GVdB, via the University of Leuven (KU Leuven), receives long-term structural research support from the Methusalem Program funded by the Flemish Government (METH08/07) and holds a European Research Council Advanced Grant AdvG-2012-321670 from the Ideas Program of the European Union seventh framework program. SET received a Research Foundation-Flanders (FWO) Research Assistant Fellowship.

Il protocollo è stato approvato dalla University of Leuven Ethical Review Board per la ricerca sugli animali. 1. Preparazione della linea venosa <ol><li> Preparare la punta del catetere venoso immergendo rapidamente la parte centrale di 60 cm microrenathane (MRE) tubi in caldo olio di sesamo (&gt; 220 ° C). Successivamente allungare la parte centrale del tubo per produrre un diametro ristretto (diametro esterno (OD) &lt;0,5 mm) delicatamente spostando le estremità del tubo distanti. </li><li> Utilizzare una lama di bisturi per tagliare il tubo in due parti di 30 cm ciascuno (vedere Figura 1, Tabella 1). </li><li> Collegare il tubo MRE al polietilene tubo PE10 usando connettore polietilene PE50 e collegare questi tubi PE10 alla parte inferiore dello snodo. Collegare la parte superiore della parte girevole per tubi PE10, e collegarlo ad una stub ago Luer con PE50 tubo connettore di cui alla figura 1. </li><li> Applicare forte fast-acting colla adesiva a tutte le connessioni e testare il catetere per perdite mediante lavaggio con aria. Gas sterilizzare il catetere prima dell&#39;uso. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55553/55553fig1.jpg" /> Figura 1: La costruzione della linea venosa. Linee venose sono preparati stirando il tubo MRE ad un piccolo diametro e collegandolo tramite tubo di polietilene ad un dispositivo roditore girevole. Vedere la Tabella 1 per le istruzioni su lunghezze delle varie parti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55553/55553fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Leggenda </td><td> Lunghezza </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 1) Luer stub ago 22sol </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2) PE50 - polietilene 0,023&quot; x 0,038&quot; </td><td> 5 cm </td><td> 13 microlitri </td></tr><tr><td> 3) PE10 - polietilene .011&quot; x .024” </td><td> 50 cm </td><td> 30 microlitri </td></tr><tr><td> 4) roditore girevole 20 G </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5) PE-10 </td><td> 15 cm </td><td> 9 ml </td></tr><tr><td> 6) PE-50 (connettore) </td><td> 5 cm </td><td> 13 microlitri </td></tr><tr><td> 7) MRE025 Tip allungato microrenathane .025&quot; x .012&quot; </td><td> 30 cm </td><td> 27 microlitri </td></tr><tr><td> Somma totale </td><td> 105 cm </td><td> 92 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Costruzione di venoso linea. Questa tabella fornisce una legenda per la Figura 1. 2. Anestesia e Manipolazione di pre-intervento chirurgico <ol><li> Utilizzare 24 settimane vecchio maschio C57BL 6J / (27-32 g). NOTA: Usiamo 24 settimane di età topi (in età matura) come questa età corrisponde meglio con l&#39;età media dei pazienti in terapia intensiva. Usiamo solo topi maschi per evitare l&#39;influenza ciclica di estrogeni. La tecnica può essere utilizzata anche su animali giovani (testato a 16 settimane di età topi) e le femmine, se si preferisce. </li><li> Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima dell&#39;uso. Lavare il catetere venoso sterile fatta in casa con soluzione salina per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria e per verificare la pervietà e perdite potenziali. </li><li> Tagliare un filo metallico (diametro 0,8 mm) di 80 cm di lunghezza, raddoppiare piegando e fare un ciclo. Piombo 3 perle sopra il filo raddoppiato al loop. Collegare il catetere al filo metallico guidando la punta del catetere attraverso le 3 perle. NOTA: Il filo metallico di fissaggio è necessaria per la rotazione della parte girevole al quale è collegato il catetere. Come tale, il mouse può muoversi liberamente, senza bloccare la linea venosa. </li><li> Anestetizzare il mouse da un intraperitoneale (IP) iniezione di una miscela di 0,03 ml di ketamina (100 mg / kg) e 0,02 mL xilazina (13 mg / kg). Assicurarsi che l&#39;anestesia sia adeguata verificando l&#39;assenza di riflessi. tirare delicatamente la linguetta mouse all&#39;esterno con una pinza per evitare soffocamento deglutizione della lingua. NOTA: Se dopo 10 minuti, il mouse tenta ancora di ritirare le sue membra danno ketamina supplementare come mL bolus 0,01. </li><li> Radere l&#39;area chirurgica compreso addome, parte ventrale del collo (triangolo tra mento, sterno e clavicola), e tra le scapole alla base della testa). </li><li> Posizionare il mouse in posizione prona su una piastra elettrica pre-riscaldato, disinfettare la pelle con 70% etanolo e applicare una piccola quantità di lubrificante oftalmica per proteggere gli occhi secchi. Infiltrarsi nelle siti chirurgici (addome, collo, anteriore e posteriore) con 0,2 mL ropivacaina (0,67 mg / kg). </li><li> Mentre il mouse è ancora in posizione prona, fare una piccola incisione alla base del lato dorsaledella testa con bisturi o forbici. Esporre i muscoli cervicali posteriori, e legare il muscolo al loop del filo allegato con 3.0 nylon conducendo un filo di nylon 3.0 sotto il muscolo. </li><li> Posizionare il mouse sul lato destro. Fare una piccola incisione verticale nella pelle del collo ventrale con un bisturi o forbici. Sotto guida visiva, tunnel un ago calibro 18 sottocutanea attraverso questa incisione ventrale verso l&#39;incisione sul retro effettuata in precedenza e infilare il catetere attraverso l&#39;ago di esteriorizzare in corrispondenza del lato ventrale. </li><li> Posizionare il mouse sul dorso. Passare un filo di nylon 3.0 dietro ai denti incisivi del mouse e nastro fino al pad riscaldamento. Fissare la testa in una maschera per l&#39;erogazione di ossigeno (2 L / min). Fissare il mouse in una posizione allungata con nastro adesivo lungo la coda e le due arti anteriori. NOTA: se solo l&#39;anestesia ketamina-xilazina non è sufficiente, isoflurano per via inalatoria (0,5-1,5%) possono essere consegnati durante l&#39;intervento chirurgico. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Il posizionamento di un catetere cronica Indwelling <ol><li> Posizionare il mouse sotto il microscopio da dissezione. Nel incisione fatta precedentemente nel collo ventrale, giro delicatamente tessuto grasso e ghiandole via con pinza finché la vena giugulare può essere visualizzato. </li><li> Mezzi termini sezionare per liberare la vena giugulare dal tessuto connettivo sottocutaneo e sopra e attorno al vaso posizionando la punta della pinza tra la vena e il tessuto connettivo e aprendo la pinza ripetutamente in parallelo con la vena. Come tali, i danni alla vena sarà evitata. </li><li> Isolare la vena giugulare mettendo forcipe smussato sotto la vena. Sfamare tre pezzi di filo di seta 3.0 sotto la vena, posizione di un pezzo prossimale alla biforcazione della vena giugulare (legatura cranico) e un pezzo vicino al muscolo sternocleidomastoideo (caudale legatura). Stringere la legatura cranica e la legatura caudale per allungare la vena e prevenire un eccessivo sanguinamento durante l&#39;inserimento del catetere. Tcioè una legatura sciolto con il filo centrale per garantire un facile fissaggio del catetere in seguito. </li><li> Utilizzando forbici micro, fare un&#39;incisione lungo la vena tra le legature craniale e caudale e abbastanza grande per passare il catetere. Afferra il catetere con una pinza, ed inserire il catetere 11 mm nella vena. Liberamente fissare il catetere legando fuori la legatura centrale e confermare il corretto posizionamento da vampate di calore delicatamente con soluzione salina sterile. </li><li> Fissare il catetere con fermezza legando fuori la legatura centrale e caudale intorno alla nave e catetere. Tie finisce di legatura caudale e medio insieme per fissare saldamente il catetere. Assicurarsi che i nodi non occludono la vena, irrigando il catetere dopo ogni nodo fatto. Infine, legare il caudale e legature cranici. Chiudere l&#39;incisione con punti di sutura 5.0 seta. </li></ol> 4. del cieco legatura e puntura <ol><li> Fare un 1-cm incisione mediana attraverso la pelle della metà inferiore dell&#39;addome con bisturi o forbici;fare attenzione a non penetrare nella cavità peritoneale. </li><li> Identificare la linea alba della muscolatura addominale e fare un&#39;incisione intramuscolare per ottenere l&#39;ingresso nella cavità peritoneale. Individuare il cieco, e utilizzare pinze anatomiche smussato per isolare il cieco e esteriorizzare esso. </li><li> Legare il cieco al 50% della sua lunghezza con suture 3.0 seta. Assicurarsi di non legare la valvola ileocecale in modo che la continuità intestinale viene mantenuta. </li><li> Perforare la cieco con un ago calibro 18 da un singolo passante e passante a metà strada tra puntura legatura e la punta del cieco. Dopo aver rimosso l&#39;ago, estrudere una piccola quantità di feci dal foro per assicurare la pervietà. </li><li> Riposizionare l&#39;intestino nella cavità addominale, e chiudere il peritoneo e la pelle con punti di sutura 5.0 seta. NOTA: In media, una nuova tirocinante richiede dai 10 ai 15 animali per essere in grado di collocare agevolmente il catetere venoso ed eseguire CLP all&#39;interno di 45 min. Dopo il periodo di formazione, un&#39;anestesia / chirurgia related mortalità del 10% può essere previsto. </li></ol> Il trattamento 5. post-chirurgica e Rianimazione Fluid <ol><li> Posizionare il mouse in posizione supina e fissare il catetere al filo allegato con nastro. Muovi il mouse per una gabbia individuale. Utilizzare un supporto con morsetto regolabile per tenere il dispositivo girevole 25 cm sopra il mouse e il nastro saldamente la parte libera del filo metallico attaccamento al punto di rotazione della parte girevole. </li><li> Attaccare una siringa contenente la miscela di colloidi e cristalloidi bilanciati (1: 4) alla linea venosa per iniziare rianimazione fluido. </li><li> Posizionare la gabbia in temperatura controllata (27 ° C) mobile animale con 12 ore di luce e cicli scuri e iniziare rianimazione fluido endovenoso (10 mL / kg / h) mediante una pompa di infusione accurata siringa-driven. Fornire arricchimento gabbia, come materiale di nidificazione e un blocco di legno. </li></ol> 6. Terapia Intensiva <ol><li> A 6 ore dopo l&#39;operazione, per via sottocutanea iniettare dolore medication e antibiotici (0,3 mL buprenorfina (0,15 mg / kg) e 0,2 mL di imipenem (16.67mg / kg)). NOTA: Dopo pratica di medicina degli animali da laboratorio standard, la prima dose di antidolorifici è data prima della incisione chirurgica iniziale e poi come indicato dalle politiche veterinari dell&#39;istituzione. iniezioni sottocutanee devono essere attentamente iniettati nello spazio sottocutaneo. </li><li> Dopo 20 - 24 h di rianimazione fluido, sostituire i cristalloidi / colloidi di nutrizione parenterale totale (6,67 mL / kg / h). NOTA: La nutrizione parenterale totale amministrato (5,8 kcal / 24 h) copre circa il 40% del fabbisogno calorico giornaliero di topi, simili ai primi apporto calorico dei pazienti nel reparto di terapia intensiva. </li><li> Sottocutanea somministrare farmaci antidolorifici e antibiotici (0,6 mL buprenorfina (0,3 mg / kg) e 0,2 mL di imipenem (16,67 mg / kg) ogni 12 ore durante l&#39;intero periodo di malattia critica. </li><li> Controllare gli animali almeno ogni 3 ore durante il giorno. Valutare la sofferenza dando un dolorepunteggio basato sul mouse scala smorfia convalidato 11. Intensificare il monitoraggio per gli animali con un punteggio elevato dolore. </li></ol> 7. fine dell&#39;esperimento NOTA: Approvazione e raccomandazioni sul livello di gravità del modello e le linee guida e le politiche per gli endpoint umani dovrebbe essere cercato dal Institutional Review Board etico locale per la ricerca sugli animali. NOTA: In caso di una linea venosa non funzionali come catetere bloccato, delocalizzazione del catetere, problemi con la pompa a siringa, l&#39;animale è escluso dallo studio e sacrificati. <ol><li> Al termine del periodo sperimentale, profondamente anestetizzare il mouse usando una miscela di 0,03 ml di ketamina (100 mg / kg) e 0,02 ml (13 mg / kg) xilazina. Eutanasia il mouse ritirando sangue mediante puntura cardiaca. Conservare scatto campioni di tessuto congelati di interessi a -80 ° C. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecal+ligation+and+puncture+with+total+parenteral+nutrition:+a+clinically+relevant+model+of+the+metabolic,+hormonal,+and+inflammatory+dysfunction+associated+with+critical+illness.">Cecal ligation and puncture with total parenteral nutrition: a clinically relevant model of the metabolic, hormonal, and inflammatory dysfunction associated with critical illness.</a> J Surg Res. 121 (2), 178-186 (2004).</li><li>Conti, M., Merlani, P., Ricou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognosis+and+quality+of+life+of+elderly+patients+after+intensive+care.">Prognosis and quality of life of elderly patients after intensive care.</a> Swiss Med Wkly. 142, (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Abbiamo sviluppato un modello murino più clinicamente rilevante di malattia critica, combinando il metodo di legatura e puntura cecale indurre sepsi con l&#39;uso di un catetere venoso centrale per fluidi, farmaci e amministrazione nutrienti. Questo apparato sperimentale è riproducibile, permette di studiare la prolungata fase di malattia critica e si traduce in un tasso di mortalità stabile, con la presente imitando la situazione clinica umana 1. Legatura cecale e...

malattia critica è uno stato di malattia in cui la funzione di uno o più sistemi di organi è ostacolato nella misura in cui il paziente muore, a meno che il supporto mediche intensive viene somministrato. Considerando che la causa iniziale per l&#39;ammissione al reparto di terapia intensiva (ICU) può variare, che vanno da traumi, interventi chirurgici complicati, le ustioni, le riacutizzazioni della malattia a sepsi, tutti i pazienti critici soffrono di danni cellulari, causati da ipoperfusione, ipossia e l&#39;infiammazione eccessiva tra gli altri , che porta a insufficienza d&#39;organo. La maggior parte dei pazienti sopravvivono loro insulto acuto, ma una frazione importante dei pazienti non immediatamente recuperare e hanno bisogno di una prolungata terapia intensiva. Essi sono ad alto rischio di morte a causa di non risolvere insufficienza multiorgano. Inoltre, la fase di prolungata malattia critica si caratterizza per una profonda debolezza muscolare e endocrino e cambiamento metabolico, la cui patogenesi è attualmente completamente compresa. Diversi rmodelli Odent vengono utilizzati in ambito di ricerca di terapia intensiva. I due modelli più utilizzati sono la somministrazione esogena di lipopolisaccaride (LPS) e legatura cecale e puntura (CLP). Entrambi i modelli sono sviluppati per simulare la fase acuta della sepsi, definita come una disfunzione organo pericolo di vita causato da una risposta dell&#39;ospite dysregulated alle infezioni, e uno dei principali motivi per l&#39;ammissione al ICU universalmente 1, 2. Il modello LPS ha diversi svantaggi, poiché colpisce solo transitoriamente il rilascio di citochine e lo stato emodinamico dell&#39;animale 3. Differenza di esseri umani, roditori sono anche particolarmente resistenti alle endotossine e l&#39;utilizzo di &#39;alte dosi&#39; di endotossina è necessario produrre ipotensione e mortalità, con ciò aumentando ulteriormente preoccupazioni della validità di questo metodo 4, 5. L&#39;altro modello, la legatura del cieco e il modello di puntura (CLP)presenta una legatura di una porzione del cieco seguita da una foratura ago attraverso-e-through. Questa procedura causa un&#39;infezione addominale polimicrobica con danno tissutale, seguita da una traslocazione dei batteri nel comparto sangue. Ciò attiverà una risposta infiammatoria sistemica e lo sviluppo della sepsi. Il modello CLP è stato ampiamente riconosciuto come un modello animale di malattia critica acuta che riproduce le caratteristiche principali di sepsi: hyperinflammation, vasodilatazione, ipotensione e aumento della gittata cardiaca 6, 7. Tuttavia, questo modello non permette lo studio del fallimento non risolvere multipla d&#39;organo, atrofia muscolare, ed endocrino e cambiamenti metabolici, che sono tipici per la prolungata fase di malattia critica. Inoltre, di recente la validità dei modelli murini per malattie gravi sono stata messa in discussione, dal momento che i risultati di modelli murini non possono sempre essere tradotti a impostare l&#39;umano 8, 9, 10. Una possibile spiegazione potrebbe essere che la terapia di supporto che viene fornito a pazienti critici umani differisce sostanzialmente dalla cura che viene fornito a topi critici. Pertanto, per assomigliare l&#39;impostazione umana più vicino e permettere indagine della fase prolungata di malattia critica, abbiamo sviluppato un modello di topo che imita la rianimazione acuta come dato agli esseri umani, come vasta somministrazione di fluidi per via endovenosa e trattamento antibiotico, e che permette per amministrare terapia di supporto, al fine di sopravvivere, la prolungata fase di malattia critica, come il supporto nutrizionale. A questo scopo, abbiamo adattato il modello murino di sepsi CLP-indotta, essendo lo standard d&#39;oro per sepsi, e collocato una linea venosa centrale che permette la somministrazione di fluidi, nutrizione e droghe.

<table><tbody><tr><td>Buprenorphine</td><td>Ecuphar</td><td></td><td>Vetergesic 0.3 mg/mL</td></tr><tr><td>C57BL/6&amp;nbsp;</td><td>Janvier labs</td><td>C57BL/6JRj</td><td></td></tr><tr><td>colloids</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>Volulyte 6%</td></tr><tr><td>crystalloids</td><td>Baxter</td><td></td><td>Plasmalyte a viaflo</td></tr><tr><td>Ethilon 3.0</td><td>Ethicon</td><td>F3211</td><td></td></tr><tr><td>Imipenem</td><td>MSD</td><td></td><td>Tienam 500&amp;nbsp;mg powder for injection fluid</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Eurovet</td><td></td><td>Iso-vet</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Eurovet</td><td></td><td>Nimatek 100 mg/mL</td></tr><tr><td>LocTite Super glue3 all plastics&amp;nbsp;</td><td>Rectavit</td><td>119818</td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 3.0</td><td>Ethicon</td><td>L192</td><td></td></tr><tr><td>Mersilk 5.0</td><td>Ethicon</td><td>F682</td><td></td></tr><tr><td>Microrenathane .025&quot; O.D. x .012&quot; I.D.</td><td>Bioseb</td><td>MRE-025</td><td></td></tr><tr><td>olimel N7E</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE10 - Polyethylene .011&quot; x .024&quot;&amp;nbsp;</td><td>Instech Solomon</td><td>BTPE-10</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 tubing .023&quot; x.038&quot;</td><td>Instech Solomon</td><td>BTPE-50</td><td></td></tr><tr><td>Rodent Swivel 20 G</td><td>Bioseb</td><td>RS-20G&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ropivaca&amp;iuml;ne</td><td>Astrazenica</td><td></td><td>Naropin 2&amp;nbsp;mg/mL</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>VMD</td><td></td><td>Xylazine hydrochloride 2%</td></tr></tbody></table>

use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration in a mouse model of critical illness

Questo protocollo descrive un modello di topo cateterizzato centrale di malattia critica prolungata. Uniamo legatura cecale e metodo puntura per indurre sepsi con l&#39;uso di un catetere venoso centrale per fluidi, farmaci e somministrazione di nutrienti per imitare l&#39;impostazione clinica umana. I pazienti critici richiedono il supporto medica intensiva per poter sopravvivere. Mentre la maggior parte dei pazienti si riprenderà in pochi giorni, circa un quarto dei pazienti ha bisogno di una prolungata terapia intensiva e sono ad alto rischio di morire di non risolvere insufficienza multiorgano. Inoltre, la fase di prolungata malattia critica si caratterizza per una profonda debolezza muscolare, ed endocrino e cambiamenti metabolici, la cui patogenesi è attualmente completamente compresa. Il modello animale più ampiamente utilizzati nella ricerca di terapia intensiva è la legatura e la puntura modello cecal per indurre la sepsi. Questo è un modello molto riproducibile, con alterazioni infiammatorie ed emodinamici acuti simili alla SEP umanasis, che è stato progettato per studiare la fase acuta della malattia critica. Tuttavia, questo modello si caratterizza per una elevata letalità, che è diversa dalla situazione clinica umana, e non è sviluppato per studiare la prolungata fase di malattia critica. Pertanto, abbiamo adattato la tecnica posizionando un catetere venoso centrale nella vena giugulare che ci permette di amministrare clinicamente rilevante terapia di supporto, per simulare meglio la situazione clinica umana della malattia critica. Questo modello di topo richiede un ampio intervento chirurgico e terapia intensiva quotidiana degli animali, ma si traduce in un modello rilevante della fase acuta e prolungata della malattia critica.

Topi C57BL / 6 sono state fatte in condizioni critiche come descritto sopra. Abbiamo eseguito due esperimenti per valutare la sopravvivenza post-CLP fino a due punti di tempo: la sopravvivenza fino al giorno 5 (n = 15) e la sopravvivenza fino al giorno 7 (n = 22) post-CLP. curve di sopravvivenza dei due esperimenti non erano significativamente differenti (rispetto fino al giorno 5), che indica la riproducibilità del setup sperimentale. gli animali non sopravvissuti sono stati trovati mo...

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Use of a Central Venous Line for Fluids, Drugs and Nutrient Administration in a Mouse Model of Critical Illness

This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce sepsis with the use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration to mimic the human clinical setting.

L&#39;uso di un venoso Central Line per fluidi, farmaci e nutrienti Administration in un modello murino di malattia critica

This protocol describes a centrally catheterized mouse model of prolonged critical illness. We combine the cecal ligation and puncture method to induce ...

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Video: Use of a Central Venous Line for Fluids, Drugs and Nutrient Administration in a Mouse Model of Critical Illness

Hyperinsulinemic-euglycemic Clamps in Conscious, Unrestrained Mice

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold standard" method for assessing insulin action in vivo. During an insulin clamp, hyperinsulinemia is achieved by a constant insulin infusion. Euglycemia is maintained via a concomitant glucose infusion at a variable rate. This variable glucose infusion rate (GIR) is determined by measuring blood glucose at brief intervals throughout the experiment and adjusting the GIR accordingly. The GIR is indicative of whole-body insulin action, as mice with enhanced insulin action require a greater GIR. The insulin clamp can incorporate administration of isotopic 2[14C]deoxyglucose to assess tissue-specific glucose uptake and [3-3H]glucose to assess the ability of insulin to suppress the rate of endogenous glucose appearance (endoRa), a marker of hepatic glucose production, and to stimulate the rate of whole-body glucose disappearance (Rd).
The miniaturization of the insulin clamp for use in genetic mouse models of metabolic disease has led to significant advances in diabetes research. Methods for performing insulin clamps vary between laboratories. It is important to note that the manner in which an insulin clamp is performed can significantly affect the results obtained. We have published a comprehensive assessment of different approaches to performing insulin clamps in conscious mice1 as well as an evaluation of the metabolic response of four commonly used inbred mouse strains using various clamp techniques2. Here we present a protocol for performing insulin clamps on conscious, unrestrained mice developed by the Vanderbilt Mouse Metabolic Phenotyping Center (MMPC; URL: www.mc.vanderbilt.edu/mmpc). This includes a description of the method for implanting catheters used during the insulin clamp. The protocol employed by the Vanderbilt MMPC utilizes a unique two-catheter system3. One catheter is inserted into the jugular vein for infusions. A second catheter is inserted into the carotid artery, which allows for blood sampling without the need to restrain or handle the mouse. This technique provides a significant advantage to the most common method for obtaining blood samples during insulin clamps which is to sample from the severed tip of the tail. Unlike this latter method, sampling from an arterial catheter is not stressful to the mouse1. We also describe methods for using isotopic tracer infusions to assess tissue-specific insulin action. We also provide guidelines for the appropriate presentation of results obtained from insulin clamps.

The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is the gold standard for assessing insulin action in vivo. A method for performing insulin clamps in mice is described. This includes a method for arterial catheterization that permits experiments to be performed in conscious, unrestrained mice with minimal stress.

Iperinsulinemico-euglicemico Morsetti in Cosciente, Mouse sfrenato

Type 2 diabetes is characterized by a defect in insulin action. The hyperinsulinemic-euglycemic clamp, or insulin clamp, is widely considered the "gold ...

Ricerca

Medicina

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Metodi per l&#39;auto-somministrazione per via endovenosa in un modello murino

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Neuroscienze

Catheterization of the Carotid Artery and Jugular Vein to Perform Hemodynamic Measures, Infusions and Blood Sampling in a Conscious Rat Model

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. Intra-tracheal inoculation of a known amount of bacteria has been successfully used to reproduce the pathogenesis of pneumonia which then develops into sepsis. Monitoring hemodynamic parameters and providing standard clinical treatment including infusion of antibiotics, fluids and drugs to maintain blood pressure is critical to simulate routine supportive care in this model but to do so requires both arterial and venous vascular access. The video details the surgical technique for implanting carotid artery and common jugular vein catheters in an anesthetized rat. Following a 72 hr recovery period, the animals will be re-anesthetized and connected to a tether and swivel setup attached to the rodent housing which connects the implanted catheters to the hemodynamic monitoring system. This setup allows free movement of the rat during the study while continuously monitoring pressures, infusing fluids and drugs (antibiotics, vasopressors) and performing blood sampling.

Vascular accesses to measure hemodynamics, provide fluids and perform blood sampling are important to any small animal model study. We present a technique for implanting catheters into the carotid artery and the common jugular vein in an anesthetized rat for connecting to a system to perform monitoring, infusions and sampling.

Cateterismo dell&#39;arteria carotide e giugulare Vena di eseguire misure emodinamiche, Infusi e campionamento del sangue in un modello di ratto cosciente

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. ...

Monitoring of Systemic and Hepatic Hemodynamic Parameters in Mice

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. However, due to the small size of the mouse, technical details of the intraoperative monitoring procedure suitable for the mouse were rarely described. Previously we have reported a monitoring procedure to obtain hemodynamic parameters for rats. Now, we adapted the procedure to acquire systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice, a species ten-fold smaller than rats. This film demonstrates the instrumentation of the animals as well as the data acquisition process needed to assess systemic and hepatic hemodynamics in mice. Vital parameters, including body temperature, respiratory&#160;rate&#160;and heart&#160;rate were recorded throughout the whole procedure. Systemic hemodynamic parameters consist of carotid artery pressure (CAP) and central venous pressure (CVP). Hepatic perfusion parameters include portal vein pressure (PVP), portal flow rate as well as the flow rate of the common hepatic artery (table 1). Instrumentation and data acquisition to record the normal values was completed within 1.5 h. Systemic and hepatic hemodynamic parameters remained within normal ranges during this procedure.
This procedure is challenging but feasible. We have already applied this procedure to assess hepatic hemodynamics in normal mice as well as during 70% partial hepatectomy and in liver lobe clamping experiments. Mean PVP after resection (n= 20), was 11.41&#177;2.94 cmH2O which was significantly higher (P&#60;0.05) than before resection (6.87&#177;2.39 cmH2O). The results of liver lobe clamping experiment indicated that this monitoring procedure is sensitive and suitable for detecting small changes in portal pressure and portal flow rate. In conclusion, this procedure is reliable in the hands of an experienced micro-surgeon but should be limited to experiments where mice are absolutely needed.

This film demonstrates how to acquire systemic and hepatic hemodynamics in mice. The whole monitoring includes acquisition of vital parameters, systemic blood pressure, central venous pressure, common hepatic artery flow rate, and portal vein pressure as well as the portal flow rate in mice.

Monitoraggio della sistemici e epatica parametri emodinamici nei topi

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

Stenosi della Vena Cava inferiore: un modello murino di trombosi venosa profonda

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Immunologia e infezioni

Continuous IV Infusion is the Choice Treatment Route for Arginine-vasopressin Receptor Blocker Conivaptan in Mice to Study Stroke-evoked Brain Edema

Stroke is one of the major causes of morbidity and mortality in the world. Stroke is complicated by brain edema and other pathophysiological events. Among the most important players in the development and evolution of stroke-evoked brain edema is the hormone arginine-vasopressin and its receptors, V1a and V2. Recently, the V1a and V2 receptor blocker conivaptan has been attracting attention as a potential drug to reduce brain edema after stroke. However, animal models which involve conivaptan applications in stroke research need to be modified based on feasible routes of administration. Here the outcomes of 48 hr continuous intravenous (IV) are compared with intraperitoneal (IP) conivaptan treatments after experimental stroke in mice. We developed a protocol in which middle cerebral artery occlusion was combined with catheter installation into the jugular vein for IV treatment of conivaptan (0.2 mg) or vehicle. Different cohorts of animals were treated with 0.2 mg bolus of conivaptan or vehicle IP daily. Experimental stroke-evoked brain edema was evaluated in mice after continuous IV and IP treatments. Comparison of the results revealed that the continuous IV administration of conivaptan alleviates post-ischemic brain edema in mice, unlike the IP administration of conivaptan. We conclude that our model can be used for future studies of conivaptan applications in the context of stroke and brain edema.

Our studies have revealed that the beneficial effects of conivaptan are dependent on the method of delivery after experimental stroke in mice. We have developed a research protocol for delivery of the receptor blocker via IV catheter on stroke-evoked brain edema formation in mice.

Continua infusione endovenosa è la Strada del trattamento scelta per arginina-vasopressina bloccante dei recettori conivaptan nei topi per studiare Stroke-evocato Cervello Edema

Stroke is one of the major causes of morbidity and mortality in the world. Stroke is complicated by brain edema and other pathophysiological events. Among ...

Veno-Venous Extracorporeal Membrane Oxygenation in a Mouse

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for acute as well as end-stage lung diseases. With the increase in clinical demand and prolonged use of ECMO, procedural optimization and prevention of multi-organ damage are of critical importance. The aim of this protocol is to present a detailed technique of veno-venous ECMO in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This protocol demonstrates the technical design of the ECMO and surgical steps. This murine ECMO model will facilitate the study of pathophysiology related to ECMO (e.g., inflammation,bleeding and thromboembolic events). Due to the abundance of genetically modified mice, the molecular mechanisms involved in ECMO-related complications can also be dissected.

Here we present a protocol describing the technique of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This murine model of ECMO can be effectively implemented in experimental studies of acute and end-stage lung diseases.

Ossigenazione extracorporea veno-venoso in un Mouse

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for ...

Murine Model of Central Venous Stenosis using Aortocaval Fistula with an Outflow Stenosis

Central venous stenosis is an important entity contributing to arteriovenous fistula (AVF) failure. A murine AVF model was modified to create a partial ligation of the inferior vena cava (IVC) in the outflow of the fistula, mimicking central venous stenosis. Technical aspects of this model are introduced. The aorta and IVC are exposed, following an abdominal incision. The infra-renal aorta and IVC are dissected for proximal clamping, and the distal aorta is exposed for puncture. The IVC at the midpoint between the left renal vein and the aortic bifurcation is carefully dissected to place an 8-0 suture beneath the IVC. After clamping the aorta and IVC, an AVF is created by puncturing the infra-renal aorta through both walls into the IVC with a 25 G needle, followed by ligating a 22 G intra-venous (IV) catheter and IVC together. The catheter is then removed, creating a reproducible venous stenosis without occlusion. The aorta and IVC are unclamped after confirming primary hemostasis. This novel model of central vein stenosis is easy to perform, reproducible, and will facilitate studies on AVF failure.

An aortocaval fistula was created by puncturing the murine infra-renal aorta through both walls into the inferior vena cava and was followed by creation of a stenosis in its outflow via partial ligation of the inferior vena cava. This reproducible model can be used to study central venous stenosis.

Modello Murine della Stenosi Venoso Centrale utilizzando Aortocaval Fistula con una stenosi di flusso

Central venous stenosis is an important entity contributing to arteriovenous fistula (AVF) failure. A murine AVF model was modified to create a partial ...

Drug Treatment by Central Venous Catheter in a Mouse Model of Angiotensin II Induced Abdominal Aortic Aneurysm and Monitoring by 3D Ultrasound

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse models, are applied to advance the understanding of the disease pathogenesis and to identify potential therapeutic targets. Testing novel drug candidates to block AAA growth in these models generally requires repeated drug administration during the time course of the experiment. Here, we describe a compiled protocol for AAA induction, insertion of an intravenous catheter to facilitate prolonged therapy, and serial AAA monitoring by 3D ultrasound. Aneurysms are induced in apolipoprotein E (ApoE) deficient mice by angiotensin II release over 28 days from osmotic mini-pumps implanted subcutaneously into the mouse back. Subsequently, the surgical procedure for external jugular vein catheterization is conducted to allow for daily intravenous drug treatment or repeated blood sampling via a subcutaneous vascular access button. Despite the two dorsal implants, the monitoring of AAA development is readily facilitated by sequential semi-automated 3D ultrasound analysis, which yields comprehensive information on the expansion of aortic diameter and volume and on aneurysm morphology, as illustrated by experimental examples.

This protocol describes the consecutive implantation of an osmotic pump to induce abdominal aortic aneurysm by angiotensin II release in apolipoprotein E (ApoE) deficient mice and of a vascular access port with a jugular vein catheter for repeated drug treatment. Monitoring of aneurysm development by 3D ultrasound is effectively conducted despite dorsal implants.

Trattamento farmacologico mediante catetere venoso centrale in un modello murino di aneurisma dell'aorta addominale indotto da angiotensina II e monitoraggio mediante ecografia 3D

Since pharmaceutical treatment options are lacking in the clinical management of abdominal aortic aneurysm (AAA), animal models, in particular mouse ...

Multiple Intravenous Bolus Dosing and Invasive Hemodynamic Assessment in a Hypoxia-Induced Mouse Pulmonary Artery Hypertension Model

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive life-threatening disease, primarily affecting small pulmonary arterioles of the lung. Currently, there is no cure for PAH. It is important to discover new compounds that can be used to treat PAH. The mouse hypoxia-induced PAH model is a widely used model for PAH research. This model recapitulates human clinical manifestations of PAH Group 3 disease and is an important research tool to evaluate the effectiveness of new experimental therapies for PAH. Research using this model often requires the administration of compounds in mice. For a compound that needs to be given directly into the bloodstream, optimizing intravenous (IV) administration is a key part of the experimental procedures. Ideally, the IV injection system should permit multiple injections over a set time course. Although the mouse hypoxia-induced PAH model is very popular in many laboratories, it is technically challenging to perform multiple IV bolus dosing and invasive hemodynamic assessment in this model. In this protocol, we present step-by-step instructions on how to carry out multiple IV bolus dosing via mouse jugular vein and perform arterial and right ventricle catheterization for hemodynamic assessment in mouse hypoxia-induced PAH model.

This protocol provides a step-by-step procedure for executing multiple intravenous bolus dose administration and invasive hemodynamic monitoring in mice. Investigators can use this protocol for future therapeutic compound screening for pulmonary artery hypertension.

Dosaggio multiplo in bolo endovenoso e valutazione emodinamica invasiva in un modello murino di ipertensione arteriosa polmonare indotta da ipossia

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a progressive life-threatening disease, primarily affecting small pulmonary arterioles of the lung. Currently, ...

L'uso di un venoso Central Line per fluidi, farmaci e nutrienti Administration in un modello murino di malattia critica

Riepilogo

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