Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca di scienza base attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e futuro pianificazione (NRF-2014R1A1A2057527 e NRF-2016R1D1A1B03934418).

1. preparazione del attraverso-foro alluminio piastra e magnete una matrice
<ol><li>Preparare due 50 mm x 50 mm (o superiore) piastre in alluminio. Lo spessore di ogni piatto era 300 µm che è la metà del diametro del tallone.</li>
	<li>Costituiscono una matrice di attraverso-foro di 30 x 30 su una delle piastre in alluminio utilizzando un incisore rotativo di CNC con un po' di micro punta Φ550-µm con 30 mm/s di tasso di tuffo e 8000 RPM di velocità dell'alberino. La distanza tra ogni foro (da centro a centro) era 1 mm (Figura 1a e 2a Figura, io).</li>
	<li>Costituiscono una matrice di 30 x 30 di fori Φ750-µm sull'altra piastra di alluminio, utilizzando la stessa procedura come descritto nella 1.2 (Figura 1a e 2a Figura, ii).</li>
	<li>Collegare le due piastre vicenda utilizzando un nastro adesivo e formare fori di allineamento di mm Φ3 a ciascuno dei quattro angoli di entrambe le piastre in alluminio.</li>
	<li>Immergere le piastre di alluminio in 15% di acido solforico per 12 h pulire le superfici. Dato che il sottile strato di ossido di alluminio sulla superficie dell'alluminio lo rendono resistente alla corrosione, il diametro del foro e lo spessore della piastra non vengono modificate da questo trattamento acido.</li>
	<li>Costituiscono una matrice di 30 × 30 di 1 x 1 x 1 magneti di neodimio mm (con una forza magnetica di 0.363 N). Garantire che ogni magnete è la polarità opposta al suo vicino. Per evitare la rottura o la dispersione della matrice magnete, attaccare una piastra di alluminio di 30 x 30 mm sul fondo della matrice magnete utilizzando nastro biadesivo (Figura 2a, iii e inserto in Figura 2).</li>
</ol>2. processo di registrazione dei colori perlina
<ol><li>Allineare e impilare le due piastre di alluminio (piastra superiore: 750-µm-foro piastra, piastra inferiore: 550-µm-foro piastra) utilizzando i fori di allineamento preparati ai quattro angoli di ciascuna piastra (Figura 1b).</li>
	<li>Bloccare le due piastre insieme inserendo M3 bulloni nei fori di allineamento e quindi fissare i bulloni con dadi (Figura 1b).</li>
	<li>Impilare la piastra di alluminio sulla matrice preparato magnete (Figura 1b, 2be 2C). Allineare la matrice dei magneti e la matrice di attraverso i fori nella piastra di alluminio durante il processo di sovrapposizione. Quindi utilizzare un nastro adesivo per fissare la posizione della matrice magnete.</li>
	<li>Posto un numero sufficiente di acciaio mm SUJ2 Φ600 perline sull'Assemblea di piatto e manipolare le perle utilizzando un acryl (o non-metallici) piastra tali che una perlina diventa intrappolata in ogni buco (Figura 1C, 1De 1e) mentre simultaneamente rimuovendo le perline in eccesso che non hanno presentato nei fori.</li>
	<li>Rimuovere delicatamente la piastra superiore per evitare indesiderate scattering e la dislocazione dei branelli intrappolati (Figura 1f).</li>
</ol>3. concavo microtiter fabbricazione
<ol><li>Spostare lo stampo concavo microtiter, prodotto nei passaggi 2.1 a 2.5, sopra, a una piastra di Petri.</li>
	<li>Mescolare il polidimetilsilossano (PDMS) monomero e agente indurente in base istruzioni19 del produttore con un monomero PDMS: rapporto di 10:1 catalizzatore di vulcanizzazione.</li>
	<li>De-gas la miscela PDMS utilizzando un essiccatore e pompa a vuoto per rimuovere eventuali bolle intrappolate nella miscela PDMS.</li>
	<li>Versare nello stampo concavo microtiter PDMS e de-gas utilizzando la stessa procedura come descritto al punto 3.3 (Figura 1f).</li>
	<li>Cuocere il composto PDMS su una piastra riscaldante a 80 ° C per 2 h formare un substrato PDMS tallone-embedded (Figura 1 g).</li>
	<li>Rimuovere il substrato PDMS curato dallo stampo (Figura 1 g). Nel processo di rimozione, spruzzare di metanolo con bottiglia di lavaggio per staccare il substrato PDMS dallo stampo.</li>
	<li>Utilizzando un Φ15 x 2 mm magnete, rimuovere le sfere d'acciaio intrappolate dal substrato PDMS (Figura 1 h). Per questo processo, può essere utilizzato qualsiasi magnete che è sufficientemente forte per estrarre le perle dal substrato PDMS.</li>
</ol>4. cultura sferoide
<ol><li>Tagliare il substrato PDMS concavo microtiter-fantasia utilizzando un pugno di biopsia di mm Φ14 per essere montati nella piastra a 24 pozzetti in questo studio.</li>
	<li>Sterilizzare il substrato PDMS di mm Φ14 risultante in una sterilizzatrice autoclave a 121 ° C e 15 psi.</li>
	<li>Posto il substrato PDMS in una piastra ben 24.</li>
	<li>Rivestire l'intero substrato PDMS con soluzione al 4% (p/v) pluronic F-127 durante la notte per evitare il collegamento delle cellule sulla superficie di pozzetti. Durante il processo di rivestimento, rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nei pozzetti concavi pipettando o utilizzando un pulitore ad ultrasuoni.</li>
	<li>Lavare tre volte la soluzione di F-127 mediante tampone fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Semi di 1 mL di soluzione di cella-medio (Medium di Eagle per volta di Dulbecco) (che contiene 2 x 106 cellule) sul substrato PDMS. Si noti che la densità di semina può essere cambiata secondo la dimensione della sferoide di destinazione e/o tipo di cella di destinazione. Qui, le cellule staminali adiposo-derivate (ASC) sono state usate.</li>
	<li>Aspirare il 1 mL di terreno utilizzando una pipetta di 1000 µ l per rimuovere tutte le cellule in eccesso che non sono rimasti intrappolate nei pozzetti (Figura 3).</li>
	<li>Incubare le cellule a 36,5 ° C, umidità di > 95% e 5% CO2 condizione. In caso di ASC utilizzata nel nostro studio, le cellule aggregate per uno sferoide in 48h.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+spheroids+as+a+tool+for+prediction+of+radiosensitivity+in+tumor+therapy.">Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy.</a> Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).</li><li>Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+immuno-cytochemical+characterization+of+a+hetero-spheroid+composed+of+fibroblasts+and+hepatocytes.">Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes.</a> J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).</li><li>Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brave+little+world:+spheroids+as+an+in+vitro+model+to+study+tumor-immune-cell+interactions.">Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions.</a> Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+multicellular+tumor+spheroid+model+using+microencapsulation+and+its+application+in+anticancer+drug+screening+and+testing.">Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing.</a> Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).</li><li>Kim, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwell-mediated+micro+cartilage-like+tissue+formation+of+adipose-derived+stem+cell.">Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell.</a> Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+production+and+growth+of+multicellular+tumor+spheroids.">A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).</li><li>Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medium+composition+on+the+morphology+and+function+of+rat+hepatocytes+cultured+as+spheroids+and+monolayers.">Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).</li><li>Nyberg, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+large-scale+formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+in+a+novel+spheroid+reservoir+bioartificial+liver.">Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver.</a> Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).</li><li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+liver-specific+functions+of+porcine+hepatocyte+spheroids+entrapped+in+collagen+gel.">Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li><li>Choi, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled-size+embryoid+body+formation+in+concave+microwell+arrays.">Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays.</a> Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).</li><li>Hwang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clustering+of+pancreatic+islet+cells+using+concave+microwell+array.">Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array.</a> Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).</li><li>Wong, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concave+microwell+based+size-controllable+hepatosphere+as+a+three-dimensional+liver+tissue+model.">Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model.</a> Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).</li><li>Yeon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+concave+microwells+to+pancreatic+tumor+spheroids+enabling+anticancer+drug+evaluation+in+a+clinically+relevant+drug+resistance+model.">Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model.</a> PloS one. 8 (9), (2013).</li><li>Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-lithographic+fabrication+of+concave+microwells+and+a+microfluidic+network.">Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network.</a> Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).</li><li>Corning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).</li><li>Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+cavities+in+polydimethylsiloxane+using+DRIE+silicon+molds.">Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).</li><li>Choi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+culturing+of+single+microalgae+cells,+and+retrieval+of+colonies+using+a+perforated+hemispherical+microwell+structure.">Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure.</a> RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).</li><li>Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+PDMS+microlens+array+by+digital+maskless+grayscale+lithography+and+replica+molding+technique.">Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique.</a> Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+multi-level+microchannel+fabrication+by+pseudo-grayscale+backside+diffused+light+lithography.">Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography.</a> RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+3D+hair+follicle-like+hydrogel+by+soft+lithography.">Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography.</a> J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).</li><li>Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+organoid+culture+of+rat+hepatocytes+and+HepG2+cells.">Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells.</a> J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

La sfida principale di questo metodo di fabbricazione era il fissaggio sicuro dei branelli della matrice del attraverso-foro nella piastra di alluminio. Per risolvere questa sfida, forza magnetica sotto forma di una matrice di 30x30 magnete è stato utilizzato per fissare le perline saldamente, come mostrato nelle figure 6 e 7. La densità di flusso magnetico della matrice di magnete, che ha la polarità opposta, è più forte al centro di ogni superficie del magnete. Poiché l'intensit?...

Le cellule coltivate in una forma sferoide sono più simile a tessuto reale nel corpo di una coltura planare bidimensionale1. Dato questo vantaggio, l'uso di sferoidi è stata adottata per migliorare lo studio della interazione cellula-cellula2,3, immunitario-attivazione4,5e6di differenziazione di screening di stupefacenti. Inoltre, sferoidi incorporando più tipi di cellule sono stati applicati recentemente a organoids (quasi-fisiologiche tessuto tridimensionale (3D)), che sono molto utili per studiare lo sviluppo e la malattia umana7. Diversi metodi sono stati utilizzati per produrre sferoidi. Il metodo più semplice prevede l'utilizzo di una superficie non-adesivo, tale che le cellule di aggregazione con gli altri e sferoidi di forma. Una capsula di Petri può essere trattata con albumina di siero bovino, pluronic F-127 o un polimero idrofobico (ad es. in metacrilato di 2-hydroxyethl poli) per rendere la sua superficie non adesivo89. Il metodo del filatore-pallone è un altro ben noto mezzo di produrre grandi quantità di sferoidi10,11. In questo metodo, le cellule sono tenute in sospensione da mescolando per impedire loro di diventare attaccato al substrato. Invece, il galleggiante cellule aggregato di sferoidi di forma. Il metodo superficiale non adesivo e il filatore boccetta metodo può produrre grandi quantità di sferoidi. Tuttavia, essi sono soggetti a limitazioni compreso le difficoltà nel controllare la dimensione della sferoide, come pure il tracciamento e monitoraggio di ogni sferoide. Come rimedio a tali problemi, un altro metodo di produzione della sferoide, vale a dire, l'impiccagione metodo drop può essere autonomo12. Si tratta di deposito di gocce di sospensione cellulare sulla parte inferiore del coperchio di una piastra di coltura. Queste gocce sono di solito da 15 a 30 µ l di dimensioni e contengono circa 300 a 3000 cellule13. Quando il coperchio viene invertito, le gocce sono tenute in posizione dalla tensione superficiale. L'ambiente di microgravità in ogni goccia si concentra le cellule, che poi formano sferoidi singoli presso l'interfaccia liquido-aria libera. I vantaggi dell'impiccagione metodo drop sono che offre una distribuzione delle dimensioni ben controllato, mentre è facile da tracciare e monitorare ogni sferoide, riguardante i metodi di boccetta di superficie e spinner non adesivo. Tuttavia, questo metodo comporta uno svantaggio in quanto la produzione massiccia di sferoidi e il processo di produzione stesso è eccessivamente labor intensive.
Una matrice di micropozzetti è un piatto piatto con molti micro-dimensione pozzi, ciascuno con un diametro che varia da 100 a 1000 µm. Il principio di produzione di sferoide quando utilizzando micropozzetti è simile a quella del metodo superficiale non adesivo. I benefici includono il fatto che i micropozzetti forniscano spazi tra i micropozzetti per separare le cellule o sferoidi, tale che è facile controllare la dimensione di sferoide, mentre anche lo rende facile da monitorare ogni singola sferoide. Con un gran numero di micropozzetti, produzione di alto-rendimento sferoide è anche possibile. Un altro vantaggio di micropozzetti è l'opzione per pozzi di forma di diverse forme (hexahedral, cilindrico, trigonal prismatico) a seconda di unici scopi sperimentali degli utenti. In generale, tuttavia, una forma di tridimensionale (3D) concava (o emisferica) è considerata come essendo il più adatto per la produzione di uniforme-dimensioni singoli sferoidi. Di conseguenza, l'utilità di micropozzetti concavi è stato segnalato per molti studi di biologia cellulare come quelli esame del cardiomyocyte differenziazione delle cellule staminali embrionali14, la secrezione dell'insulina delle cellule dell'isolotto cluster15, la attività enzimatica di epatociti16e la farmacoresistenza tumorale sferoidi17.
Purtroppo, la fabbricazione di micropozzetti spesso richiede strutture specializzate micropatterning; metodi convenzionali basati su fotolitografia richiedono esposizione e strutture in via di sviluppo mentre metodi basati su ion-acquaforte reattive bisogno apparecchiature plasma e il fascio di ioni. Tale attrezzatura è costosa che, insieme con il processo di fabbricazione complicati, presenta un'elevata barriera all'entrata per i biologi che non hanno accesso alla microtecnologia. Per superare questi problemi, altri metodi economici come ghiaccio Litografia18 (con le goccioline di acqua congelata) e il metodo di membrana flessibile14 (utilizzando una membrana, substrato del attraverso-foro e un vuoto) sono stati suggeriti. Tuttavia, questi metodi inoltre incorrere in seri inconvenienti come fosse difficile controllare le dimensioni del modello, il raggiungimento di elevati rapporti di aspetto e la produzione di più grande zona micropozzetti.
Per superare i problemi di cui sopra, stiamo proponendo un metodo di fabbricazione del romanzo concavo microtiter utilizzando un substrato del attraverso-foro, le perline in acciaio e una matrice di magnete. Utilizzando questo metodo, centinaia di micropozzetti sferici concavi può essere fabbricato sfruttando il meccanismo di perline metalliche autobloccanti magnetico-forza-assistita (Figura 1). Il processo di fabbricazione prevede l'utilizzo di pochissimi servizi costosi e complicati e non richiede molte competenze avanzate. Come tale, anche addestrato può facilmente intraprendere questo metodo di fabbricazione. Per illustrare il metodo proposto, umano-adiposo-ha derivato le cellule staminali sono state coltivate nei pozzetti concavi per produrre sferoidi.

<table><tbody><tr><td>CNC rotary engraver</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>Micro drill bit</td><td>HAM Pr&amp;auml;zision</td><td>30-1301 TA</td><td>&amp;Phi; 0.55 and 0.75 mm</td></tr><tr><td>Sulfuric acid 98%</td><td>Daejung</td><td>7683-4100</td><td>For cleaning aluminum plate.&lt;br/&gt; Dilute with distilled water with 15% solution</td></tr><tr><td>Neodymium magnet</td><td>Supermagnete</td><td>W-01-N</td><td>1 x 1 x 1 mm</td></tr><tr><td>Bearing ball</td><td>Agami Modeling</td><td>SUJ2</td><td>&amp;Phi; 600 &amp;mu;m steel bead</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>p2443</td><td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle&#039;s medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Adipose-derived mesenchymal stem cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-011</td><td></td></tr></tbody></table>

a paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries

Una cultura di sferoide è uno strumento utile per comprendere il comportamento cellulare in quanto fornisce un in vivo-come ambiente tridimensionale. Vari metodi di produzione di sferoide come superfici non-adesivo, boccette filatore, impiccagione gocce e micropozzetti sono stati utilizzati in studi di interazione della cellula--cellula, immunitario-attivazione, lo screening, staminali differenziazione cellulare e generazione organoid. Tra questi metodi, micropozzetti con una geometria tridimensionale concava hanno guadagnato l'attenzione di scienziati e ingegneri, dati loro vantaggi di generazione sferoide uniforme di dimensioni medie e la facilità con cui possono essere le risposte di sferoidi individuali monitorati. Anche se sono stati proposti metodi economici come l'uso di membrane flessibili e ghiaccio Litografia, queste tecniche comportano gravi inconvenienti quali difficoltà nel controllare le dimensioni del reticolo, raggiungimento di elevati rapporti di aspetto e la produzione di aree più grandi di micropozzetti. Per superare questi problemi, vi proponiamo un metodo affidabile per la realizzazione di micropozzetti concavi senza la necessità di complesse strutture di costi elevati. Questo metodo utilizza una matrice di foro passante 30x30, diverse centinaia di micrometro-ordine acciaio perle e la forza magnetica per fabbricare 900 micropozzetti in un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) 3 x 3 cm. Per dimostrare l'applicabilità del nostro metodo per applicazioni biologiche delle cellule, abbiamo coltivate cellule staminali adipose per 3 giorni e prodotto con successo utilizzando la nostra piattaforma microtiter sferoidi. Inoltre, abbiamo effettuato una simulazione di magnetostatica per studiare il meccanismo, per cui la forza magnetica è stato utilizzato per intrappolare le sfere d'acciaio nei fori. Noi crediamo che il metodo di fabbricazione microtiter proposto potrebbe essere applicato a molti studi cellulari basati su sferoide quali lo screening di stupefacenti, rigenerazione tissutale, differenziazione delle cellule staminali e metastasi del cancro.

Uno stampo convesso e microtiter modello erano stati fabbricati con successo seguendo la procedura descritta 2.1 a 3.7. (Figura 4). Le perle d'acciaio commerciali sono rimasti intrappolate nella matrice del attraverso-foro di 30x30. Le perle erano tenute strettamente senza lacune tra le perline e i corrispondenti fori di passaggio (Figura 4a). La forma del fabbricato microtiter concavo è concavo emisferica, con un diametro di 60...

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A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Questo manoscritto presenta un metodo affidabile di fabbricare micropozzetti concavi senza la necessità di complesse strutture di costi elevati. Usando la forza magnetica, perline in acciaio e una matrice di attraverso-foro, diverse centinaia micropozzetti sono stati formati in un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) 3 x 3 cm.

Una perlina accoppiato e matrice di magnete per lo stampaggio di micropozzetti con geometrie variabili concavi

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

a-paired-bead-magnet-array-for-molding-microwells-with-variable

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Unit 1

Magnetic Forces and Fields

SCIENTISTS IN ACTION

8.6K Views.  Chung-Ang University. Questo manoscritto presenta un metodo affidabile di fabbricare micropozzetti concavi senza la necessità di complesse strutture di costi elevati. Usando la forza magnetica, perline in acciaio e una matrice di attraverso-foro, diverse centinaia micropozzetti sono stati formati in un substrato di polidimetilsilossano (PDMS) 3 x 3 cm.

Video: A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is particularly useful for separations applications. Porous polydimethylsiloxane (PDMS) beads can be produced by heat-curing such an emulsion, allowing the interface between the aqueous and aliphatic phases to mold the morphology of the polymer. In the procedures described here, both polymer and crosslinker (triethoxysilane) are sonicated together in a cold-bath sonicator. Following a period of cross-linking, emulsions are added dropwise to a hot surfactant solution, allowing the aqueous phase of the emulsion to separate, and forming porous polymer beads. We demonstrate that this method can be tuned, and the SAV ratio optimized, by adjusting the electrolyte content of the aqueous phase in the emulsion. Beads produced in this way are imaged with scanning electron microscopy, and representative SAV ratios are determined using Brunauer&#8211;Emmett&#8211;Teller (BET) analysis. Considerable variability with the electrolyte identity is observed, but the general trend is consistent: there is a maximum in SAV obtained at a specific concentration, after which porosity decreases markedly.

Procedures used to generate microstructured concave-porosity polydimethylsiloxane beads are presented. Effects of electrolyte concentration and identity within the aqueous phase are particularly emphasized.

Fabbricazione microbolle di Perline PDMS Concavo-porosità

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

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Chimica

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious approach of pipetting an arbitrary number of cells into well plates. The interactions between the stem cells forced into close proximity of one another promotes the generation of the EBs. Because the media in each of the wells has to be manually exchanged every day, this approach is manually intensive.
Moreover, because environmental parameters including cell-cell, cell-soluble factor interactions, pH, and oxygen availability can be functions of EB size, cell populations obtained from traditional hanging drops can vary dramatically even when cultured under identical conditions. Recent studies have indeed shown that the initial number of cells forming the aggregate can have significant effects on stem cell differentiation. We have developed a simple, rapid, and scalable culture method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development. Finally, these cells are easily accessible for further analysis and experimentation. This method is amenable to any lab and requires no dedicated equipment. We demonstrate this method by creating embryoid bodies using a red fluorescent mouse cell line (129S6B6-F1).

We show a simple and rapid method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development.

Shrinky-Dink Hanging Gocce: un modo semplice per forma e cultura corpi embrionali

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious ...

Biologia

Creating Sub-50 Nm Nanofluidic Junctions in PDMS Microfluidic Chip via Self-Assembly Process of Colloidal Particles

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its transparency. Due to the softness of the PDMS material, however, it is challenging to use PDMS for building nanochannels. The channels tend to collapse easily during plasma bonding. In this paper, we present an evaporation-driven self-assembly method of silica colloidal nanoparticles to create nanofluidic junctions with sub-50 nm pores between two microchannels. The pore size as well as the surface charge of the nanofluidic junction is tunable simply by changing the colloidal silica bead size and surface functionalization outside of the assembled microfluidic device in a vial before the self-assembly process. Using the self-assembly of nanoparticles with a bead size of 300 nm, 500 nm, and 900 nm, it was possible to fabricate a porous membrane with a pore size of ~45 nm, ~75 nm and ~135 nm, respectively. Under electrical potential, this nanoporous membrane initiated ion concentration polarization (ICP) acting as a cation-selective membrane to concentrate DNA by ~1,700 times within 15 min. This non-lithographic nanofabrication process opens up a new opportunity to build a tunable nanofluidic junction for the study of nanoscale transport processes of ions and molecules inside a PDMS microfluidic chip.

We propose a simple self-assembly technique of silica colloidal nanoparticles to create a nanofluidic junction between two microchannels in polydimethylsiloxane (PDMS). Using this technique, a nanoporous bead membrane with a pore size down to ~45 nm was built inside a microchannel and applied to electrokinetic preconcentration of DNA samples.

Creazione di Sub-50 Nm nanofluidic giunzioni in PDMS Microfluidic Chip tramite processo di auto-assemblaggio di particelle colloidale

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its ...

Ingegneria

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Bioingegneria

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polimerici Microneedle Array Fabrication per Fotolitografia

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Facile e preciso meccano-profiling su micropost Array

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or complicated equipment, making fabrication costly and incompatible with mass production, which is one of the most important preconditions for point-of-care tests (POCT) to be adopted in low-resource settings. This work describes the fabrication process of an acrylic (polymethylmethacrylate, PMMA) device for nanoparticle-conjugated enzymatic immunoassay testing using the computer numerical control (CNC) micromilling technique. The functioning of the microfluidic device is shown by performing an immunoassay to detect a commercial antibody using lysozyme as a model antigen conjugated to 100 nm magnetic nanoparticles. This device integrates a physical staggered restriction of only 5 &#181;m in height, used to capture magnetic microparticles that make up a magnetic trap by placing an external magnet. In this way, the magnetic force on the immunosupport of conjugated nanoparticles is enough to capture them and resist flow drag. This microfluidic device is particularly suitable for low-cost mass production without the loss of precision for immunoassay performance.

Microfluidics is a powerful tool for the development of diagnostic tests. However, expensive equipment and materials, as well as laborious fabrication and handling techniques, are often required. Here, we detail the fabrication protocol of an acrylic microfluidic device for magnetic micro- and nanoparticle-based immunoassays in a low-cost and simple-to-use setting.

Microfresatura a controllo numerico computerizzato di un dispositivo acrilico microfluidico con restrizione sfalsata per saggi immunologici magnetici basati su nanoparticelle

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or ...

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

Pinzette magnetiche ad alta velocità per misure nanomeccaniche su elementi sensibili alla forza

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Biochimica

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...