Gli autori vogliono riconoscere i contributi critici di Dr A. Dejam e MM Pelletier a sviluppare l&#39;uso di soluzione di nitrito di preservare per le misure di nitriti nel sangue.

Tutti i protocolli, tra cui l&#39;uso di animali sono stati approvati per l&#39;uso da NIDDK cura degli animali e del Comitato uso e sangue umano è stato ottenuto da banca del sangue NIH da donatori sani. Preparazione 1. Esempio <ol><li> Preparazione della soluzione di nitrito di conservazione <ol><li> Preparare una soluzione contenente 890 mM ferrocianuro di potassio (K 3 Fe (CN) 6) e 118 mM NEM (N-etilmaleimide) in acqua distillata. Sciogliere bene fino a quando è chiaro di colore giallo, senza cristalli presenti. Aggiungere NP-40 (ottil phenoxylpolyethoxylethanol) in un rapporto 1: 9 (v / v, NP-40 / soluzione). Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma e conservare a 4 ° C per circa una settimana). </li></ol></li><li> Raccolta e preparazione dei campioni di sangue <ol><li> Raccogliere il sangue utilizzando almeno un ago 20 G per evitare emolisi con eparina per prevenire la coagulazione (5 U / ml). Per il campione di sangue intero, mescolare il sangue con nitrito di conservazione immediatamente soluzione in un rapporto 1: 4 (v/ V / sangue). </li><li> Per i campioni di plasma e globuli rossi, centrifugare il sangue raccolto per 5 minuti a 4000 xga 4 ° C per separare i globuli rossi (RBC) e plasma. Prendere il surnatante (plasma) e mescolare con nitrito di preservare soluzione come sopra descritto per la determinazione dei livelli di nitriti nel plasma. </li><li> Rimuovere accuratamente plasma e buffy coat dal campione e pipetta RBC dal fondo del tubo rimanente per evitare la contaminazione da altri tipi di cellule del sangue utilizzando un puntale cut-off, e trasferirlo in una provetta contenente nitriti soluzione conservando nello stesso rapporto come sopra. </li><li> Mescolare ogni campione (plasma e RBC) con metanolo freddo ad un rapporto 1: 1 o 1: 2 (v / v campione / metanolo) e centrifugare a 13.000 xga 4 ° C per 15 minuti per precipitare le proteine. Prendere il surnatante e utilizzarlo per la misurazione nitriti o congelare campioni preparati, se necessario, il ghiaccio secco e conservare a -80 ° C. Nota: Nitrito rea rapidamenteCTS con ossiemoglobina (oxyHb) nel sangue formare nitrati. Poiché oxyHb è sempre presente in grande eccesso rispetto nitrito, questa reazione porta alla distruzione quasi completa del nitrito di sangue nativo con un arco di tempo di ~ 10 min. Per preservare la maggior parte endogena nitrito di sangue, soluzione di nitrito-conservazione viene aggiunto ai campioni di sangue intero immediatamente dopo il prelievo di sangue. La soluzione rapidamente lisare i globuli rossi e ossidare oxyHb in metaemoglobina (metHb), una forma inattiva di emoglobina che non reagisce chimicamente con nitriti. </li></ol></li><li> Preparazione dei campioni da altri tipi di fluido corporeo <ol><li> Dopo la raccolta del campione in apposito contenitore, mescolare bene con nitrito di preservare soluzione, deproteinate e misurare immediatamente o congelare e conservare a -80 ° C. </li></ol></li><li> Raccolta e preparazione dei campioni di tessuto <ol><li> Raccogliere tessuti provenienti da animali perfusi con soluzione fisiologica eparinizzata (10 U HEPArin / ml). Excise circa 1 g di tessuto desiderata e omogeneizzare sia utilizzando un omogeneizzatore manuale o automatizzato omogeneizzatore. </li><li> Aggiungere quantità nota di nitrito preservare soluzione come necessario per conseguire omogenato liscia. </li><li> Una volta che il tessuto è omogeneizzato, precipitare le proteine ​​usando metanolo freddo (1: 1 o 1: 2 rapporto v / v campione / metanolo) come sopra descritto, campioni quindi centrifugare a 13.000 xga 4 ° C per 15 min. </li><li> Raccogliere i livelli di nitriti surnatante e misura. Se necessario, congelarli a qualsiasi fase di preparazione in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di Riduzione Solutions <ol><li> Tri-ioduro (I 3) ridurre la soluzione per nitriti e R- (X) NESSUN specie determinazione 1,3,4 <ol><li> Preparare una soluzione di 301 mM KI insieme a 138 mm I 2 soluzione in acqua. Mescolare con acido acetico glaciale in rapporto 2: 7 (v / v / soluzione acida) su un agitatore magnetico per ~ 30 minuti fino a quando tutticristalli sono dissolti. Preferibilmente tenere in bottiglia scura, come ioduro è sensibile alla luce, ed utilizzare entro una settimana dalla preparazione. Nota: Questa soluzione consentirà di ridurre il nitrito in NO e sarà anche rilasciare NO da R-SNO, R-NNO e Fe-no gruppi funzionali (R- (X) -NO), ma il nitrato non sarà influenzata. Il segnale dai gruppi funzionali sopra NO-based può essere separato dal segnale vero nitriti mediante trattamento di metà del campione con sulfanilamide acidificato (AS) e confrontando AS-trattati e il segnale non trattato. Forme come irreversibilmente diazonio cazione con nitriti e questo complesso può essere ridotta I 3 soluzione. Per AS trattamento, preparare 290 soluzione mM di Sulfanilamide in 1 M HCl e aggiungerlo a una aliquota di campione in rapporto 1: 9 (v / v AS / campione). Misurare il segnale CL in parti AS-trattati e non trattati del campione. Calcolare il segnale vero nitriti come una differenza di parte AS-trattate e non trattate di campione. Il nitrito può essere misurato anche utilizzando un NIT selettivoRite-riducendo soluzione di miscela di acido ascorbico / acido acetico, come descritto nella parte 2.2. Tuttavia, a causa della piccola quantità di solito di R- (X) -NO specie presenti, misurazioni utilizzando campioni AS-trattati sono nella maggior parte dei casi una buona approssimazione del tenore totale di nitriti. </li></ol></li><li> Acido ascorbico / acido acetico soluzione (4A) per la determinazione selettiva di nitriti 2 <ol><li> Preparare 500 mm acido ascorbico in acqua. Mescolare questa soluzione con acido acetico glaciale in un rapporto 1: 7 (v / v, acido ascorbico / acido acetico) per preparare la miscela di reazione. Nota: Questa soluzione è specifica per il nitrito, non rilascerà NO da qualsiasi R- (X) NESSUN specie o nitrato. Tuttavia, la soluzione di ascorbico e acido acetico deve essere preparata estemporaneamente ogni giorno prima delle misurazioni, come acido ascorbico ossida facilmente in soluzione. Il completamento della riduzione nitriti dipende dalla concentrazione di acido ascorbico; e almeno 50 mM di acido ascorbico è raccomandato completa reduction di nitriti plasma. Tuttavia, si consiglia di eseguire alcuni esperimenti pilota con diverse concentrazioni di acido ascorbico e gli standard di nitriti nel range di concentrazione di nitriti previsto prima misurazioni campione finale. Tenere presente che l&#39;acido ascorbico esaurisce leggermente durante le misurazioni, sono raccomandati così frequenti cambi di miscela di reazione nella camera di reazione di vetro. </li></ol></li><li> Vanadio (III) riducendo soluzione di cloruro di determinazione nitrato 9 <ol><li> Preparare 51 mM soluzione di VCl 3 in 1 M HCl. soluzione filtro attraverso il filtro 200 micron e conservare in una bottiglia scura, utilizzare entro due settimane. Nota: Questa soluzione ridurrà nitrati, nitriti e tutti R- (X) -NO specie, quindi se quantità comparabili di nitriti o altro R- (X) -NO specie sono presenti insieme con nitrato, il contenuto finale nitrati deve essere calcolato come la differenza tra i segnali CL ottenuti con VCl 3 e3 riducendo soluzioni. </li></ol></li></ol> 3. chemiluminescenza (CL) Setup Analyzer e Misure <ol><li> Soluzione standard <ol><li> Preparare 1 mM soluzione di nitrito di sodio (nano 2). La stessa soluzione può essere utilizzata per nitriti e nitrati determinazioni. </li></ol></li><li> Utilizzando analizzatore Nota: Attualmente ci sono due disponibili in commercio NO analizzatori che sono abbastanza sensibili per finalità di ricerca biologica - Sievers NOA e Ecophysics CLD 88Y. Entrambi operano sullo stesso principio; la differenza principale è che CLD 88Y utilizza l&#39;ossigeno dall&#39;aria camera per rendere ozono (O 3), mentre NOA richiede un serbatoio di ossigeno esterna a questo scopo. La procedura che segue descrive il set up per il Sievers NOA. <ol><li> configurazione dello strumento <ol><li> Eseguire la configurazione iniziale del analizzatore secondo le raccomandazioni del fabbricantecome visto in Figura 1. </li><li> Aprire serbatoio O 2 collegato allo strumento. Scegliere &quot;analisi&quot; e &quot;inserire&quot; dal menu principale del pannello frontale. Nella schermata successiva scegliere &quot;start&quot; e premere &quot;invio&quot;. Collegare la trappola di acido (contenente 1 M NaOH) allo strumento come mostrato in Figura 1. </li><li> Attendere fotomoltiplicatore raffredda alla temperatura inferiore a -12 ° C e la camera di reazione viene evacuato a 6 Torr. Ci vogliono circa 30 minuti per raggiungere una linea di base piana e stabile. La linea di base deve stabilizzare entro 1 - 2 mV, il suo valore nominale è meno importante della sua stabilità. Nota: Se il nitrato è misurato, accendere il bagno di raffreddamento ad acqua (a 4 ° C, che serve trappola fredda per vapori acidi e acqua) e bagno di acqua di riscaldamento (camera di reazione principale, 95 ° C). Il tasso di riduzione dei nitrati in NO in VCl 3 soluzione dipende dalla temperatura, ed è molto lento a camera temperatura, è necessario in modo sostanziale aumento della temperatura per osservare la reazione. </li><li> Aprire il serbatoio Lui e collegare la camera di reazione di vetro per intrappolare acido come visto in Figura 1. Riempire la camera di reazione con soluzione riducente adeguata, ridurre il gorgogliare al minimo e connettersi camera di reazione alla trappola di acido. Utilizzando tentativi ed errori, regolare la velocità di ribollimento Egli per abbinare il tasso di aspirazione strumento (di solito ~ 200 ml / min per NOA di Siever). </li><li> Accendere il computer che controlla lo strumento e avviare il software Liquid Labview-based. Per attivare la comunicazione tra lo strumento e il software di acquisizione, premere &quot;Invio&quot; quando nel menu &quot;Dati&quot; fino a schermo si legge &quot;in uscita abilitato&quot;, quindi premere &quot;chiaro&quot; per tornare indietro alla schermata dei dati. </li><li> Attendere una traccia linea di base stabile sullo schermo e iniziare l&#39;iniezione di campioni e gli standard di nitrito in riducendo soluzione attraverso il setto. Attendere sempre per raggiungere una linea di base stabile a poppaer il picco. Questo può richiedere fino a 2 min. Il software Liquid ha un&#39;opzione per &quot;marcare&quot; i tempi di iniezione e annotare l&#39;iniezione e sarà esportare questi commenti in un file separato (filename.info) come un utile complemento per il file di dati (filename.data). </li><li> Una volta che i campioni e gli standard sono misurati, scegliere &quot;stop&quot; opzione nel menu del software Liquid - questo scriverà i dati da un file temporaneo in un file permanente conosciuto come &quot;filename.data&quot;. Premendo l&#39;opzione &quot;abortire&quot; terminerà la misurazione senza scrivere dati acquisiti in un file permanente. </li><li> Per terminare esperimento, scollegare la macchina dal recipiente di reazione spegnendo il rubinetto sulla parte superiore del recipiente di reazione e scollegare il tubo tra trap acidi e recipiente di reazione (vedere Figura 1). Ora smettere analizzatore NOA - premere &quot;chiaro&quot;, andare a &quot;analisi&quot;, mettere la macchina in &quot;stand-by&quot; e stand-by &quot;conferma&quot;. Se usato regolarmente, ilstrumento può essere lasciato in modalità stand-by per diverse settimane. Spegnere rifornimento di ossigeno. Poi lavare la soluzione riducendo dalla camera di reazione, scollegare e chiudere il serbatoio Egli dal recipiente di reazione di vetro e rifinire recipiente di reazione. </li></ol></li><li> Norme e iniezioni di esempio <ol><li> Iniettare 50 ml di soluzione di nitrito di 1 micron in miscela di reazione con una siringa Hamilton ben lavata. Attendere almeno 1 - 2 min tra le iniezioni per ottenere una buona separazione dei picchi. Ripetere l&#39;iniezione di 50 ml per ottenere i duplicati per ogni punto di dati. Lavare la siringa con acqua deionizzata dopo ogni iniezione. </li><li> Per acquisire una serie completa di dati per curva standard, continuare con iniezioni duplicate di 100, 150 ml (altri 200 ml potrebbero essere necessari se si prevedono elevate concentrazioni di nitriti e nitrati) di soluzione di nitrito di 1 micron. In ogni caso, aver cura di attendere che il segnale scende di nuovo alla linea di base e quindi acquisire 1 - 2 min di base per ottenere una buona separazione dei picchi. Nota: standard nitriti possono essere misurati in qualsiasi momento durante gli esperimenti. Tuttavia, è preferibile acquisire la curva standard prima della misurazione dei dati, in quanto serve anche come un controllo indipendente della funzionalità dello strumento. Quando i dati sono raccolti, quantità di campione iniettata dovrebbe portare a picchi ben pronunciate. Tuttavia va tenuto presente che il fotomoltiplicatore è lineare solo fino a ~ 800 mV, quindi nessuno del picco deve essere superiore a ~ 700 mV. Ciò può essere ottenuto sia diminuendo di campione quantità iniettata o diluendo il campione con acqua deionizzata. Ogni punto dovrebbe essere misurata almeno in doppio. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Dr. Alan Schechter è elencato come co-inventore diversi brevetti rilasciati il ​​National Institutes of Health per l&#39;uso di sali nitriti per il trattamento delle malattie cardiovascolari. Egli riceve royalties basate su NIH concessione di licenze di questi brevetti per lo sviluppo clinico, ma nessun altro compenso.

I passaggi critici all&#39;interno del protocollo Aliquote di tutte le soluzioni (tra cui l&#39;acqua) usate per preparare, diluire o altrimenti trattare campioni originali devono essere salvati e controllati per possibili nitriti o (più spesso) contaminazione da nitrati. Abbiamo trovato che la maggior contaminazione proviene da acqua e molti prodotti chimici usati per il trattamento di campioni (ferricianuro in particolare) contengono anche significativa quantità di contaminazione da nitrati...

Nitrito, e ad un nitrato meno estendere, i livelli nel sangue riflettono stato generale del corpo NO metabolismo. concentrazione dei nitriti nel sangue e la maggior parte degli organi e tessuti sono solo in alta nanomolari o gamma micromolare basso, il nitrato di solito è presente in quantità molto più elevate - nella gamma micromolare. I cambiamenti nei livelli di nitriti a causa di progressione della malattia o cambiamenti nelle abitudini alimentari sono piuttosto piccole e possono essere misurati solo con un metodo molto sensibile. A causa delle loro molto diversi livelli e diversi processi metabolici, la determinazione separata dei livelli di nitriti e nitrati è essenziale. La cosiddetta &quot;NO determinazione x&quot; dove nitriti e nitrati siano misurate insieme ha ben poco valore. Diversi metodi per quantificare nitriti in vari campioni biologici sono stati sviluppati - il più comune è il più antico, basato sulla reazione di Griess che era stato originariamente descritto in 1879. Anche con modificatio modernans, il limite di sensibilità per i nitriti ottenibile con il metodo di Griess &#39;è nella gamma micromolare bassa. Chemiluminescenza (CL), in combinazione con tri-ioduro riducendo soluzione, è attualmente considerato il metodo più sensibile, che consente la quantificazione in gamma bassa nanomolari della concentrazione di nitriti 1-8,10,11. Lo stesso metodo CL, combinato con vanadio (III) cloruro di riduzione soluzione, può essere utilizzato per misurazioni sensibili di nitrato, con precisione nell&#39;intervallo nanomolare 9. CL rileva libera gas NO. Pertanto, nitriti, nitrati, R-nitrosothiols (R-SNO), R-nitrosamine (R-NNO), o composti metallo-NO (più tardi nel manoscritto di cui come &quot;R- (X) -NO&quot;), deve essere convertito in liberare gas NO al fine di quantificare il loro valore originale via CL. La conversione in NO viene effettuata mediante diverse soluzioni riducenti diversi, a seconda della natura del NO metabolita. Dopo la conversione, libera gas NO viene estratta dal recipiente di reazione da un gas carrier (He, N2 o Ar) nella camera di reazione di CL analizzatore cui l&#39;ozono (O 3) è combinato con NO per formare biossido di azoto (NO 2) nel suo stato attivato. Con il ritorno allo stato fondamentale, NO 2 * emette nella regione infrarossa e fotone emesso viene rilevato da fotomoltiplicatore (PMT) dello strumento CL. L&#39;intensità della luce emessa è direttamente proporzionale alla concentrazione di NO in camera di reazione, che permette di calcolare la concentrazione della specie originali usando curve di taratura adeguate. Nel nostro protocollo, in primo luogo abbiamo presente determinazione CL a base di nitriti e nitrati nelle situazioni cliniche più utilizzate - nel sangue e di plasma, e poi discutiamo come determinare questi ioni in campioni di tessuto. Spiegheremo anche nel dettaglio come preservare la concentrazione di nitrito fisiologica originale in ambienti nitriti reattivo, come il sangue e suoi scomparti, plasma e globuli rossi.

<table><tbody><tr><td>potassium ferricyanide; K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;Fe(CN)&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamide; AS&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>acetic acid, glacial</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>ascorbic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>potassium iodide; KI</td><td>Sigma</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>iodine; I&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>207772</td><td>light sensitive, toxic</td></tr><tr><td>sodium nitrite; NaNO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>563218</td><td></td></tr><tr><td>vanadium(III) chloride; VCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>ligt sensitive, toxic</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sievers NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&amp;nbsp;Ecophysics&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

measuring nitrite and nitrate, metabolites in the nitric oxide pathway, in biological materials using the chemiluminescence method

L&#39;ossido nitrico (NO) è una delle principali molecole regolatore dell&#39;omeostasi vascolare e anche un neurotrasmettitore. Enzimatica prodotta NO viene ossidato in nitriti e nitrati dalle interazioni con diverse proteine ​​ossi-eme e altri percorsi ancora poco conosciuti. Il processo inverso, la riduzione dei nitriti e nitrati in NO era stato scoperto nei mammiferi negli ultimi dieci anni ed è guadagnando attenzione come uno dei possibili percorsi per sia prevenire o alleviare una vasta gamma di malattie cardiovascolari, malattie metaboliche e muscolari che si pensa essere associato con diminuzione dei livelli di NO. È quindi importante valutare la quantità di NO e suoi metaboliti in differenti compartimenti corporei - sangue, fluidi corporei e vari tessuti. Sangue, grazie alla sua facile accessibilità, è il vano preferito utilizzato per la stima dei metaboliti. A causa della sua breve vita (pochi millisecondi) e bassa concentrazione di sub-nanomolari, misurazioni affidabili dirette di sangue NO &lt;em&gt; in vivo presentano grandi difficoltà tecniche. Così NO disponibilità è solitamente stimato in base alla quantità dei suoi prodotti di ossidazione, nitriti e nitrati. Questi due metaboliti vengono sempre misurati separatamente. Ci sono diversi metodi ben stabiliti per determinare le loro concentrazioni nei fluidi e nei tessuti biologici. Qui vi presentiamo un protocollo per il metodo chemiluminescenza (CL), in base alla rilevazione spettrofotometrica di NO dopo nitriti o nitrati riduzione di (III) soluzioni di cloruro rispettivamente tri-ioduro o vanadio,. La sensibilità per nitriti e nitrati rilevamento è in gamma bassa nanomolari, che stabilisce CL come il metodo più sensibile attualmente disponibile per determinare le variazioni di NO vie metaboliche. Vi spieghiamo in dettaglio come preparare campioni di fluidi e tessuti biologici al fine di preservare quantità originali di nitriti e nitrati presenti al momento della raccolta e su come determinare le loro rispettive quantità nei campioni. Limitazioni della tecnica CL sono anche explained.

La figura 2 mostra i risultati rappresentativi raccolti da standard e cinque campioni diversi. Come mostrato in questa figura, tensione aumenta fotomoltiplicatore immediatamente dopo nitrito contenenti soluzione (standard o campioni) viene iniettato riducendo soluzione (iniezioni volte sono indicati da frecce rosse sotto la curva) e ritorna al valore basale volta tutte nitriti presenti nella iniettato soluzione è stata ridotta. È anche chiaro da questa figura che sono ...

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Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.

Misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico Pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

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A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted mechanism of metabolic activation involves formation of &#945;-hydroxynitrosamines that spontaneously decompose to DNA alkylating agents. Accumulation of DNA damage and the resulting mutations can ultimately lead to cancer. New evidence indicates that &#945;-hydroxynitrosamines can be further oxidized to nitrosamides processively by cytochrome P450s. Because nitrosamides are generally more stable than &#945;-hydroxynitrosamines and can also alkylate DNA, nitrosamides may play a role in carcinogenesis. In this report, we describe a general protocol for evaluating nitrosamide production from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines. This protocol utilizes a general approach to the synthesis of the relevant nitrosamides and an in vitro cytochrome P450 metabolism assay using liquid chromatography-nanospray ionization-high resolution tandem mass spectrometry for detection. This method detected N&#8242;-nitrosonorcotinine as a minor metabolite of N&#8242;-nitrosonornicotine in the example study. The method has high sensitivity and selectively due to accurate mass detection. Application of this method to a wide variety of nitrosamine-cytochrome P450 systems will help determine the generality of this transformation. Because cytochrome P450s are polymorphic and vary in activity, a better understanding of nitrosamide formation could aid in individual cancer risk assessment.

A General Method for Detecting Nitrosamide Formation in the In Vitro Metabolism of Nitrosamines by Cytochrome P450s

&#945;-hydroxylation of carcinogenic nitrosamines by cytochrome P450s is the accepted metabolic pathway that produces DNA-damaging intermediates, which cause mutations. However, new data indicates further oxidation to nitrosamides can occur. We describe a general method for detecting nitrosamides produced from in vitro cytochrome P450-catalyzed metabolism of nitrosamines.

Un metodo generale per la rilevazione Nitrosamide formazione nel metabolismo In Vitro di nitrosammine di citocromo P450s

N-nitrosamines are a well-established group of environmental carcinogens, which require cytochrome P450 oxidation to exhibit activity. The accepted ...

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Automated, High-resolution Mobile Collection System for the Nitrogen Isotopic Analysis of NOx

Nitrogen oxides (NOx = NO + NO2) are a family of atmospheric trace gases that have great impact on the environment. NOx concentrations directly influence the oxidizing capacity of the atmosphere through interactions with ozone and hydroxyl radicals. The main sink of NOx is the formation and deposition of nitric acid, a component of acid rain and a bioavailable nutrient. NOx is emitted from a mixture of natural and anthropogenic sources, which vary in space and time. The collocation of multiple sources and the short lifetime of NOx make it challenging to quantitatively constrain the influence of different emission sources and their impacts on the environment. Nitrogen isotopes of NOx have been suggested to vary amongst different sources, representing a potentially powerful tool to understand the sources and transport of NOx. However, previous methods of collecting atmospheric NOx integrate over long (week to month) time spans and are not validated for the efficient collection of NOx in relevant, diverse field conditions. We report on a new, highly efficient field-based system that collects atmospheric NOx for isotope analysis at a time resolution between 30 min and 2 hr. This method collects gaseous NOx in solution as nitrate with 100% efficiency under a variety of conditions. Protocols are presented for collecting air in urban settings under both stationary and mobile conditions. We detail the advantages and limitations of the method and demonstrate its application in the field. Data from several deployments are shown to 1) evaluate field-based collection efficiency by comparisons with in situ NOx concentration measurements, 2) test the stability of stored solutions before processing, 3) quantify in situ reproducibility in a variety of urban settings, and 4) demonstrate the range of N isotopes of NOx detected in ambient urban air and on heavily traveled roadways.

Automated, High-resolution Mobile Collection System for the Nitrogen Isotopic Analysis of NOx

Previous work suggests that the nitrogen isotopic composition of atmospheric nitrogen oxides might distinguish the influence of different sources in the environment. We report on an automated, mobile, field-based method for the high collection efficiency of atmospheric NOx for N isotopic analysis at an hourly time resolution.

Automatizzato, ad alta risoluzione mobile sistema di raccolta per l&#39;analisi isotopica di azoto di NO<sub&gt; x</sub

Nitrogen oxides (NOx = NO + NO2) are a family of atmospheric trace gases that have great impact on the environment. NOx concentrations directly influence ...

Ambiente

Procedures of Laboratory Fumigation for Pest Control with Nitric Oxide Gas

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on fresh products and procedures for residue analysis and product quality evaluation. An airtight fumigation chamber containing fresh fruit and vegetables is first flushed with nitrogen (N2) to establish an ultralow oxygen (ULO) environment followed by injection of NO. The fumigation chamber is then kept at a low temperature of 2 - 5 &#176;C for a specified time period necessary to kill a target pest to complete a fumigation treatment. At the end of a fumigation treatment, the fumigation chamber is flushed with N2 to dilute NO prior to opening the chamber to ambient air to prevent the reaction between NO and O2, which produces NO2 and may damage delicate fresh products. At different times after NO fumigation, NO2 in headspace and nitrate and nitrite in liquid samples were measured as residues. Product quality was evaluated after 2 weeks of post-treatment cold storage to determine effects of NO fumigation on product quality. Keeping&#160;O2 from reacting with NO is critical to NO fumigation and is an important part of the protocols. Measuring NO levels is challenging and a practical solution is provided. Possible protocol modifications are also suggested for measuring NO levels in the fumigation chambers as well as residues. NO fumigation has the potential to be a practical alternative to methyl bromide fumigation for postharvest pest control on fresh and stored products. This publication is intended to assist other researchers in conducting NO fumigation research for postharvest pest control and accelerating the development of NO fumigation for practical applications.

This paper describes nitric oxide (NO) fumigation protocols for postharvest pest control. Fumigation chambers are flushed with nitrogen (N2) to establish ultralow oxygen conditions before NO is injected. At the end, chambers are flushed with N2 to dilute NO before exposing products to ambient air to prevent exposure to NO2.

Procedure di fumigazione di laboratorio per il controllo dei parassiti con Gas di ossido di azoto

Nitric oxide (NO) is a newly discovered fumigant for postharvest pest control. This paper provides detailed protocols for conducting NO fumigation on ...

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be considered one of the most important signaling molecules produced in our body, regulating essential functions including but not limited to regulation of blood pressure, immune response and neural communication. Therefore its accurate detection and quantification in biological matrices is critical to understanding the role of NO in health and disease. With such a short physiological half life of NO, alternative strategies for the detection of reaction products of NO biochemistry have been developed. The quantification of relevant NO metabolites in multiple biological compartments provides valuable information with regards to in vivo NO production, bioavailability and metabolism. Simply sampling a single compartment such as blood or plasma may not always provide an accurate assessment of whole body NO status, particularly in tissues. The ability to compare blood with select tissues in experimental animals will help bridge the gap between basic science and clinical medicine as far as diagnostic and prognostic utility of NO biomarkers in health and disease. Therefore, extrapolation of plasma or blood NO status to specific tissues of interest is no longer a valid approach. As a result, methods continue to be developed and validated which allow the detection and quantification of NO and NO-related products/metabolites in multiple compartments of experimental animals in vivo. The established paradigm of NO biochemistry from production by NO synthases to activation of soluble guanylyl cyclase (sGC) to eventual oxidation to nitrite (NO2-) and nitrate (NO3-) may only represent part of NO's effects in vivo. The interaction of NO and NO-derived metabolites with protein thiols, secondary amines, and metals to form S-nitrosothiols (RSNOs), N-nitrosamines (RNNOs), and nitrosyl-heme respectively represent cGMP-independent effects of NO and are likely just as important physiologically as activation of sGC by NO. A true understanding of NO in physiology is derived from in vivo experiments sampling multiple compartments simultaneously. Nitric oxide (NO) methodology is a complex and often confusing science and the focus of many debates and discussion concerning NO biochemistry. The elucidation of new mechanisms and signaling pathways involving NO hinges on our ability to specifically, selectively and sensitively detect and quantify NO and all relevant NO products and metabolites in complex biological matrices. Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of nitrite and nitrate by HPLC as well as detection of free NO in biological samples using in vitro ozone based chemiluminescence with chemical derivitazation to determine molecular source of NO as well as ex vivo with organ bath myography.

The endogenous production of nitric oxide (NO) regulates a wide variety of biological functions. It is becoming increasingly clear that disruption or dysregulation of NO based signaling is involved in many human diseases. Methods to quantify relevant NO metabolites may provide novel diagnostic or prognostic biomarkers for human disease.

Tecniche analitiche per il saggio Bioattività Ossido Nitrico

Nitric oxide (NO) is a diatomic free radical that is extremely short lived in biological systems (less than 1 second in circulating blood)1. NO may be ...

Medicina

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has been increasing because global nitrogen loads have dramatically increased following industrialization. Dissimilatory nitrate reduction to ammonium (DNRA) and denitrification are both microbial processes that use NO3&#8722; for respiration. Compared to denitrification, quantitative determinations of the DNRA activity have been carried out only to a limited extent. This has led to an insufficient understanding of the importance of DNRA in NO3&#8722; transformations and the regulating factors of this process. The objective of this paper is to provide a detailed procedure for the measurement of the potential DNRA rate in environmental samples. In brief, the potential DNRA rate can be calculated from the 15N-labeled ammonium (15NH4+) accumulation rate in 15NO3&#8722; added incubation. The determination of the 14NH4+ and 15NH4+ concentrations described in this paper is comprised of the following steps. First, the NH4+ in the sample is extracted and trapped on an acidified glass filter as ammonium salt. Second, the trapped ammonium is eluted and oxidized to NO3&#8722; via persulfate oxidation. Third, the NO3&#8722; is converted to N2O via an N2O reductase deficient denitrifier. Finally, the converted N2O is analyzed using a previously developed quadrupole gas chromatography&#8211;mass spectrometry system. We applied this method to salt marsh sediments and calculated their potential DNRA rates, demonstrating that the proposed procedures allow a simple and more rapid determination compared to previously described methods.

Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O

A series of methods to determine the potential DNRA rate based on 14NH4+/15NH4+ analyses is provided in detail. NH4+ is converted into N2O via several steps and analyzed using quadrupole gas chromatography&#8211;mass spectrometry.

Misurazione dei tassi potenziali di riduzione del nitrato dissimiliva all'ammonio sulla base di 14NH4/15NH4- Analisi tramite conversione sequenziale in N2O

The importance of understanding the fate of nitrate (NO3&#8722;), which is the dominant N species transferred from terrestrial to aquatic ecosystems, has ...

Platelet-based Detection of Nitric Oxide in Blood by Measuring VASP Phosphorylation

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent vasoactive agents, nitric oxide (NO), can also act as a powerful inhibitor of platelet aggregation. Direct NO detection in blood is very challenging due to its high reactivity with cell-free hemoglobin that limits NO half-life to the millisecond range. Currently, NO changes after interventions are only estimated based on measured changes of nitrite and nitrate (members of the nitrate-nitrite-NO metabolic pathway). However precise, these measurements are rather difficult to interpret vis a vis actual NO changes, due to the naturally high baseline nitrite and nitrate levels that are several orders of magnitude higher than expected changes of NO itself. Therefore, the development of direct and simple methods that would allow one to detect NO directly is long overdue. This protocol addresses a potential use of platelets as a highly sensitive NO sensor in blood. It describes initial platelet rich plasma (PRP) and washed platelet preparations and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as NO generators. Phosphorylation of VASP at serine 239 (P-VASPSer239) is used to detect the presence of NO. The fact that VASP protein is highly expressed in platelets and that it is rapidly phosphorylated when NO is present leads to a unique opportunity to use this pathway to directly detect NO presence in blood.

Here, we present a protocol to address the potential use of platelets as a highly sensitive nitric oxide sensor in blood. It describes initial platelet preparation and the use of nitrite and deoxygenated red blood cells as nitric oxide generators.

Rilevazione basata su piastrine di ossido nitrico nel sangue misurando VASP fosforilazione

Platelets are the blood components responsible for proper blood clotting. Their function is highly regulated by various pathways. One of the most potent ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Biologia

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the effects of nitrosated compounds. Measuring NO metabolites is essential to studying NO activity both at vascular levels and in other tissues, especially in the experimental settings where exogenous NO is administered. Ozone-based chemiluminescence assays allow precise measurements of NO and NO metabolites in both fluids (including plasma, tissue homogenates, cell cultures) and gas mixtures (e.g., exhaled breath). NO reacts with ozone to generate nitrogen dioxide in an excited state. The consequent light emission allows photodetection and the generation of an electric signal reflecting the NO content of the sample. Aliquots from the same sample can be used to measure specific NO metabolites, such as nitrate, nitrite, S-nitrosothiols, and iron-nitrosyl complexes. In addition, NO consumed by cell-free hemoglobin is also quantified with chemiluminescence analysis. An illustration of all these techniques is provided.

Here, we present protocols for detecting nitric oxide and its biologically relevant derivatives using chemiluminescence-based assays with high sensitivity.

Saggi basati sulla chemiluminescenza per la rilevazione di ossido nitrico e suoi derivati da autoxidazione e composti nitrosi

Nitric oxide (NO) activity in vivo is the combined results of its direct effects, the action of its derivatives generated from NO autoxidation, and the ...

Application of Genetically Encoded Fluorescent Nitric Oxide (NO&#8226;) Probes, the geNOps, for Real-time Imaging of NO&#8226; Signals in Single Cells

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence of a large number of methods for detecting NO&#8226; in vivo and in vitro, the real-time monitoring of NO&#8226; at the single-cell level is very challenging. The physiological or pathological effects of NO&#8226; are determined by the actual concentration and dwell time of this radical. Accordingly, methods that allow the single-cell detection of NO&#8226; are highly desirable. Recently, we expanded the pallet of NO&#8226; indicators by introducing single fluorescent protein-based genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) that directly respond to cellular NO&#8226; fluctuations and, hence, addresses this need. Here we demonstrate the usage of geNOps to assess intracellular NO&#8226; signals in response to two different chemical NO&#8226;-liberating molecules. Our results also confirm that freshly prepared 3-(2-hydroxy-1-methyl-2-nitrosohydrazino)-N-methyl-1-propanamine (NOC-7) has a much higher potential to evoke change in intracellular NO&#8226; levels as compared with the inorganic NO&#8226; donor sodium nitroprusside (SNP). Furthermore, dual-color live-cell imaging using the green geNOps (G-geNOp) and the chemical Ca2+ indicator fura-2 was performed to visualize the tight regulation of Ca2+-dependent NO&#8226; formation in single endothelial cells. These representative experiments demonstrate that geNOps are suitable tools to investigate the real-time generation and degradation of single-cell NO&#8226; signals in diverse experimental setups.

This manuscript presents protocols for the application of novel genetically encoded nitric oxide (NO&#8226;) probes (geNOps) to monitor single cell NO&#8226; fluctuations in real-time using fluorescence microscopy. The Ca2+-triggered NO&#8226; formation on the level of individual endothelial cells was visualized by combining geNOps with a chemical Ca2+ sensor.

L&#39;applicazione di geneticamente codificato fluorescente ossido nitrico (NO •) sonde, i geNOps, in tempo reale Imaging di NO • I segnali in singole cellule

Nitric Oxide (NO&#8226;) is a small radical, which mediates multiple important cellular functions in mammals, bacteria and plants. Despite the existence ...

Preparation of Rat Skeletal Muscle Homogenates for Nitrate and Nitrite Measurements

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions can be converted back to NO in mammals through a two-step reduction mechanism: nitrate being reduced to nitrite (NO2-) mostly by oral commensal bacteria, then nitrite being reduced to NO by several mechanisms including via heme- or molybdenum-containing proteins. This reductive nitrate pathway contributes to enhancing NO-mediated signaling pathways, particularly in the cardiovascular system and during muscular exercise. The levels of nitrate in the body before such utilization are determined by two different sources: endogenous NO oxidation and dietary nitrate intake, principally from plants. To elucidate the complex NO cycle in physiological circumstances, we have examined further the dynamics of its metabolites, nitrate and nitrite ions, which are relatively stable compared to NO. In previous studies skeletal muscle was identified as a major storage organ for nitrate ions in mammals, as well as a direct source of NO during exercise. Therefore, establishing a reliable methodology to measure nitrate and nitrite levels in skeletal muscle is important and should be helpful in extending its application to other tissue samples. This paper explains in detail the preparation of skeletal muscle samples, using three different homogenization methods, for nitrate and nitrite measurements and discusses important issues related to homogenization processes, including the size of the samples. Nitrate and nitrite concentrations have also been compared across four different muscle groups.

We present protocols for three different methods for the homogenization of four different muscle groups of rat skeletal muscle tissue to measure and compare the levels of nitrate and nitrite. Furthermore, we compare different sample weights to investigate whether tissue sample size affects the results of homogenization.

Preparazione di omogenati muscolari scheletrici di ratto per misurazioni di nitrati e nitriti

Nitrate ions (NO3-) were once thought to be inert end products of nitric oxide (NO) metabolism. However, previous studies demonstrated that nitrate ions ...

Misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico Pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza

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