
Per fornire un esempio dei livelli tipici colonizzazione che osserviamo, abbiamo inoculato 5 x 106 CFU di EL Tor V. cholerae ceppo pandemico N16961 in 200 mL di acqua in un becher contenente diversi zebrafish. Dopo 6 h di infezione, il pesce sono stato lavato in acqua dolce e trasferito in un becher di 200 mL di acqua in autoclave infezione com...

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Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish sono un naturale Vibrio cholerae host e può essere utilizzato per riassumere e studiare l'intero ciclo infettivo dalla colonizzazione alla trasmissione. Qui, dimostriamo come valutare i livelli di colonizzazione di V. cholerae e quantificare la diarrea in zebrafish.

Quantificare la colonizzazione di Vibrio cholerae e diarrea nel modello Zebrafish adulto

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

quantifying-vibrio-cholerae-colonization-diarrhea-adult-zebrafish

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

8.3K Views.  Wayne State University School of Medicine. Zebrafish sono un naturale Vibrio cholerae host e può essere utilizzato per riassumere e studiare l'intero ciclo infettivo dalla colonizzazione alla trasmissione. Qui, dimostriamo come valutare i livelli di colonizzazione di V. cholerae e quantificare la diarrea in zebrafish.

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Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

Modellazione mucosa Candidosi in Zebrafish larvale da vescica natatoria Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Decifrare e Imaging Patogenesi e Cording di<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafish embrioni

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

Sviluppo di un modello di infezione del pesce zebra Larval per Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Biologia dello sviluppo

Ottimizzazione dei modelli GF Zebrafish: generazione, manutenzione e studi microbici

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

Autore in primo piano: Definizione di pesce zebra privo di germi per studi sulla relazione microbiota-ospite

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modellazione di tubercolosi in Zebrafish adulto infettato di Mycobacterium marinum

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water environment. Developing effective methods for oral delivery of immunostimulants or vaccines, which activate the immune system against infectious diseases, is highly desirable. In devising prophylactic tools, good experimental models are needed to test their performance. Here, we show a method for oral intubation of adult zebrafish and a set of procedures to dissect and prepare the intestine for cytometry, confocal microscopy and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis. With this protocol, we can precisely administer volumes up to 50 &#181;L to fish weighing approximately 1 g simply and quickly, without harming the animals. This method allows us to explore the direct in vivo uptake of fluorescently labelled compounds by the intestinal mucosa and the immunomodulatory capacity of such biologics at the local site after intubation. By combining downstream methods such as flow cytometry, histology, qPCR and confocal microscopy of the intestinal tissue, we can understand how immunostimulants or vaccines are able to cross the intestinal mucosal barriers, pass through the lamina propria, and reach the muscle, exerting an effect on the intestinal mucosal immune system. The model could be used to test candidate oral prophylactics and delivery systems or the local effect of any orally administered bioactive compound.

The protocol describes intubating adult zebrafish with a biologic; then dissecting and preparing the intestine for cytometry, confocal microscopy and qPCR. This method allows administration of bioactive compounds to monitor intestinal uptake and the local immune stimulus evoked. It&#160;is relevant for testing the intestinal dynamics of oral prophylactics.

Intubazione orale di Zebrafish adulto: un modello per valutare l'assorbimento intestinale di sostanze bioattive

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Immunization of Adult Zebrafish for the Preclinical Screening of DNA-based Vaccines

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected antigen or a combination of antigens into a plasmid, which enables a tailor-made and safe design. The administration of DNA vaccines into host cells leads to the expression of antigens that stimulate both humoral and cell-mediated immune responses. This report describes a protocol for the cloning of antigen sequences into the pCMV-EGFP plasmid, the immunization of adult zebrafish with the vaccine candidates by intramuscular microinjection, and the subsequent electroporation to improve intake. The vaccine antigens are expressed as green fluorescent protein (GFP)-fusion proteins, which allows the confirmation of the antigen expression under UV light from live fish and the quantification of expression levels of the fusion protein with ELISA, as well as their detection with a western blot analysis. The protective effect of the vaccine candidates is tested by infecting the fish with Mycobacterium marinum five weeks postvaccination, followed by the quantification of the bacteria with qPCR four weeks later. Compared to mammalian preclinical screening models, this method provides a cost-effective method for the preliminary screening of novel DNA-based vaccine candidates against a mycobacterial infection. The method can be further applied to screening DNA-based vaccines against various bacterial and viral diseases.

Here we describe a protocol for the immunization of the adult zebrafish (Danio rerio) with a DNA-based vaccine and demonstrate the validation of a successful vaccination event. This method is suitable for the preclinical screening of vaccine candidates in various infection models.

Immunizzazione di Zebrafish adulto per lo Screening preclinico di vaccini basati sul DNA

The interest in DNA-based vaccination has increased during the past two decades. DNA vaccination is based on the cloning of a sequence of a selected ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Quantificare la colonizzazione di Vibrio cholerae e diarrea nel modello Zebrafish adulto

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Modellazione mucosa Candidosi in Zebrafish larvale da vescica natatoria Injection

Decifrare e Imaging Patogenesi e Cording di

Sviluppo di un modello di infezione del pesce zebra Larval per Clostridioides difficile

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Modellazione di tubercolosi in Zebrafish adulto infettato di Mycobacterium marinum

Intubazione orale di Zebrafish adulto: un modello per valutare l'assorbimento intestinale di sostanze bioattive

Immunizzazione di Zebrafish adulto per lo Screening preclinico di vaccini basati sul DNA

Utilizzando il protozoo Paramecium caudatum come veicolo di infezioni di origine alimentare nelle larve di Zebrafish