We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

1. Preparazione di larve <ol><li> Una settimana prima di registrare il comportamento, impostare una croce (minimo di 25 vergini e 5 maschi). Mantenere tutte le croci e progenie a 25 ° C. NOTA: La temperatura di condizioni di coltura può essere modificata, ma la linea di tempo indicato di seguito dovrebbe essere aggiustato per tenere conto di cambiamenti di velocità di sviluppo. </li><li> 5 giorni prima della registrazione, prima cosa al mattino, mettere la croce in una gabbia di raccolta con un tappo di agar / succo di frutta e una piccola quantità (0,5-1 ml) di pasta di lievito, nel centro del tappo agar / succo di frutta. <ol><li> Per fare una gabbia di raccolta, colpire i fori in un 6 once polietilene piazza bottiglia Drosophila. </li><li> Per rendere tappi agar / succo, mescolare 18 g di agar con acqua 600 ml in pallone conico. In un separato mix pallone 20 g di saccarosio con 200 ml di succo di mela. Forno a microonde fino a quando i solidi si sciolgono. Unire e mescolare, permettendo miscela raffreddare a 60 ° C. Aggiungere 20 ml di 10% di metil-p-idrossibenzoato in 95% di etanolo, e mescolare. Aggiungere ~ 7ml alla metà inferiore di un 35 x 10 mm rotondo Petri. Lasciare agar / succo solidificare per 1 ora a RT. Conservare a 4 ° C. </li><li> Per fare pasta di lievito, aggiungere parti uguali da lievito secco volume e acqua. Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Controllare la salute delle collezioni larvali. <ol><li> Al mattino, 4 e 3 giorni prima della registrazione, rimuovere il tappo e inserire un tappo fresco sulla gabbia. Cambiare i tappi, allo stesso tempo ogni giorno per ottenere una raccolta 24 ore di uova e larve appena schiusi. </li><li> Dopo ogni tappo viene rimosso, esaminarlo per vedere quante uova la croce sta ponendo. Aspettatevi tra 500-2000 uova. Regolare il numero di adulti, se necessario. NOTA: un paio di uova si sono schiuse dovrebbero in larve, e le larve appena schiusi saranno trovato lontano dalla pasta di lievito. </li><li> Età ogni tappo per 24 ore. Riesaminare il tappo per determinare se le larve sono sani. NOTA: La maggior parte delle uova dovrebbero sono nati in larve, e le larve avrebbero dovuto strisciato in voipasta ast. I segni di cattiva salute includono un gran numero di uova non schiuse, corpi larvali morti lontano dalla pasta di lievito, e le larve con notevoli macchie scure in addome, che indica una reazione immunitaria. Se larve sono malsano, cambiare la gabbia, fare tappi freschi / pasta di lievito, e verificare il genotipo. </li><li> Eliminare i vecchi tappi. </li></ol></li><li> Raccogliere le larve per le registrazioni del comportamento. <ol><li> Sia a 2 e 1 giorno prima della registrazione, togliere il tappo e sostituire con un tappo fresca. </li><li> Etichettare ogni tappo rimosso e mantenere a 25 ° C. Ciò produrrà una serie messa in scena di larve per le registrazioni del comportamento. Larve da appena tratteggiata (0-4 hr posthatch) attraverso la seconda instar (24-48 posthatch) può essere utilizzato nei canali. Salva tappi per le registrazioni in giorni consecutivi. </li><li> Eliminare tutte le protezioni dopo 48 ore. </li><li> Se necessario, ripetere i passaggi 1.4.1-1.4.3 per un massimo di 5 ulteriore d. Dopo che meno uova fecondate vengono prodotte. </li></ol></li></ol><ol><li> Preparare il PDMS canali lineari (Polidimetilsilossano, un elastomero siliconico) colata stampo (Figura 1A). PDMS colata stampi sono disponibili presso il laboratorio di Heckscher su richiesta. <ol><li> Pulire lo stampo fusione con alcool isopropilico. aria secca, DAB secco con salviette di laboratorio, o utilizzare aria compressa. </li><li> Mettere lo stampo fusione in un 10 centimetri Petri coperchio o altro contenitore. </li></ol></li><li> Preparare e versare la soluzione di agarosio. <ol><li> Effettuare una soluzione al 3% di agarosio in acqua (3 g in 100 ml) per microonde fino a completo scioglimento. </li><li> Raffreddare a 55 ° C, permettendo bolle di salire alla superficie. </li><li> Versare il composto agarosio nella capsula di Petri contenente lo stampo di colata in modo tale che lo stampo sia appena coperto. Lasciate set agarosio fino solidificato. </li></ol></li><li> Rimuovere i canali agarosio dallo stampo di fusione. Tagliare i bordi del disco agarosio con una lama di rasoio. <ol><li> Mettere il canales in una capsula di Petri 10 centimetri immerso in acqua. Essi possono essere conservati a 4 ° C per 7 giorni. </li></ol></li></ol> 3. Caricamento di una larva in un canale da registrare il comportamento NOTA: Se la memorizzazione dei canali a 4 ° C, permettono canali di venire a RT prima di utilizzare per la registrazione del comportamento. <ol><li> Utilizzare una lama di rasoio pulito per tagliare un singolo canale da quelli preparata nella fase 2 (Figura 2A). </li><li> Utilizzare un paio di pinze per posizionare il canale scanalato-side-up su un vetrino di vetro (Figura 2B). La dimensione e lo spessore del vetrino dipende dalla portata specifica utilizzata per l&#39;imaging. </li><li> Utilizzare una pinza sottile per selezionare una larva dal tappo agar / succo preparata nella fase 1 e posizionare nel canale di taglio (Figura 2C). <ol><li> Non spremere la larva. Raccoglierlo delicatamente con la punta della pinza denti. È anche possibile manipolare larva con un pennello con una punta fine. NOTA: Questo è importante in quanto le larve sono molto sensitive al tatto. Se non sono maneggiati con cura, le risposte nocicettive potrebbero dominare il loro comportamento durante i primi secondi di questo esperimento. </li><li> Lavare le larve da loro immergendo brevemente in acqua. </li><li> Dopo aver posizionato la larva sul canale di taglio, utilizzare la punta della pinza denti a stuzzicare delicatamente la larva nel boschetto canale. NOTA: Per la maggior parte delle applicazioni la larghezza della larva e la larghezza del canale devono corrispondere. La larghezza media di larve a diversi stadi di sviluppo segue: 0 HR posthatch - 140 micron, 24 ore posthatch - 180 micron, 48 hr posthatch - 320 micron, 72 hr posthatch - 500 micron, 96 hr posthatch - 750 micron 8. I canali sono disponibili nelle seguenti larghezze: 100, 150, 200, 250 e 300 micron, e tutti i canali sono 150 micron di profondità. </li><li> Utilizzare la punta di un dente pinze o pennello per regolare la posizione della larva all&#39;interno del canale. Esso può essere orientato in qualsiasi direzione: ventraleup, ventrale giù, ventrale da un lato, a seconda di quale struttura è da acquisire. </li></ol></li><li> Utilizzando pinze, capovolgere delicatamente il canale sopra in modo che la larva è ora sul vetro di copertura. Inserire una o due gocce d&#39;acqua alle estremità del canale in modo da riempire con acqua (Figura 2D). <ol><li> Sollevare delicatamente ai lati del canale per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Regolare l&#39;orientamento della larva. Per farlo, spingere delicatamente il canale, ma non il vetro di copertura a rotolare la larva. Se questo non cambia l&#39;orientamento, rimuovere il vetro di copertura e regolare la posizione larvale. La larva è pronta per essere ripreso. </li><li> Immagine del canale / vetrino su un microscopio invertito. Se l&#39;imaging su un microscopio in posizione verticale, è sufficiente invertire il canale / vetrino. </li></ol></li></ol> 4. Caratteristica Misura di interesse in registrazione Behavioral <ol><li> Per una struttura di interesse (ad esempio, la coda, CNS), misurare una caratteristica di interesse (ad esempio,, Intensità di fluorescenza, posizione) nel tempo. NOTA: Strutture come la testa e la coda possono essere annotate a mano. Ad esempio, la testa può essere identificato come contenente bocca ganci a forma di H scuri e la coda può essere identificato come contenente spiricles tracheali posteriori. Questo documento si concentra sul cordone nervoso. Utilizzare la linea neuronale GAL4 ELAV-GAL4 di guidare un transgene UAS-MYR-GFP (ELAV&gt; GFP) 9,10 per etichettare fluorescente del sistema nervoso centrale (SNC). La CNS contiene due lobi cerebrali anteriori collegati al cordone nervoso, che si estende al posteriore (figura 3). </li><li> Misurare l&#39;intensità dei pixel del cordone nervoso (f (NC)) in ciascun punto di tempo (t). Qui di seguito descrive un approccio di annotazione manuale, ma questo passo potrebbe essere automatizzato. <ol><li> Nelle Figi (o software simile) nel menu &#39;Analizza&#39; utilizzare i &quot;Set Misure ...&quot; finestra di dialogo per segnalare il valore di grigio medio e SLICe la posizione. </li><li> Disegnare manualmente una scatola nel centro del cordone nervoso nel primo fotogramma del filmato (Figura 3). Questo passo potrebbe anche essere automatizzato con algoritmi immagine segmentazione e registrazione. </li><li> Utilizzare il comando &quot;Misura&quot; nel menu &#39;Analizza&#39; a riferire l&#39;intensità media dei pixel nella regione scatola di interesse. Ciò genera una finestra &quot;Risultati&quot;. </li><li> Nel fotogramma successivo, riposizionare manualmente la scatola senza ridimensionamento utilizzando i tasti freccia. Utilizzare nuovamente il comando &quot;Misura&quot;. I risultati aggiornati verranno visualizzati nella finestra &quot;Risultati&quot;. Ripetere questo passaggio per ogni fotogramma di interesse. </li><li> Salvare i &quot;Risultati&quot; che utilizzano il &#39;Salva con nome ...&#39; comando dal menu File. I risultati saranno esportati come file .xls. </li></ol></li></ol> 5. Analizzare i Misure <ol><li> Normalizza ogni f (NC) valore a un valore compreso tra 0 e 1 (z (t) &lt;/ Em&gt;). <ol><li> Nel foglio di calcolo (o un altro programma), aprire il file Results.xls. Questo file avrà due colonne che rappresentano il numero di fotogramma e l&#39;intensità media di fluorescenza. </li><li> Fare una nuova colonna e utilizzare la formula z (t) = f (NC [t]) -min (f [NC]) / max (f [NC]) -min (f [NC]) per generare un valore di fluorescenza normalizzato corrispondente a ciascun punto di tempo. </li></ol></li><li> Determinare il periodo di passo per ogni passo nella registrazione. NOTA: Un ciclo passo è l&#39;unità di ripetitivo movimento di tutto il corpo per la marcia avanti (e indietro) scansione. Per convenzione un passo in avanti inizia (e finisce) con il movimento in avanti della coda, la testa, e di altri organi interni come l&#39;intestino o il sistema nervoso centrale 1. <ol><li> Controllare manualmente la registrazione comportamentale e registrare i tempi di iniziazione (i) di ogni passo (i (STRIDE ciclo [n])). NOTA: Nell&#39;esempio riportato di seguito, il movimento in avantidel SNC come l&#39;avvio di un ciclo passo è stato usato (figura 3). </li><li> Per ogni passo calcolare il periodo: Δ t (ciclo del passo) = I (Stride ciclo [n + 1]) -i (Stride ciclo [n]). </li></ol></li><li> Calcolare la percentuale del ciclo di passo trascorso per ogni punto di tempo della registrazione. <ol><li> Effettuare una colonna aggiuntiva nel foglio di calcolo rappresenta il tempo trascorso dall&#39;inizio di un ciclo passo (c). Impostare il tempo dal momento che l&#39;inizio del passo a zero l&#39;avvio di ogni passo (c (Stride ciclo [n]) = 0). Regolare volte dopo l&#39;inizio di conseguenza. </li><li> Fare una colonna aggiuntiva nel file di foglio di calcolo che rappresenta ciclo per cento del passo trascorso (ciclo del passo%) Dividere volte modificate entro periodo falcata e moltiplicare per 100 per convertire in percentuale del ciclo del passo trascorso:. Ciclo% stride = (c (Stride ciclo [n] )) / (Δ t (Ciclo Stride) * 100). </li></ol></li></ol> 6. Generare coordinate polari piazzole rappresentare le dinamiche di strutture di interesse nel corso del ciclo di scansione <ol><li> In MATLAB, usare il dialogo il &#39;Importa dati&#39; nella scheda Home per importare il Results.xls aggiornato. </li><li> Fare un nuovo array &quot;Theta&quot; valori del ciclo passo contenente percentuale (% del ciclo del passo). ( &quot;Theta = Var1&quot; dove Var1 rappresenta% del ciclo del passo). </li><li> Fare un nuovo array &quot;Rho&quot; contiene valori di fluorescenza normalizzati (z (t)). ( &quot;Rho = Var2&quot; dove Var2 rappresenta z (t)). </li><li> Utilizzare il comando &#39;polarplot&#39; per fare in coordinate polari trame con il ciclo per cento del passo come l&#39;angolo, e la fluorescenza come il raggio ( &quot;polarplot (Theta, Rho)&quot;). </li></ol>

<ol>
	<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation.">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).</li><li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+swimming+behavior:+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems.">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li><li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila.">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped(+)+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude.">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li><li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae.">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li><li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rover/Sitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development,+Food-Patch+Quality,+and+Starvation.">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+/+MAPK+Pathway.">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The visual display of quantitative information. , (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Un dispositivo di microfluidica è stato costruito per rendere i canali di agarosio lineari che possono ospitare larve di Drosophila (Figura 1). Quando Drosophila larve sono collocati in questi canali agarosio lineari loro repertorio comportamentale è limitato a scansione, che consente l&#39;osservazione dettagliata della dinamica di strutture larvali durante il ciclo di scansione. Una registrazione riuscita si verifica quando una larva eseguire una serie ...

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di studiare Drosophila scansione larvale in dettaglio. Esperimenti su locomozione hanno giocato un ruolo importante nello sviluppare e testare le teorie sul controllo motore 2. Tradizionalmente locomozione è stata studiata in animali acquatici (ad esempio, sanguisuga, lampreda, girino) 3. La natura ripetitiva di locomozione in questi animali ha consentito per lo studio di rhythmogenesis, per l&#39;analisi degli eventi biofisici locomozione di guida, e per monitorare i modelli di cottura neurali che accompagnano locomozione. L&#39;uso di Drosophila larve per studi di locomozione presenta una combinazione unica di vantaggi rispetto ad altri sistemi modello: genetica facili, sviluppo ben caratterizzato, un corpo che è otticamente chiaro primi e secondi stadi, e un elettrone trasmissione permanente ricostruzione microscopica dell&#39;intero sistema nervoso 4-6. Tuttavia, Drosophila larvale locomovimento su superfici piane aperte è un po &#39;complesso che include le pause, si gira, e serpeggiante striscia 7. Questa pubblicazione presenta un metodo per utilizzare i canali di agarosio lineari per guidare Drosophila comportamento motorio larvale in modo tale che le larve perform sostenuto, dritto, il comportamento scansione ritmica. Studiando Drosophila comportamento larvale nei canali di agarosio, invece di comportamento su superfici piane aperte, ha diversi vantaggi. In primo luogo, permette ai ricercatori di selezionare specificamente strisciando comportamento dai molti movimenti che sono parte del repertorio comportamentale larvale. In secondo luogo, regolando la larghezza del canale rispetto alla dimensione del corpo larvale, velocità scansione può essere regolata. Terzo, canali consentono la larva per essere visto da dorsale, ventrale o laterale a seconda di come la larva viene caricato e orientato all&#39;interno del canale. Questa versatilità in orientamento larvale permette a qualsiasi struttura di interesse per essere costantemente visibile durante la scansione. Il quarto,canali sono suscettibili per l&#39;uso con un&#39;ampia varietà di microscopi e obiettivi. Ad esempio, canali lineari possono essere utilizzati per l&#39;imaging bassa risoluzione sulla stereoscopes campo chiaro e / o per l&#39;imaging ad alta risoluzione sulla filatura-disco microscopio confocale 1. Quinto, questo metodo può essere usato in combinazione con optogenetic / thermogenetic manipolazioni neuronali in qualsiasi sfondo genetico. Infine, perché sia ​​il corpo larvale (in prima e seconda stadi) e canali di agarosio sono otticamente trasparente, canali possono essere utilizzati quando si studiano i movimenti dinamici, o cambiamenti di intensità fluorescente delle strutture larvali etichettati da sonde fluorescenti geneticamente codificati. Il metodo descritto è adatto per gli studi cinematici dettagliati di primo e secondo instar Drosophila comportamento larvale. Questa pubblicazione analizza i cambiamenti dinamici di intensità fluorescente del sistema nervoso centrale durante la scansione larvale in avanti per dimostrare l&#39;utilizzo di canali e come un precursore di NeuCalcio Imaging Ronal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="643">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">6 oz square Drosophila bottle</td>
			<td style="width:101px;">Scimart</td>
			<td style="width:119px;">DR-103</td>
			<td style="width:212px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agar</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">sucrose</td>
			<td style="width:101px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">apple juice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>not from concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Tegosept</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>T2300</td>
			<td>methyl-p-hydroxybenzoate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">35 x 10 mm round petri dish</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td align="right">351008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">baker&#39;s yeast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">PDMS casting mold</td>
			<td style="width:101px;">FlowJem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>can be requested from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A417-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">laboratory wipes</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">06-666-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">canned air</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">18-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">10 cm petri dish</td>
			<td style="width:101px;">BioPioneer</td>
			<td style="width:119px;">GS82-1473-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">agarose</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-444-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">razor blade</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">forceps</td>
			<td style="width:101px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11241-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">22 x 40 cover glass, #1.5</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">50-365-605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Fiji (version 1.51d)</td>
			<td style="width:101px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Excel 2016</td>
			<td style="width:101px;">Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>www.microsoftstore.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">MATLAB R2016</td>
			<td style="width:101px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.mathworks.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

Drosophila scansione larvale sta emergendo come un potente modello per studiare il controllo neurale del comportamento sensomotorio. Tuttavia, il comportamento scansione larvale su superfici piane aperte è complessa, tra cui: pausa, tornitura, e meandri. Questa complessità nel repertorio di movimento ostacola un&#39;analisi dettagliata degli eventi che si verificano nel corso di un singolo ciclo di scansione passo. Per superare questo ostacolo, i canali di agarosio lineari sono stati fatti che vincolano il comportamento larvale a diritto, sostenuta, scansione ritmica. In linea di principio, perché i canali di agarosio e il corpo larvale Drosophila sono sia otticamente trasparente, il movimento delle strutture larvali etichettati da sonde fluorescenti geneticamente codificati può essere monitorato in intatto, larve liberamente muoversi. In passato, le larve sono stati inseriti in scanalature lineari e strisciando a livello di tutto l&#39;organismo, segmento e muscoli sono stati analizzati 1. In futuro, larve strisciando nei canali può essere utilizzato per l&#39;imaging del calcio per il monitoraggio neurol&#39;attività finale. Inoltre, questi metodi possono essere utilizzati con larve di ogni genotipo e con qualsiasi canale ricercatore progettato. Così il protocollo presentato sotto è ampiamente applicabile per gli studi che utilizzano la larva di Drosophila come modello per capire il controllo del motore.

Questo articolo descrive un metodo per guidare comportamento larvale Drosophila utilizzando canali agarosio e per misurare la dinamica delle strutture larvali in un ciclo di scansione. Le larve di canali lineari eseguire attacchi sostenuti di scansione ritmica (Figura 3). Poiché sia ​​le larve e canali sono otticamente trasparenti, i canali possono essere utilizzati con esprimendo larve sonde fluorescenti espressi in qualsiasi struttura di interesse. Abbiam...

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Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

La larva di Drosophila è un sistema potente modello per studiare il controllo neurale del comportamento. Questa pubblicazione descrive l&#39;utilizzo di canali di agarosio lineari per suscitare attacchi sostenuti di scansione e metodi lineari per quantificare la dinamica di strutture larvali durante comportamento strisciare ripetitivo.

Utilizzando canali lineari Agarose per studiare<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larvale Crawling

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

7.3K Views.  University of Chicago.  La larva di Drosophila è un sistema potente modello per studiare il controllo neurale del comportamento. Questa pubblicazione descrive l'utilizzo di canali di agarosio lineari per suscitare attacchi sostenuti di scansione e metodi lineari per quantificare la dinamica di strutture larvali durante comportamento strisciare ripetitivo. 

Video: Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

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Neuroscienze

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the molecular mechanisms underlying class-specific dendrite morphogenesis1,2. To facilitate molecular analyses of class-specific da neuron development, it is vital to obtain these cells in a pure population. Although a range of different cell, and tissue-specific RNA isolation techniques exist for Drosophila cells, including magnetic bead based cell purification3,4, Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)5-8, and RNA binding protein based strategies9, none of these methods can be readily utilized for isolating single or multiple class-specific Drosophila da neurons with a high degree of spatial precision. Laser Capture Microdissection (LCM) has emerged as an extremely powerful tool that can be used to isolate specific cell types from tissue sections with a high degree of spatial resolution and accuracy. RNA obtained from isolated cells can then be used for analyses including qRT-PCR and microarray expression profiling within a given cell type10-16. To date, LCM has not been widely applied in the analysis of Drosophila tissues and cells17,18, including da neurons at the third instar larval stage of development. 
Here we present our optimized protocol for isolation of Drosophila da neurons using the infrared (IR) class of LCM. This method allows for the capture of single, class-specific or multiple da neurons with high specificity and spatial resolution. Age-matched third instar larvae expressing a UAS-mCD8::GFP19 transgene under the control of either the class IV da neuron specific ppk-GAL420 driver or the pan-da neuron specific 21-7-GAL421 driver were used for these experiments. RNA obtained from the isolated da neurons is of very high quality and can be directly used for downstream applications, including qRT-PCR or microarray analyses. Furthermore, this LCM protocol can be readily adapted to capture other Drosophila cell types a various stages of development dependent upon the cell type specific, GAL4-driven expression pattern of GFP.

Laser Capture Microdissection of Drosophila Peripheral Neurons

In this video-article we present a method for isolating single or multiple Drosophila da neurons from third instar larvae using the infrared capture (IR) class of Laser Capture Microdissection (LCM). RNA obtained from the isolated neurons can be readily used for downstream applications including qRT-PCR or microarray analyses.

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

The dendritic arborization (da) neurons of the Drosophila peripheral nervous system (PNS) provide an excellent model system in which to investigate the ...

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3 Rd Instar Drosophila I preparativi larvali

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Analisi morfologica del Drosophila Larvale dendriti sensoriali e periferico Neuron assoni utilizzo Mosaici genetici

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Metodi per test Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Retine

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster. In a light-tight box illuminated by red light that is invisible to fruit flies, a camera linked to custom data acquisition software monitors the position of six flies simultaneously. Each fly is confined to walk in individual arenas containing a food odor at the center. The testing arenas rest on a porous floor that functions to prevent odor accumulation. Latency to locate the odor source, a metric that reflects olfactory sensitivity under different physiological states, is determined by software analysis. Here, we discuss the critical mechanics of running this behavioral paradigm and cover specific issues regarding fly loading, odor contamination, assay temperature, data quality, and statistical analysis.

A Single-fly Assay for Foraging Behavior in Drosophila

In this video article, we describe an automated assay to measure the effect of hunger or satiety on olfactory dependent food search behavior in the adult fruit fly Drosophila melanogaster.

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in<em&gt; Drosophila</em

For many animals, hunger promotes changes in the olfactory system in a manner that facilitates the search for appropriate food sources. In this video ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Immagini dal vivo di<em&gt; Drosophila</em&gt; larvali neuroblasti

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

Metodi per la determinazione strutture UV-riflettenti e determinare la loro importanza nella Mate Preferenze utilizzando il Sailfin Molly<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

Utilizzando canali lineari Agarose per studiare

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Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae

Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

Visualizzazione dei nervi larvali segmentale in 3^Rd Instar Drosophila I preparativi larvali

Analisi morfologica del Drosophila Larvale dendriti sensoriali e periferico Neuron assoni utilizzo Mosaici genetici

Metodi per test Drosophila Comportamento

Dissezione e immunoistochimica di larvale, pupa e adulto

A Single-fly saggio per comportamento alimentare in

Immagini dal vivo di

Metodi per la determinazione strutture UV-riflettenti e determinare la loro importanza nella Mate Preferenze utilizzando il Sailfin Molly

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando