Questo lavoro è stato gentilmente finanziato dal Wellcome Trust, la Biotecnologia e Scienze Biologiche Research Council, e l&#39;Irwin Joffe Memorial Fellowship.

dichiarazione etica: Tutto il lavoro animale è stato condotto con la licenza e l&#39;approvazione del Regno Unito Home Office. partecipazione umana in questa ricerca è stato approvato dai comitati misti UCL / UCLH sul Etica della ricerca umana. Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato. 1. Preparazione di C. albicans <ol><li> Crescere un disco Candida (vedi Materiali List) su un piatto YPD agar secondo le istruzioni del produttore. Scegli una colonia e aggiungerlo a 15 ml di YPD brodo. Incubare in un incubatore agitazione a 30 ° C e 200 rpm fino a quando il brodo è torbida (solitamente circa 2 giorni, o ad una concentrazione di circa più di 1 x 10 9 / mL). </li><li> Centrifugare il mezzo Candida e risospendere in 50 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Centrifugare a 3.000 g per 10 min. Ripetere questa operazione due volte. </li><li> Posizionare la provetta contenente 50 ml di mezzo di PBS / Candida in un bagno di acqua preriscaldata a 60 ° C in modo che l&#39;intero tubo è submerged per 1 h. <ol><li> Per confermare che il Candida sono ucciso al calore, consecutive un campione su una piastra YPD agar ed incubare una notte a 30 ° C. Regolare la concentrazione (HK) Candida ucciso al calore a 5-9 x 10 8 / mL, a seconda della crescita Candida, e memorizzarlo in 1 mL aliquote in un congelatore a -20 ° C. NOTA: Tutte le conta di cellule in questo protocollo sono stati eseguiti utilizzando un contatore di cellule automatizzato. </li></ol></li></ol> 2. S-1 accoppiamento al ucciso al calore (HK) Candida <ol><li> Preparare un&#39;aliquota di carbossi-S-1 succinimidil estere (50 ug) diluendo in 100 ml di alta qualità dimetil solfossido (DMSO). Vortex bene per amalgamare. </li><li> Preparare 1 ml di 1 x 10 8 HK Candida in 0,1 M di bicarbonato di sodio (pH 8,3) in una provetta da 15 ml. </li><li> Aggiungere 100 ml di carbossi-S-1 una goccia alla volta per l&#39;HK Candida mescolando in un vortice a circa 2,000 rpm (media ad alta velocità). Avvolgere FOI in alluminiol attorno al tubo e posizionarlo su un rullo a temperatura ambiente per 1 h. </li><li> Lavare la HK Candida- S-1 (HKC-S-1) tre volte per centrifugazione a 2.250 xg per 10 min ciascuno. Per i primi due lavaggi, risospendere il pellet in 15 ml di 0,1 M sodio bicarbonato (pH 8,3). Dopo il terzo lavaggio, risospendere in 1 ml di tampone di soluzione salina bilanciata (BSS) (vedi Tabella 1). </li><li> Trasferire i HKC-S-1 sospensione in provette in aliquote di 100 microlitri e conservarli a -20 ° C. NOTA: Usare tubi basso legame superficie del materiale, se possibile, come HKC-S-1 particelle possono aderire alla parete di provette da centrifuga normali. </li><li> Opsonize HKC-S-1 <ol><li> Per i neutrofili umani, aggiungere 100 ml di siero IgG umana di 100 ml di scongelati HKC-S-1. </li><li> Per i neutrofili topo, aggiungere 50 ml di siero normale di topo e 50 ml di topo Candida siero immune (generato da topi iniettati con C57B6 HK Candida) da 5 a 100 microlitridi HKC-S-1. </li><li> Mescolare a fiamma-shaker a 37 ° C e 1100 rpm per 60-90 minuti, e poi su un rullo 4 ° C per 2 h. </li><li> Lavare tre volte in tampone BSS per centrifugazione a 17.200 xg per 1 min ciascuna. Risospendere in 100 microlitri di tampone BSS. </li></ol></li></ol> 3. Isolamento dei neutrofili <ol><li> Per i neutrofili del sangue periferico umano, prendere 15 ml di sangue mediante venopuntura da un donatore sano e posizionarlo in una siringa da 20 ml contenente 90 ml di soluzione di eparina sodica 1.000 UI / ml (60 ml di eparina / 10 ml di sangue). </li><li> Usando una punta della pipetta, iniettare 1,5 ml di soluzione di destrano 10% nella siringa. Capovolgere delicatamente 3 volte e lasciarlo in piedi sul banco. </li><li> Attendere 30-60 minuti, fino a quando il sangue è diviso all&#39;incirca a metà, con uno strato superiore buffy coat che è paglierino e uno strato inferiore contenente eritrociti. </li><li> spingere delicatamente lo strato superiore attraverso un ago o rimuovere con un puntale. Mettilo iTubo 15 ml na. Evitare di prendere lo strato rosso. Usando una pipetta mL 5, aggiungere 3-4 ml di media densità gradiente (vedi Lista dei materiali) al fondo della provetta sotto lo strato buffy coat avere due strati distinti. Centrifugare a 913 g per 10 min. NOTA: Se si utilizzano i neutrofili topo (vedi riferimento 17 per l&#39;isolamento dei neutrofili topo), utilizzare la sospensione cellulare che è stata lavata dal midollo osseo invece. </li><li> Eliminare il surnatante, lasciando dietro di sé una pallina rossa. Delicatamente vortice per disturbare il pellet. Aggiungere 7 ml di acqua distillata, H 2 O autoclavato al pellet e invertire per 20 s per risospendere il pellet. Aggiungere 7 ml di soluzione fisiologica 2x e capovolgere un paio di volte per mescolare, lisi i globuli rossi rimanenti. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 min. Eliminare il sopranatante e risospendere il pellet in tampone BSS a circa 4 x 10 6 / ml. NOTA: Per la microscopia ottimale delle cellule, mantenere la concentrazione sospensione cellulare tra 1,5-6 x 10 6 </sup&gt; / mL. </li></ol> 4. Preparazione di diapositive <ol><li> Pre-trattamento di una piastra di microscopia 8 pozzetti (vedi Elenco materiali) con 200 ml di poli-L-lisina (soluzione 0,01%) in ciascun pozzetto per 40-60 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la poli-L-lisina (può essere riutilizzato) e lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di H 2 O distillata O. </li><li> Aggiungere 200 microlitri di sospensione cellulare preparata nella fase 3.6 a ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 30-60 min. </li><li> Preparare un&#39;aliquota di 5- (e-6) -carboxy S-1 acetossimetil (S-1-AM) estere (50 ug) aggiungendo 100 ml di alta qualità DMSO a un tubo. Vortex per miscelare. Quando non in uso, conservare a -20 ° C. </li><li> In un piccolo tubo, aggiungere 1,7 ml di tampone BSS e 20 ml di S-1-AM. Vortex per miscelare. </li><li> Lavare i pozzetti due volte con 200 ml di tampone BSS, e quindi sostituire il tampone con la soluzione S-1-AM. Fare attenzione a non disturbare il monostrato di cellule attaccate al fondo del pozzo delicatamente pipettandole pareti dei pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per almeno 25 min. </li><li> Lavare i pozzetti due volte con 200 microlitri di tampone BSS. Per provare un inibitore, costituiscono un &quot;master mix&quot; del farmaco appropriato in buffer di BSS. Lavare i pozzetti due volte nella soluzione inibitore. NOTA: Assicurarsi di utilizzare la stessa quantità di veicolo farmaco (ad esempio, DMSO o etanolo) nel pozzetto di controllo come è stato utilizzato per l&#39;inibitore. Se testare l&#39;effetto di cloruro di zinco, utilizzare BSS tampone privo KH 2 PO 4 (HEPES può tamponare la soluzione da solo), come zinco precipita con fosfato. </li><li> Sonicare il opsonizzati HKC-S-1 (paragrafo 6.2) per circa 3 s a 5 um ampiezza. Aggiungere 10 ml a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 15-20 minuti per consentire fagocitosi, rendendo le cellule pronti per essere ripreso per istantanee di fagocitosi. </li></ol> 5. Microscopia confocale <ol><li> Utilizzando un microscopio confocale, regolare la lunghezza d&#39;onda del laser in modo thle cellule sono eccitati a 555 nm e l&#39;emissione viene rilevata da due canali, o rivelatori: 560-600 nm e oltre 600 nm. NOTA: I parametri specifici microscopio differiranno per ogni microscopio e devono essere ottimizzati dal ricercatore. </li><li> Visualizzare le cellule utilizzando un obiettivo 63X con l&#39;olio. Utilizzare un&#39;immagine di tegola-scan sulla regolazione continua per vedere la piastrella centrale. Utilizzando l&#39;intensità di fluorescenza e il guadagno di canali del rilevatore, regolare il fuoco e l&#39;intensità del laser e il guadagno dei due canali per ottimizzare l&#39;immagine. </li><li> Suddividere l&#39;immagine utilizzando le impostazioni per visualizzare entrambi i canali; controllare che non v&#39;è alcuna saturazione di intensità di fluorescenza nel citoplasma o vacuoli. Saturazione appare come puntini rossi. Ridurre l&#39;intensità del laser in modo che ci sia un numero minimo di punti rossi, ma le cellule e fagosomi sono abbastanza brillante da poter vedere chiaramente. </li><li> Al termine, clicca su &quot;Avviare esperimento.&quot; Un&#39;immagine scansione 9-tile viene generato. Salvare l&#39;immagine come file complesso consigliato dail software che contiene un&#39;immagine composita dei due canali (non jpeg o TIFF). </li></ol> 6. Esperimenti di calibrazione <ol><li> Costruire la curva standard pH con sola Candida. <ol><li> Preparare i tamponi da pH 3,0 a 13.0 come da Tabella 1. </li><li> Prendere un&#39;aliquota (100 ml) di HKC-S-1. Spin giù per 1 min a 17.200 x g. Risospendere in 500 microlitri di buffer assegnato. </li><li> A partire dal range di pH più basso, aggiungere la sospensione a un pre-trattati bene (dal punto 4.2). Posizionare il vetrino sul microscopio confocale su un palco riscaldato impostato a 37 ° C. </li><li> Registrare la fluorescenza ogni minuto per 10 min. Ripetere per ogni buffer. </li></ol></li><li> Saponina curva standard. <ol><li> Isolare 1 x 10 7 neutrofili umani 5 e risospendere in 1 ml di tampone a pH più basso. </li><li> Seguire il metodo descritto al punto 4 per misurare phagosomal pH nei neutrofili. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con la sospensione Candida per 20 min, aggiungere 0,3% saponina (15 ml di 10% stock di un pre-trattati bene (dal punto 4.2)) al piatto, e incubare per 20 min a 37 ° C. Prendete un&#39;immagine ogni minuto per 10 min. Ripetere per ogni buffer. </li></ol></li><li> Curve citosolici titolate utilizzando la tecnica alta K 5, 18, 19 + / nigericin. <ol><li> Portare i buffer descritti nella Tabella 1, da pH 4,0-13,0. </li><li> Seguire i passaggi 4.1-4.7, lasciando solo i neutrofili nei pozzetti pre-trattati - ogni pozzetto per contenere un buffer diverso. Aggiungere la slitta nella fase riscaldata 37 ° C e registrare la fluorescenza ogni minuto per 10 min. </li><li> Nota: Esso può richiedere molto tempo per il pH citosolico per stabilizzare la soluzione esterna, ma dopo questo punto, il valore del rapporto S-1 diventacostante. Misurando i extracellulari HKC-S-1 in ogni esperimento può servire come un controllo per verificare che i inibitori aggiunti non interferiscono con la fluorescenza emessa S-1 o alterare il pH del tampone. </li></ol></li></ol> Analisi 7. Immagine NOTA: Qui, le istruzioni per l&#39;analisi delle immagini (quantificazione della fluorescenza) utilizzando il software ImageJ è gratuito. Si consiglia l&#39;uso di ImageJ. <ol><li> Scaricare e installare la versione ImageJ&gt; 1.46r secondo le istruzioni dello sviluppatore (https://imagej.nih.gov/ij/). Installare il file di codice aggiuntivo allegato al presente protocollo chiamato “misurazione Phagosomal.” </li><li> Apri immagine J e caricare il file di immagine scelta per l&#39;analisi sulla barra degli strumenti. Per combinare i due canali, utilizzare Immagine&gt; Colore&gt; Crea Composite. </li><li> Tasto destro del mouse per scegliere un file in cui memorizzare i risultati. </li><li> Fare clic sullo strumento linea sulla barra degli strumenti e fare doppio clic per aumentare la larghezza a &amp; #34; 2 &quot;. </li><li> Tracciare una linea su tutta la larghezza di un phagosome, e quindi fare clic destro su &quot;misura del pH&quot;. L&#39;intensità media dei due canali è acquisito, e il loro rapporto è calcolato automaticamente dal file di codice in ImageJ. </li><li> Dopo aver terminato le misurazioni, fare clic destro per scegliere &quot;salvare il file.&quot; </li><li> Per misurare l&#39;area phagosome, utilizzare la quarta icona lungo la barra degli strumenti per disegnare a mano libera intorno alla zona. Tasto destro del mouse per selezionare &quot;area di misura.&quot; NOTA: I risultati vengono salvati e un file di log viene generato nella directory selezionata. I risultati possono essere trattati con foglio, R, o un programma equivalente. Il rapporto tra il rapporto di fluorescenza a pH circa sigmoidale, e valori di rapporto generati dall&#39;analisi ImageJ può essere convertito pH utilizzando una funzione logistica generalizzata o sigmoide o lineare o cubica interpolazione spline. </li><li> Per misurare il citoplasma, tracciare una linea attraverso il citoplasma e fare clic destro su “misura del pH”. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Una volta che i reagenti appropriati, impostazioni del microscopio, ed esperimenti di calibrazione vengono impostati, questo metodo è relativamente semplice da eseguire. I passaggi critici comprendono: etichettatura Candida con S-1 per garantire che non vi sia sovraccarico del colorante, taratura, e l&#39;analisi dell&#39;immagine. S-1 è un reagente adatto a più ambienti a pH alcalino, che è particolarmente importante per i neutrofili 21 ma ne limita l&#39;utilizzo in alcuni tipi di cellule. Per gli ambienti più acidi, come macrofagi, fagosomi SNARF-4, o S-4, è più adatto a causa della sua bassa pKa 22. Inoltre, per le letture citoplasmatici più accurate, è meglio usare S-4, come curva standard per S-1 mostra che i rapporti di fluorescenza cominciano a pianoro sottostante pH 6 (figura 3). Altri coloranti, quali 2&#39; , 7&#39;-bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -Carboxyfluorescein (BCECF) o pHrodo Red possono anche essere più adatto in un context che dovrebbe essere acide. Ancora la colorazione citoplasma è ancora necessaria per la corretta individuazione dei fagosomi contenenti Candida. Una caratteristica importante di un indicatore di pH phagosomal è che non trasformazione irreversibile dall&#39;ambiente phagosomal reattivo. S-1 sembra essere resistente al milieu dei neutrofili. Ciò è dimostrato dal Levine et al. 5 (vedi complementare Video 4 su riferimento 5), che dimostrano la fagocitosi e il successivo rilascio di una particella Candida S-1 marcato da un Hvcn1 - / - neutrofili. Quando fagocitati, la particella passa da giallo / arancio a rosso (neutro a pH alcalino), ma quando la particella viene rilasciato dal neutrofili, ritorna al suo colore originale. È importante ricordare alcune delle limitazioni associate all&#39;utilizzo S-1. Il fatto che questo colorante ha due spettri di emissione permettendo meas raziometricheurement è un vantaggio, ma attrezzature specialistiche è necessaria per acquisire immagini; il microscopio utilizzato per gli esperimenti deve essere in grado di registrare due immagini simultaneamente o con un ritardo insignificante. Gli autori supporre che il ricercatore di tentare questo protocollo ha esperienza usando la microscopia confocale, o ha accesso a un professionista qualificato. Non possiamo elencare tutti i parametri del microscopio specifici poiché essi variano per ciascun microscopio e devono essere ottimizzate dal ricercatore. L&#39;estere acetossimetil coniugato S-1 che permette il colorante di diffondersi nel citoplasma cellulare è degradata da esterasi non specifiche nel citoplasma cellulare per formare la molecola fluorescente. Esterasi, quali fosfatasi alcalina, sono presenti nel siero umano e siero bovino fetale, che vengono utilizzati per integrare mezzi di coltura cellulare. Di conseguenza, il mezzo in cui le cellule vengono caricate con S-1-AM (paragrafo 4.5) non deve contenere siero. Questo potrebbe rivelarsi difficile se utilizzando cellule che richiedono una maggiore sostanza-rich di media per sostenere loro che la soluzione salina bilanciata utilizzata in questo protocollo. Analogamente, altri componenti medie fluorescenti, quali rosso fenolo, possono interferire con S-1 misurazioni. Le barre di errore in figura 3 indicano che v&#39;è una certa variazione nelle misurazioni del rapporto ad ogni pH. Un numero adeguato di ripetizioni di ogni esperimento (almeno n = 3) e sono necessari come molte misure individuali in ogni singolo esperimento per superare la variabilità inter-vacuolare. È pertanto consigliabile misurare il pH di almeno 100 fagosomi per ogni condizione e altrettante aree phagosomal che sembrano contenere un solo Candida. Fagosomi da misurare per la quantificazione dovrebbero essere quelli che hanno completamente inghiottito una particella Candida (cioè quelle completamente circondato da citoplasma). Per mitigare contro pregiudizi non intenzionali nella selezione di cellule / fagosomi per la quantificazione, tutte le analisi devono essere eseguite mentrecieco alle condizioni sperimentali. Qui, descriviamo l&#39;isolamento dei neutrofili per sedimentazione destrano di sangue intero e centrifugazione dello strato di plasma attraverso un gradiente di densità. Usiamo questa tecnica come modo rapido ed efficiente produce una popolazione puro (&gt; 95%) di neutrofili, anche se ci sono altri metodi disponibili, come tutta la centrifugazione del sangue attraverso altre formule gradiente di densità o selezione negativa di neutrofili utilizzando kit specializzati con anticorpi o magnetico perline. Tuttavia, quest&#39;ultimo può essere proibitivo per la maggior parte dei gruppi che isolano neutrofili di routine. Inoltre, usiamo l&#39;eparina anticoagulante nel tubo di raccolta sangue, mentre altri ricercatori può essere più abituati a usare acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) o sodio citrato acido (ACD). Come ci sono molti metodi diversi tra cui scegliere, spetta alla preferenza personale del ricercatore. Inoltre,quando isolare e manipolare neutrofili devono essere maneggiati con una certa cura per evitare eccessiva attivazione. misure precauzionali includono: solo con oggetti in plastica, nessun vetro; filtrata sterilizzare tutti i tamponi per rimuovere eventuali contaminanti endotossina; quando neutrofili filatura assicurarsi che la centrifuga è ben equilibrato per evitare vibrazioni eccessive; limitare il più possibile i neutrofili tempo rimangono in un pellet dopo centrifugazione; non mantenere in soluzione neutrofili superiore a 5 x 10 6 / ml; ed eseguire l&#39;esperimento non appena possibile dopo l&#39;isolamento. Questo metodo può essere atto a misurare variazioni dell&#39;area di pH e phagosomal nel tempo utilizzando una scenografia riscaldata a 37 ° C sul microscopio e prendendo istantanee volta ogni 30-60 s dalla stessa posizione, come descritto per la fase di calibrazione. Potrebbe anche teoricamente essere adattato per esperimenti superiore throughput, come in piastre da 96 pozzetti, e per citometria a flusso esperimenti, dove S-1 puòessere usata come indicatore di pH 23. Tuttavia, in queste impostazioni, l&#39;accento sull&#39;attività singola cella viene sostituito da un effetto più globale sulla popolazione di cellule. Questo metodo ha lo scopo di fornire una relativamente semplice apparato sperimentale su cui i singoli ricercatori possono adattare alle loro area di interesse. Ricercatori potrebbe voler esplorare neutrofili phagosomal pH e la zona mentre anche misurando movimento di altri ioni, per esempio, la concentrazione di calcio intracellulare. Ci sono diversi fluorescenti Ca 2+ indicatori prontamente disponibili per la microscopia confocale, come indo-1, che ha anche spettri doppia emissione a 400 e 475 nm 24. Queste lunghezze d&#39;onda di emissione non si sovrappongono con S-1 spettri di emissione, ma la lunghezza d&#39;onda di eccitazione è alla fine ultravioletta (UV) dello spettro, che possono essere dannosi per le cellule, e un laser UV non è comune a tutti i microscopi. Una rassegna completa dei diversi indicatorimisurare flusso di calcio intracellulare è coperto da Takahashi et al. 25 e Hillson et al. 26. In conclusione, ci sono altri metodi disponibili per misurare il pH phagosomal utilizzando diversi coloranti fluorescenti come Nunes et al. hanno dimostrato 13 come pure altri gruppi 27, 28. Altri ricercatori hanno utilizzato anche S-1 per misurare citosolico pH 29 o phagosomal pH 14. Tuttavia, questo protocollo è unica nel misurare simultaneamente il pH sia citosol e phagosome, che prevede la possibilità di osservare variazioni phagosomal sezione trasversale e distinguere tra tipo selvatico e Hvcn1 - / - neutrofili topo, e neutrofili umani con e senza lavorando NADPH ossidasi.

Il neutrofili è il più abbondante cellula immunitaria innata del corpo. La sua funzione principale è costituito pattugliano sangue e inghiottendo e digerendo le particelle estranee che potrebbe verificarsi in un processo noto come fagocitosi 1, 2. Le particelle vengono degradati in un compartimento intracellulare chiamato phagosome. L&#39;attivazione di neutrofili NADPH ossidasi, la NOX2 isoforma, avvia una cascata di reazioni biochimiche che culmina nella morte del patogeno. Subunità proteiche NOX2 procedere per formare un complesso di catena di trasporto degli elettroni nella membrana phagosomal 3. Una volta attivato, trasporta elettroni dal NADPH attraverso la membrana all&#39;ossigeno molecolare all&#39;interno phagosome, producendo anioni superossido e specie di ossigeno reattive ulteriormente. Questo è noto come il burst respiratorio, ed è pensato per essere essenziale per un efficiente uccisione microbica e la digestione 2 </sup&gt;. Tuttavia, questo movimento esclusivo di carica negativa attraverso la membrana presto inattivare NOX2 se non fosse compensato da carica positiva trasferirsi e / o carica negativa muoversi dalla phagosome. È stato ben stabilito che la maggior parte di compensazione di carica nella neutrofili è effettuato dal canale protone HVCN1 4, 5. Questo canale permette il movimento passivo di protoni il loro gradiente elettrochimico dal citosol phagosome. concentrazione protonica è riflessa dal pH, quindi per un dato livello di attività ossidasi, misurando il pH nel phagosome può fornire informazioni sulla relativa partecipazione di percorsi protonici e non protonici a compensazione di carica. Neutrofili phagosome umano ha un pH alcalino di circa 8,5 per 20-30 min dopo fagocitosi 5. Ciò implica l&#39;esistenza di ulteriori canali non-protone ioni di NOX2-indotta compensazione di carica, come la fusione e il rilascio del contenuto dei granuli acidi e suola compensazione di HVCN1 manterrebbe un ambiente acido, a differenza di quello osservato. Il movimento di ioni per compensare questa carica negativa possono anche esercitare cambiamenti nelle dimensioni fagosoma osmosi. Questi possono essere ioni presenti nel neutrofili ad alte concentrazioni fisiologiche: ioni potassio hanno dimostrato di trasferirsi nella phagosome 6, e cloruro di movimento ionico è un altro candidato importante per la funzione dei neutrofili 7. La regolazione del pH nel phagosome è vitale per antimicrobica attività proteasica 5. Mieloperossidasi (MPO) sembra avere attività ottimale a pH 6, mentre per catepsina G e elastasi, i livelli ottimali sono pH 7-9 e pH 8-10, rispettivamente 5. Pertanto, il cambiamento transitoria del pH phagosomal può fornire nicchie di attività per i diversi enzimi per divertimentoction. Capire come il pH è coinvolto in neutrofili uccisione microbica può fornire informazioni utili per la progettazione di nuovi agenti microbici neutrofili-aumentare. Il phagosome neutrofili è un ambiente altamente reattivo. Ciò rende difficile valutare con precisione pH, perché coloranti possono essere facilmente ossidati, portando ad artefatti tecnici. Storicamente, isotiocianato di fluoresceina (FITC) è stata la tintura di scelta per misurare intracellulare pH 8, 9. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi per il suo utilizzo nella misurazione del pH dei neutrofili phagosomal. Esso ha un pKa di 6,4 10, il che significa che si può solo accuratamente essere utilizzato per valutare i livelli di pH compreso fra 5 7.5 8, come si satura a pH &lt;8 11. Come il pH dei neutrofili phagosomal può diventare molto più alcalino 5, FITC non può catturare l&#39;intera gamma di potenziali variazioni di pH. Un ulteriore signifiproblema sopraelevazione con FITC nel contesto di neutrofili è che è pensato per essere fotodecolorate da MPO 12. L&#39;inibitore MPO, azide di sodio, può essere utilizzato per limitare photobleaching 13, ma è stato dimostrato che la sodio azide, riduce direttamente il pH phagosomal in modo MPO indipendente ed è quindi inadatto per l&#39;uso in tali saggi 5. Rispetto ad altri coloranti intracellulari, S-1 ha una relativamente alta pKa di 7.5 10. In condizioni acide, la molecola è protonata e produce un segnale di emissione di 560 a 600 nm quando viene eccitato a 488 nm o superiore. Quando la molecola è deprotonato in condizioni più alcalini, la lunghezza d&#39;onda di emissione è superiore a 600 nm. Un rapporto delle intensità di fluorescenza a queste due lunghezze d&#39;onda indica lo spostamento di emissione, che è più affidabile rispetto sia singole misure di fluorescenza, come è influenzato dalla concentrazione fluoroforo e struttura cellulare. S-1 può essere coniugato a materiale antigenico, come zymosan 14, anche se ucciso al calore (HK) Candida albicans è preferito, come la superficie maggiore dà una lettura di fluorescenza più coerente. Abbiamo usato anche una variante di questo metodo per studiare variazioni temporali di pH (Figura 3) 5. Questo metodo per la misura del pH citosolico può essere facilmente applicato ad altri tipi di cellule, come descritto altrove 15, 16, e cellule con fagosomi più alcalini 14.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt; ATCC 10231 Vitroids&amp;nbsp; 80 CFU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RQC14003-10EA</td><td>Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>YPD broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1375</td><td>Follow manufacturer&#039;s instructions, various providers exist</td></tr><tr><td>Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000</td><td>MP Biomedicals</td><td>2101514</td><td>Use gloves&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000 IU/mL&amp;nbsp;</td><td>Fannin, Wockhardt UK Ltd</td><td>FP1077</td><td>We purchased from UCH inpatient pharmacy</td></tr><tr><td>SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester - Special Packaging</td><td>Thermo Scientific/Invitrogen</td><td>SS22801</td><td>Use gloves</td></tr><tr><td>5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate</td><td>Thermo Scientific/Invitrogen</td><td>C1272</td><td>Use gloves</td></tr><tr><td>Vivaglobin human IgG&amp;nbsp; 160 mg/mL solution</td><td>CSL Behring</td><td>received as a gift</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Normal mouse serum</td><td>Abcam</td><td>ab7486</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Lymphoprep (density gradient medium)</td><td>Alere Ltd</td><td>1114547</td><td>Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143</td><td>Toxic, use gloves, various providers exist</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>Toxic, use gloves, various providers exist</td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Toxic, use gloves, various providers exist</td></tr><tr><td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503&amp;nbsp;</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Magnesium sulphate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Absolute Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2860</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Diphenylene iodonium (DPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2926</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Zinc chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td>Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate</td></tr><tr><td>Poly L lysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>The microscope must be able to excite at 555 nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600 nm, &gt;610 nm)</td></tr><tr><td>Ibidi &amp;micro; slide 8 well ibiTreat</td><td>Thistle Scientific</td><td>IB-80826</td><td>Other appropriate imaging dishes can be substituted</td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>Any appropriate sonicator will suffice</td></tr><tr><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td>BioRad</td><td></td><td>Various providers exist</td></tr><tr><td>1.5 mL Protein LoBind Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505-100EA</td><td>Specially used as &lt;em&gt;Candida&lt;/em&gt; can stick to normal eppendorfs</td></tr></tbody></table>

imaging the neutrophil phagosome and cytoplasm using a ratiometric ph indicator

I neutrofili sono cruciali per ospitare la difesa innata e, di conseguenza, costituiscono un importante settore della ricerca medica. Phagosome, compartimento intracellulare dove l&#39;uccisione e digestione delle particelle inghiottito avvengono, è l&#39;arena principale per neutrofili patogeno uccisione che richiede stretta regolazione. Phagosomal pH è un aspetto che è attentamente controllata, a sua volta regolare l&#39;attività della proteasi antimicrobica. Molti coloranti pH-sensibile fluorescenti sono stati utilizzati per visualizzare l&#39;ambiente phagosomal. S-1 ha diversi vantaggi rispetto ad altri coloranti pH-sensibile, compreso il suo spettro di emissione duplice, la sua resistenza a foto-candeggio, e la sua elevata pKa. Usando questo metodo, abbiamo dimostrato che phagosome neutrofili è insolitamente alcalino rispetto ad altri fagociti. Utilizzando differenti coniugazioni biochimici del colorante, phagosome può essere delineata dal citoplasma in modo che i cambiamenti nelle dimensioni e la forma del phagosome possono essere valutati. Questo permette di fo ulteriore monitoraggio del movimento ionico.

Figura 1 presenta istantanee di neutrofili di diverse origini di dimostrare ambienti phagosomal variabili. Per facilitare l&#39;analisi quantitativa, è importante dare dei pozzetti con un numero appropriato di cellule: troppi causerà le cellule a strato sopra l&#39;altro, il che rende difficile visualizzare fagosomi allegate precisione; troppo pochi volontà, naturalmente, fornire un minor numero di risultati, in particolare per quanto non tutti i neutrofili si fagocitare. La figura 2 è un&#39;immagine che è eccessivamente saturo; questo può essere valutata suddividendo l&#39;immagine tra i due canali (utilizzando il software microscopio raccomandato nel Materials List o equivalente) - puntini rossi indicano quale sia stata rilevata la fluorescenza massima. Questo può essere contrastata riducendo l&#39;intensità del laser. Le curve di calibrazione utilizzando i vari sistemi tampone sono mostrati in figura 3, adattato da Levine et al. 5 &lt;/ Sup&gt;. Le barre di errore indicano che v&#39;è qualche variazione nella fluorescenza tra le letture. La Figura 4 mostra un esempio di come i dati per phagosomal pH e zona potrebbero essere presentate. Questo approccio permette ad ogni singola misura da visualizzare con un diagramma a scatola over-posa. Tuttavia, i dati possono essere visualizzati in un istogramma istogramma. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig1.jpg" /> Figura 1: immagini istantanee appropriate di neutrofili da esseri umani e topi. All&#39;estrema destra è una chiave visiva qualitativa del colore approssimativa dei fagosomi S-1-colorati corrispondenti al pH. Il colore giallo indica più acidità, mentre il rosso indica più alcalinità. (A) mostra Hvcn1 - / - topo osso neutrofili midollo 20 minuti dopo la fagocitosi. I fagosomi appaiono molto rosso, alcalina, e gonfio. La freccia rossa nella parte in basso a destra dellaimmagine indica un Candida intracellulare, mentre la freccia nel sinistra sopra ad una particella extracellulare. (B) mostra neutrofili midollo osseo di topo di tipo selvatico che hanno ingerito Candida; sono molto meno alcalini di Hvcn1 - / - cellule. (C) mostra neutrofili del sangue periferico umano nello stesso punto dopo fagocitosi. Essi appaiono leggermente più alcalino rispetto alle cellule di tipo selvatico del mouse, ma i fagosomi non sono ancora così grande e rossa come il Hcvn1 - / - cellule. (D) mostra neutrofili umani che sono fagocitati Candida in presenza di 5 mM difenilen iodonio (DPI). Tutti i fagosomi sono molto acida, con un pH di 6 o meno; Il farmaco inibisce l&#39;ossidasi NADPH, quindi non c&#39;è alcun movimento di ioni di compensazione. I protoni rilasciati dai granuli acide che fondono al phagosome causare il pH acido 20, e l&#39;incremento delle assunzioni della V-ATPasi di the phagosomal membrana in seguito a trattamento con DPI 9. Il citoplasma appare anche più alcalino rispetto alle cellule delle altre condizioni. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig2.jpg" /> Figura 2: Over-saturazione di Hvcn1 - / - topo neutrofili midollo osseo. È importante escludere dalle immagini di analisi in cui i dati di fluorescenza sono troppo saturi. Come descritto nella sezione 5.3, l&#39;immagine composita è divisa in due immagini (in alto a sinistra, freccia rossa) con entrambi i canali presentati singolarmente. In questo software, indicatore intervallo è selezionata (in basso a sinistra, freccia rossa), quindi tutti i pixel che sono troppo saturi sono rosso brillante. C&#39;è sovrasaturazione presente in entrambi i canali (1 e 2). A magnificazione di alcune cellule ed extracellulare Candida è mostrato in basso a destra, con frecce rivolte alle aree colpite. Analizzando questi punti porterebbe ad una misurazione falsa raziometrico. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig3.jpg" /> Figura 3: curve di calibrazione standard per la conversione di S-1 rapporti di fluorescenza a misurazioni del pH. Le curve standard per Candida solo nei diversi tamponi (etichettati come &quot;Tris&quot;) e quando le cellule vengono permeabilizzate con saponina ( &quot;saponina&quot;) sono molto simili, dimostrando che l&#39;S-1 lettura all&#39;interno e all&#39;esterno della cellula (phagosome ed extracellulare medio) sono paragonabili. Le barre di errore rappresentano la media ± SD. La curva S-1 ratio / pH viene accorciata quando testati in citoplasma ( &quot;citoplasma&quot;), che dovrebbe essere presa in considerazione nella analisi di immagini. Questo dato è stato modificato da Levine et al. 5. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55107/55107fig4.jpg" /> Figura 4: Quantificazione di phagosomal pH e zona. Questa figura presenta un esempio di presentazione dei dati. I grafici sono stati generati utilizzando il software di programmazione R. A: mostra rapporto phagosomal e pH corrispondente per A (Hvcn1 - / - topo neutrofili midollo osseo), B: tipo selvatico osseo di topo neutrofili midollo, C: neutrofili del sangue periferico umano, e D: umana neutrofili con 5 uM DPI n = 3/300. singole misurazioni sono mostrati come quadratini, con una sovrapposizione boxplot con mediuna e intervallo interquartile. Una barra rossa rappresenta la media. Come si vede nelle immagini in Figura 1, Hvcn1 - / - cellule hanno fagosomi molto alcalino rispetto al topo di tipo selvatico e neutrofili umani. Hanno anche un&#39;area maggiore phagosomal (Figura 4B, n = 3/300). fagosomi neutrofili umani sono leggermente più alcalino e più grande di neutrofili tipo selvatico topo, mentre i neutrofili umani incubati con DPI sono fagosomi molto acide e piccoli. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55107/55107fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table><tbody><tr><td colspan="4"> Soluzione salina bilanciata (BSS) tampone </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 156 mm </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> 3 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 2 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1,25 mm </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 2 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> 10 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 10 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> pH 7,4 con NaOH o HCl </td></tr><tr><td colspan="4"> brodo YPD </td></tr><tr><td> brodo YPD </td><td> 50 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td> 1 L </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Autoclave a 121 ° C per 15 min </td></tr><tr><td colspan="4"> Per YPD agar: prima autoclave aggiungere 15 g / L di agar </td></tr><tr><td colspan="4"> 10% soluzione di destrano </td></tr><tr><td> grado clinico Destrano </td><td></td><td> 50 g </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td> &lt;td&gt; </td><td> 4,5 g </td><td></td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td></td><td> 500 mL </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Aggiungere alla bottiglia di vetro e autoclave a 121 ° C per 15 min </td></tr><tr><td colspan="4"> Soluzione 2x Saline </td></tr><tr><td> NaCl </td><td></td><td> 18 g </td><td></td></tr><tr><td> Acqua distillata </td><td></td><td> 1 L </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Aggiungere alla bottiglia di vetro e autoclave a 121 ° C per 15 min </td></tr><tr><td colspan="4"> 10% saponina magazzino </td></tr><tr><td> tampone BSS </td><td></td><td> 50 mL </td><td></td></tr><tr><td> saponina </td><td></td><td> 5 g </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Il calore del buffer BSS a 37 ° C, aggiungere saponina e mescolare. </td></tr><tr><td colspan="4"> Aggiungere 0,1% di sodio azide come conservante, miscela conservare a 4 ° C. </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td colspan="4"> tamponi di calibrazione </td></tr><tr><td colspan="4"> Candida curva standard </td></tr><tr><td colspan="4"> Primo compongono 0,15 m stock di ogni buffer </td></tr><tr><td colspan="4"> Make up 0,15 soluzione M di NaCl </td></tr><tr><td colspan="4"> 15 ml di volume finale: 5 mL 0,15 M di soluzione tampone + 10 mL di soluzione 0,15 M di NaCl </td></tr><tr><td> pH 3 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM glicina </td><td></td></tr><tr><td> pH 4 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM acetato </td><td></td></tr><tr><td> pH 5 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM acetato </td><td></td></tr><tr><td> pH 6 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM acetato </td><td></td></tr><tr><td> pH 7 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Tris </td><td></td></tr><tr><td> pH 8 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Tris </td><td></td></tr><tr><td> pH 9 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM Tris </td><td></td></tr><tr><td> pH 10 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM glicina </td><td></td></tr><tr><td> pH 11 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM fosfato </td><td></td></tr><tr><td> pH 12 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM fosfato </td><td></td></tr><tr><td> pH 13 </td><td> 100 mM NaCl </td><td> 50 mM fosfato </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Citosolico curva standard </td></tr><tr><td colspan="4"> Utilizzare precedentemente reso 0,15 M soluzioni tampone stock </td></tr><tr><td colspan="4"> Make up 0,15 soluzione M KCl </td></tr><tr><td colspan="4"> 15 ml di volume finale: 5 mL di tampone 0,15 M soluzione + 10 mL di 0,15 M KCl desiderato </td></tr><tr><td colspan="4"> 10 mM di nigericin in etanolo, aggiungere 15 microlitri di ogni soluzione volume finale </td></tr><tr><td> pH 3 </td><td> 100 mM KCl </td&gt; <td> 50 mM glicina </td><td> 10 micron Nigericina </td></tr><tr><td> pH 4 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM acetato </td><td> 10 micron Nigericina </td></tr><tr><td> pH 5 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM acetato </td><td> 10 micron Nigericina </td></tr><tr><td> pH 6 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM acetato </td><td> 10 micron Nigericina </td></tr><tr><td> pH 7 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Tris </td><td> 10 micron Nigericina </td></tr><tr><td> pH 8 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Tris </td><td> 10 micron Nigericina </td></tr><tr><td> pH 9 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM Tris </td><td> 10 micron Nigericina </td></tr><tr><td> pH 10 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM glicina </td><td> 10 micron Nigericina </td></tr><tr><td> pH 11 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM fosfato </td><td> 10 micron Nigericina </td></tr><tr><td> pH 12 </td&gt; <td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM fosfato </td><td> 10 micron Nigericina </td></tr><tr><td> pH 13 </td><td> 100 mM KCl </td><td> 50 mM fosfato </td><td> 10 micron Nigericina </td></tr><tr><td colspan="4"> pH tutte le soluzioni di taratura sia con HCl o NaOH </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Composizione di buffer. Questa tabella descrive composizioni appropriate dei diversi buffer utilizzati nel protocollo. File di codice supplementare. Questo file contiene una serie di macro, scritto da AP Levine, che sono necessari per l&#39;analisi delle immagini. Gli autori sarebbero felici di cercare di affrontare qualsiasi domanda associati all&#39;uso di questo codice. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/55107/Phagosomal_measurement.txt" target="_blank">Cliccate qui per scaricare questo file.</a>

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Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare il pH phagosomal e zona così come il pH citoplasmatico di neutrofili umani e di topo usando l&#39;indicatore raziometrico seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Ciò si ottiene mediante live-cell microscopia confocale a fluorescenza e analisi di immagine.

Imaging dei neutrofili phagosome e nel citoplasma utilizzo di un indicatore di pH Raziometrico

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.0K Views.  University College London.  Questo manoscritto descrive un metodo semplice per misurare il pH phagosomal e zona così come il pH citoplasmatico di neutrofili umani e di topo usando l'indicatore raziometrico seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Ciò si ottiene mediante live-cell microscopia confocale a fluorescenza e analisi di immagine. 

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Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

The development of fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically encoded and synthetic fluorophores with sensing abilities allowed the visualization of biologically relevant species with high spatial and temporal resolution. Synthetic dyes are of particular interest thanks to their high tunability and the wide range of measureable analytes. However, these molecules suffer several limitations related to small molecule behavior (poor solubility, difficulties in targeting, often no ratiometric imaging allowed). In this work we introduce the development of dendrimer-based sensors and present a procedure for pH measurement in vitro, in living cells and in vivo. We choose dendrimers as ideal platform for our sensors for their many desirable properties (monodispersity, tunable properties, multivalency) that made them a widely used scaffold for several biomedical devices. The conjugation of fluorescent pH indicators to the dendrimer scaffold led to an enhancement of their sensing performances. In particular dendrimers exhibit reduced cell leakage, improved intracellular targeting and allow ratiometric measurements. These novel sensors were successfully employed to measure pH in living HeLa cells and in vivo in mouse brain.

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Fluorescence sensors are powerful tools in life science. Here we describe a methodology to synthesize and use dendrimer-based fluorescent sensors to measure pH in living cells and in vivo. The dendritic scaffold enhances the properties of conjugated fluorescent dyes leading to improved sensing properties.

Sintesi, Consegna Cellulare e<em&gt; In vivo</em&gt; Applicazione di sensori di pH basati Dendrimero

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

Ricerca

Chimica

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

Osservazione diretta di fagocitosi e NET-formazione da parte dei neutrofili nei polmoni infetti utilizzando 2-fotoni Microscopia

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

Immunologia e infezioni

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Alta Tecnica Throughput fluorometrica per la valutazione dei macrofagi fagocitosi e polimerizzazione

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites are not distributed evenly in dental biofilms. A complex interplay of sorption to and reaction with organic matter in the biofilm reduces the diffusion paths of solutes and creates steep gradients of reactive molecules, including organic acids, across the biofilm. Quantitative fluorescent microscopic methods, such as fluorescence life time imaging or pH ratiometry, can be employed to visualize pH in different microenvironments of dental biofilms. pH ratiometry exploits a pH-dependent shift in the fluorescent emission of pH-sensitive dyes. Calculation of the emission ratio at two different wavelengths allows determining local pH in microscopic images, irrespective of the concentration of the dye. Contrary to microelectrodes the technique allows monitoring both vertical and horizontal pH gradients in real-time without mechanically disturbing the biofilm. However, care must be taken to differentiate accurately between extra- and intracellular compartments of the biofilm. Here, the ratiometric dye, seminaphthorhodafluor-4F 5-(and-6) carboxylic acid (C-SNARF-4) is employed to monitor extracellular pH in in vivo grown dental biofilms of unknown species composition. Upon exposure to glucose the dye is up-concentrated inside all bacterial cells in the biofilms; it is thus used both as a universal bacterial stain and as a marker of extracellular pH. After confocal microscopic image acquisition, the bacterial biomass is removed from all pictures using digital image analysis software, which permits to exclusively calculate extracellular pH. pH ratiometry with the ratiometric dye is well-suited to study extracellular pH in thin biofilms of up to 75 &#181;m thickness, but is limited to the pH range between 4.5 and 7.0.

A pH-sensitive ratiometric dye is used in combination with confocal laser scanning microscopy and digital image analysis to monitor extracellular pH in dental biofilms in real-time.

Imaging Raziometrico del pH extracellulare nel dentale biofilm

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

Measuring the pH, Redox Chemistries, and Degradative Capacity of Macropinosomes using Dual-Fluorophore Ratiometric Microscopy

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells maintain organismal homeostasis and immunity. Simultaneously, and in contrast to its homeostatic role, it can also drive various pathologies, including cancer and viral infections. Unlike other modes of endocytosis, the tools developed for studying the maturation of macropinosomes remain underdeveloped. Here the protocol describes newly developed tools for studying the redox environment within the lumen of early and maturing macropinosomes. Methodologies for using ratiometric fluorescence microscopy in assessing the pH, production of reactive oxygen species, and the degradative capacity within the lumen of individual macropinosomes in live cells are described. Single organelle measurements offer the advantage of revealing spatiotemporal heterogeneity, which is often lost with population-based approaches. Emphasis is placed on the basic principles of dual fluorophore ratiometric microscopy, including probe selection, instrumentation, calibration, and single-cell versus population-based methods.

We describe protocols for measuring pH, oxidative events, and protein digestion in individual macropinosomes in live cells. An emphasis is placed on dual-fluorophore ratiometric microscopy and the advantages it offers over population-based techniques.

Misurazione del pH, delle sostanze chimiche redox e della capacità degradativa dei macropinosomi utilizzando la microscopia a doppio fluoroforo

In recent years, the field of macropinocytosis has grown rapidly. Macropinocytosis has emerged as a central mechanism by which innate immune cells ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Biologia

In vitro Quantitative Imaging Assay for Phagocytosis of Dead Neuroblastoma Cells by iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. Microglia clear up dead and dying neurons through the process of efferocytosis, a specialized form of phagocytosis. The phagocytosis function can be disrupted by environmental or genetic risk factors that affect microglia. This paper presents a rapid and simple in vitro&#160;microscopy protocol for studying microglial efferocytosis in an induced pluripotent stem cell (iPSC) model of microglia, using a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) labeled with a pH-sensitive dye for the phagocytic cargo. The procedure results in a high yield of dead neuroblastoma cells, which display surface phosphatidylserine, recognized as an &#34;eat-me&#34; signal by phagocytes. The 96-well plate assay is suitable for live-cell time-lapse imaging, or the plate can be successfully fixed prior to further processing and quantified by high-content microscopy. Fixed-cell high-content microscopy enables the assay to be scaled up for screening of small molecule inhibitors or assessing the phagocytic function of genetic variant iPSC lines. While this assay was developed to study phagocytosis of whole dead neuroblastoma cells by iPSC-macrophages, the assay can be easily adapted for other cargoes relevant to neurodegenerative diseases, such as synaptosomes and myelin, and other phagocytic cell types.

Neurodegenerative diseases are associated with dysregulated microglia functions. This article outlines an in vitro assay of phagocytosis of neuroblastoma cells by iPSC-macrophages. Quantitative microscopy readouts are described for both live-cell time-lapse imaging and fixed-cell high-content imaging.

Test di imaging quantitativo in vitro per la fagocitosi delle cellule morte del neuroblastoma da parte di iPSC-Macrophages

Microglia orchestrate neuroimmune responses in several neurodegenerative diseases, including Parkinson&#39;s disease and Alzheimer&#39;s disease. ...

Neuroscienze

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

Ottica pH quantificazione di intracellulare in Drosophila melanogaster anatomista Epithelia con pH indicatore fluorescente geneticamente codificato

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...