Name: preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts
Uploaded: 2016-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts at JoVE.com

We thank Dr. Zaffar Haque for careful reading of the manuscript. We thank Drs. Masaharu Kataoka and Gengze Wu for discussions and help. Work in the Wang lab is supported by the American Heart Association, Muscular Dystrophy Association, and NIH (HL085635, HL116919, HL125925).

Tutti i passaggi descritti sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal Comitato Biosicurezza e del Comitato Istituzionale cura e l&#39;uso degli animali dell&#39;ospedale dei bambini Boston. All&#39;ospedale dei bambini Boston dispone di strutture di topo esenti da organismi patogeni con cicli giorno / notte regolamentati e climatizzazione. Veterinari e la cura degli animali dello staff di cambiamento gabbie e garantire la salute dei topi. Le strutture sono certificati AAALAC e hanno la certificazione attiva Animal Welfare Assurance (AAALAC accreditamento concesso sulla 1992/02/24 benessere degli animali Assurance numero:. A3303-01). I topi sono stati sacrificati da CO 2 erogata da una sorgente di gas compresso. I campioni di tessuto sono stati raccolti dopo aver verificato che la frequenza cardiaca, il movimento, e la respirazione degli animali era cessato. Roditori neonatali sono resistenti a CO 2 l&#39;eutanasia e sono stati sacrificati per decapitazione usando forbici affilate. Questi metodi sono coerenti con le raccomandazioni del gruppo di eutanasia della American Veterinary Medical associazione. 1. Generazione di rAAV9 costrutti dalla clonazione di un cDNA o shRNA cassetta di espressione nella spina dorsale plasmidi NOTA: Il plasmide rAAV9, contenente le ripetizioni terminali invertite (ITR) di AAV2, utilizzati per il gene sovraespressione è stato modificato per ospitare il TNNT2 pollo promotore (rAAV9.cTNT), che permette l&#39;espressione specifica per cardiomiociti di geni trasdotte 25,26,29. siti unici NheI e KpnI sono stati introdotti nel plasmide, a valle del promotore. I frammenti di cDNA che codificano i geni di interesse possono essere clonati nella spina dorsale rAAV9 utilizzando questi due siti di restrizione 25,26,29. Qui, per esempio, il vettore rAAV9 per la sovraespressione del gene GFP nei cuori di topo è stato generato. Il plasmide risultante contiene la cTnT :: cassetta GFP affiancato da due ITR siti (Figura 1). costrutti rAAV9.U6 :: shRNA sono stati utilizzati per il silenziamento genico 25. Progettazione shRNAs usandoon-line i server di progettazione shRNA. rAAV9.U6 :: shRNA può essere generata sia da ricottura e legando oligonucleotidi contenenti sequenze di DNA shRNA nelle enzima di restrizione-digerito vettori rAAV9 ospitano il promotore U6, o lungo raggio PCR e intra-molecolare Gibson montaggio a base di &quot;senza soluzione di continuità&quot; costruzione di 30. Il plasmide risultante dovrebbe contenere la cassetta U6-shRNA fiancheggiato da due ITR siti (Figura 2). Qui, ad esempio, il vettore rAAV9.U6 :: shRNA è stato costruito per atterramento Trbp mRNA (sequenza Trbp shRNA: GCAGTGATGGATATGCATCTTCTCGAGAAGATGCATATCCATCACTCG). Una corsa shRNA è stato utilizzato come controllo negativo (CCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG). <ol><li> Clonare la cassetta di espressione cDNA o shRNA nel plasmide spina dorsale rAAV9. Trasformare il DNA in cellule di E. coli competenti 25. NOTA: utilizzare le cellule di E. coli stbl2 o stbl3 per la trasformazione rAAV9 DNA per ridurre al minimo indesiderato ricombinazione ITR. </li><li> Raccogli ilclone positiva da parte delle cellule di E. coli trasformate. Amplificare la cultura in 500 ml di terreno Lilly-Barnett ed estrarre il plasmide rAAV9 dalle cellule batteriche 25-30. NOTA: Midi / Maxi prep plasmide rAAV9 per ottenere una elevata quantità di DNA (&gt; 100 mg). Prima di generare il virus, analizzare sempre l&#39;integrità sequenza dei plasmidi AAV per restrizione digestione e elettroforesi su gel di agarosio, come precedentemente descritto (http://www.vvf.uzh.ch/cloningservice/11bpdeletion/itrintegrity.html). </li></ol> 2. Trasfezione delle cellule HEK293 con rAAV9 Plasmidi <ol><li> Preparare 1 mg / mL di soluzione di polietilenimmina lineare (PEI). Sciogliere PEI in polvere in DH privo di endotossine 2 O che è stato riscaldato a 70-80 ° C. Aftercooling fino a RT, neutralizzare la soluzione a pH 7,0 con 1 M HCl. Filtro sterilizzare (0,22 micron) la soluzione. Aliquota della soluzione di riserva / ml PEI 1 mg (1,400 ml / tubo) e conservare il solutione a -20 ° C. </li><li> HEK293 cellule cultura in Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con il 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina. Cultura le cellule in un incubatore a 37 ° con 5 ± 0,5% di anidride carbonica (CO 2). </li><li> Al giorno 0, piastra cellule HEK293 in dieci piatti da 150 mm 18-20 ore prima della trasfezione, dividendo il&gt; 90% delle cellule confluenti in una diluizione 1: 2. NOTA: Al giorno 1, le cellule devono raggiungere il 90% di confluenza. </li><li> Al giorno 1, trasfezione cellule HEK293 con il plasmide rAAV9 (ad esempio, rAAV9.cTNT :: GFP o rAAV6.U6 :: shRNA costruisce), Ad-Helper plasmide, e plasmide AAV-Rep / Cap con PEI 25,26,29. <ol><li> Per 10 piatti a base di cellule al 90% di confluenza, mescolare 70 mg di AAV-Rep / Cap plasmide, 70 mcg pf rAAV9 plasmide, e 200 mg di Ad-Helper plasmide in una provetta da centrifuga da 50 ml. </li><li> Se le cellule sono meno confluenti, regolare la quantità di DNA proporzionalmente. Per esempio, se le cellule sono al 75% confluenti, ridurre laimporto DNA proporzionalmente (75/90 dell&#39;importo indicato al punto 2.4.1): mescolare 70 x 75/90 = 58,3 mg di AAV-Rep / Cap plasmide, 70 x 75/90 = 58,3 mg di rAAV9 plasmide, e 200 x 75/90 = 166,7 mg di Ad-Helper plasmide in una provetta da centrifuga da 50 ml. </li><li> Aggiungere 49 ml di RT DMEM (senza FBS) per il tubo da 50 ml e mescolare bene. </li><li> Aggiungere 1.360 ml di soluzione di PEI per rendere il PEI: rapporto di DNA (v / w) sia 4: 1. Mescolare bene. Incubare a temperatura ambiente per 15 - 30 min. </li><li> Aggiungere 5 ml della miscela preparata al punto 2.4.4 per ogni piatto da 150 mm (50 ml della miscela per dieci piatti di 150 mm). </li></ol></li><li> Cultura le cellule in un incubatore a 37 ° con 5 ± 0,5% di CO 2 per 60-72 ore. </li></ol> 3. Raccolta di transfettati HEK293 cellule e la purificazione di rAAV9 vettori <ol><li> Raccogliere le cellule 60-72 ore dopo la trasfezione. Dislodge e sospendere le cellule in piatti pipettando su e giù con il mezzo di coltura. Trasferire tutte le sospensioni cellulari di sterileprovette da 50 ml. </li><li> Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 min. Risospendere il pellet di cellule con 5 ml di PBS in ogni provetta e combinare tutte le sospensioni di cellule in una provetta da 50 ml. </li><li> Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 min. Eliminare il surnatante. A questo punto, memorizzare il pellet cellulare a -80 ° C o immediatamente purificare l&#39;AAV dal pellet, come descritto ai punti 3.4-3.15. </li><li> Preparare il tampone di lisi: 150 mm NaCl e 20 mM Tris-HCl, pH 8,0. Filtro sterilizzare (0,22 micron). Conservare il tampone a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet con 10 ml di tampone di lisi. </li><li> Congelare il lisato a -80 ° C o in bagno di ghiaccio secco / etanolo, poi scongelare a 37 ° C. Vortex per 1 min. Congelare e scongelare il lisato 3 volte. </li><li> Aggiungere la soluzione MgCl 2 al lisato scongelato (rendere la concentrazione finale di MgCl 2 nel lisato essere 1 mM). Aggiungere la nucleasi ad una concentrazione finale di 250 U / ml. Incubare a 37 ° C per 15 minuti per sciogliere il / aggr proteine ​​DNAegation. NOTA: Se l&#39;aggregazione del DNA / proteine ​​non viene sciolta dopo nucleasi o endonucleasi trattamento, Dounce omogeneizzare il lisati 20 volte. </li><li> Centrifugare il campione a 4.800 xg per 20 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante. </li><li> Nel frattempo, preparare la soluzione gradiente Iodixanolo: <ol><li> Preparare il 17% della soluzione gradiente miscelando 5 ml di PBS 10x, 0,05 ml di 1 M MgCl 2, 0,125 ml di 1 M KCl, 10 ml di 5 M NaCl, e 12,5 ml ofdensity dislivello medio. Regolare il volume totale di 50 ml utilizzando H 2 O. </li><li> Preparare la soluzione al 25% miscelando 5 ml di PBS 10x, 0,05 ml di 1 M MgCl 2, 0,125 ml di 1 M KCl, 20 ml di media densità gradiente, e 0,2 ml di 0,5% (w / v) di rosso fenolo. Regolare il volume totale di 50 ml utilizzando H 2 O. </li><li> Preparare la soluzione al 40% mescolando 5 ml di 10x PBS, 0,05 ml di 1 M MgCl 2, 0,125 ml di 1 M KCl, e 33,3 ml di mezzo gradiente di densità. Regolare il volume totale di 50 ml utilizzandoH 2 O. </li><li> Preparare la soluzione al 60% miscelando 0,05 ml di 1 M MgCl 2, 0,125 ml di 1 M KCl, 50 ml di media densità gradiente, e 0,1 ml di 0,5% (w / v) rosso fenolo. </li></ol></li><li> Con un ago e la siringa, caricare la soluzione gradiente Iodixanolo nel tubo di polipropilene dell&#39;ordine di 5 ml di 17%, 5 ml di 25%, 5 ml di 40% e 5 ml di 60%, partendo dal basso. Caricare tutto il lisato ottenuto nella fase 3.8 (14-16 ml) sulla parte superiore del gradiente. Il gradiente, indicato dal basso verso l&#39;alto, è del 60%, 40%, 25%, 17%, e lo strato lisato. Riempire il tubo con tampone di lisi e coprire con il sughero. </li><li> Centrifugare a 185.000 xg per 90 min a 16 ° C. </li><li> Raccogliere la frazione virale (40% layer) con una siringa. Inserire l&#39;ago (21 gauge) nell&#39;intersezione tra le frazioni 40% e 60%, solo aspirando lo strato 40%. NOTA: Evitare di aspirazione QUALSIASI dello strato di 25%. </li><li> Mescolare la frazione virale con sterilizzato poliossietilene-polyoxyprosoluzione blocchi propilene copolimero PBS (10% poliossietilene-poliossipropilene copolimero a blocchi magazzino 1: 10.000 diluito in PBS) fino a un volume totale di 15 ml. Caricare il composto nella provetta filtro (cut-off MW = 100 kD). Centrifugare a 2.000 xg per 30 min a 4 ° C. </li><li> Scartare la soluzione in basso. Riempire il tubo filtro con blocchi poliossietilene-poliossipropilene copolimero soluzione PBS fino ad un volume totale di 15 ml. Centrifugare a 2.000 xg per 20 min a 4 ° C. Ripetere questa operazione altre due volte. Raccogliere il virus rAAV9 purificato (la frazione di sopra del filtro). </li><li> Trasferire il rAAV9 purificato nel tubo filtro per tubi 1.7 mL. Aliquotare il rAAV9 purificato (100 - 400 microlitri / tubo, a seconda del volume e titolo del AAV) e conservare il virus a -80 ° C. NOTA: Evitare ripetuti di congelamento-disgelo. </li></ol> 4. Misura della il titolo di rAAV9 <ol><li> Preparare campioni di DNA standard. <ol><li> Progettare PCR specifica ed efficienteprimer per vettori rAAV9 e ottimizzare la condizione di PCR. NOTA: I primer utilizzati in questo studio sono &quot;Forward: TCGGGATAAAAGCAGTCTGG; Reverse: TCGGACGGAGATACGTGAGT&quot;. La reazione PCR è stata eseguita con le seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 ° C per 3 min; 35 cicli di 95 ° C per 20 sec, 60 ° C per 15 sec e 72 ° C per 10 sec; e l&#39;estensione finale a 72 ° C per 10 min. Tuttavia, i primer ottimizzati e condizioni di PCR sono specifici plasmide, come la sequenza inserto nel vettore rAAV9 può influenzare la specificità e l&#39;efficienza della PCR 31. </li><li> Eseguire la reazione di PCR con le condizioni indicate al punto 4.1.1. Purificare il prodotto di PCR con un kit di estrazione gel. </li><li> Misurare la concentrazione di DNA purificato utilizzando uno spettrofotometro. Calcolare la concentrazione in numero molecolari di DNA in base al peso molecolare / lunghezza del prodotto PCR. <ol><li> Calcolare la concentrazione molecolare utilizzando la seguente equazione: moconcentrazione lecular (molecole di DNA o di frammenti / ml) = 6,23 x 10 23 mol -1 x Con. x 10 -6 / MW. Nota: (6,23 x 10 23 mol -1 è il numero di Avagadro; concentrazione Con .: DNA in mg / ml; MW .: peso molecolare in g / mol). Per esempio, se la concentrazione ottenuta del prodotto della PCR è di 100 ug / ml e la sua lunghezza è di 200 bp, il peso molecolare del DNA a doppio filamento è 2 x 200 x 310 = 124.000 (il peso molecolare medio di ciascun nucleotide nel DNA a singolo filamento è di circa 310 g / mol). La concentrazione molecolare (molecole DNA / ml) = 6,23 X 10 23 mol -1 x 100 ug / ml x 10 -6 / 124.000 g / mol = 5,18 x 10 14 DNA molecole / ml. </li><li> Effettuare una serie di diluizioni del frammento di DNA e preparare i campioni standard, con concentrazioni di 10 13 molecole / ml, 10 12 molecole / ml, 10 11 molecole / ml, 10 10 molecole / ml, 10 9 molecole / ml, 10 <sup&gt; 8 molecole / ml, e 10 7 molecole / ml. Usare 1 ml di soluzione per ogni campione standard per la PCR quantitativa (qPCR, al punto 4.6). </li></ol></li></ol></li><li> Mescolare 5 ml di soluzione rAAV9 purificata con 5 ml di tampone 10x DNAsi, 1 ml di DNAsi (10.000 U / ml), e 39 ml di DDH 2 O. Il volume totale dovrebbe essere 50 microlitri. </li><li> Incubare il flacone a 37 ° C per 30 minuti per rimuovere residui di DNA plasmide imballati. </li><li> Inattivare i DNAsi a 95 ° C per 10 min. Raffreddare la soluzione, aggiungere 44 ml di H 2 O, 5 ml di 10x tampone DNAsi, e 1 ml di proteinasi K magazzino (10 mg / ml). </li><li> Incubare la soluzione a 50 ° C per 2 ore. Arrestare la reazione e inattivare il Proteinasi K a 95 ° C per 10 min. </li><li> Usare 1 ml di campione per il saggio PCR quantitativa (qPCR). Calcolare il titolo. <ol><li> Eseguire la PCR quantitativa (qPCR) con i primer disegnati nella fase 4.1.1 utilizzando i campioni frpasso om 4.1.4 (campioni standard) e dal punto 4.5 (campioni da misurare). <ol><li> Per ogni reazione, mescolare 10 ml di 2x master mix verde (che contengono Taq polimerasi, mix di dNTP, tampone, MgCl 2, e colorante verde), 0,5 ml di primer forward (5 micron), 0,5 ml di primer reverse (5 micron), 8 ml di H 2 O, e 1 ml di campione da misurare. Eseguire qPCR con le seguenti condizioni: tenere i campioni a 50 ° C per 2 minuti e 95 ° C per 10 min; eseguire 40 cicli a 95 ° C per 15 sec ea 60 ° C per 1 min; per la fase di fusione, incubare i campioni a 95 ° C per 30 sec e 60 ° C per 15 sec. Generare la curva standard basato sul numero C T dei campioni di riferimento (figura 3). </li></ol></li><li> Calcolare la concentrazione molecolare / titolo del campione AAV contro la curva standard. Il rAAV9 ha un genoma a singolo filamento di DNA, quindi la concentrazione molecolare sarà di 2 volte superiore rispetto alvalore calcolato (potenza 2x (10, y), Figura 3B). Inoltre, il titolo del rAAV9 purificato sarà 20 volte superiore rispetto a quanto ottenuto dal calcolo a causa della diluizione 1:20 del virus nelle reazioni DNAsi e proteinasi K (5 ml in 100 l totale). </li></ol></li></ol> 5. rAAV9 iniezione in topi neonati e saggi di espressione genica nel Cuore <ol><li> Preparare le soluzioni di lavoro rAAV9 in poliossietilene-poliossipropilene copolimero a blocchi soluzione PBS. Rendere lo stock di virus con i titoli di 1-7 x 10 12 particelle / ml. NOTA: Deliver 50-70 ml di soluzione di rAAV9 in ogni postnatale giorno 0,5-1,5 topo mediante iniezione sottocutanea. Per raggiungere efficiente sovraespressione del gene o atterramento, si raccomanda di eseguire un test pilota per ogni studio per ottimizzare la quantità di AAV iniettato. Utilizzare la stessa quantità di rAAV9.cTNT :: Luc o controlli rAAV9.U6 :: scramble per ogni studio per ridurre al minimo la distorsione. NOTA: Abbiamo usato 1-1,5x 10 11 particelle / cucciolo per la sovraespressione e 2,5-5 x 10 11 particelle / cucciolo per atterramento in giorno postnatale 0,5-1,5 mi ce). </li><li> Trattare topi neonati con rAAV9 a P0.5-P2.5 per iniezione sottocutanea. <ol><li> Pre-riempire un 29G1 / 2, 0,33 x 12,7 mm siringa da insulina con la soluzione rAAV9. Fate attenzione a rimuovere le bolle d&#39;aria. </li><li> Tenere il cucciolo crio-anestetizzati in una mano con il pollice e l&#39;indice. Prima dell&#39;iniezione, strisciare la pelle posteriore del cucciolo con un bastone tampone saturato con il 70% di alcool isopropilico per mantenere la condizione sterile. Inserire l&#39;ago della siringa nel sottocute antero-dorsale dell&#39;animale con un angolo di 5 a 10 °. Iniettare 50-70 microlitri della soluzione rAAV9 utilizzando la siringa da insulina. NOTA: rAAV9 può anche essere consegnata al mouse tramite iniezione intraperitoneale o endovenosa 26,27. espressione efficace dei geni consegnati nel cuore può essere ottenuto. Tuttavia, iniettare intraperitonealeion volte può causare espressione perde nel fegato. Dopo l&#39;iniezione, la condizione dei cuccioli è stata monitorata ogni giorno. </li></ol></li><li> Il livello di espressione genica nel cuore può essere controllata mediante qPCR, immunofluorescenza, o western blot (risultati rappresentativi sono mostrati nelle figure 4 e 5) 25,26. NOTA: I topi sono stati sacrificati da CO 2 erogata da una sorgente di gas compresso. I campioni di tessuto sono stati raccolti dopo aver verificato che la frequenza cardiaca, il movimento, e la respirazione degli animali erano cessate. Roditori neonatali sono resistenti a CO 2 l&#39;eutanasia e sono stati sacrificati per decapitazione usando forbici affilate. Il metodo è coerente con le raccomandazioni del gruppo sull&#39;eutanasia della American Veterinary Medical Association. </li></ol>

<ol>
	<li>Primrose, S. B., Twyman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of gene manipulation and genomics. , (2013).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096 (2014).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157, 1262-1278 (2014).</li><li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems+for+editing,+regulating+and+targeting+genomes.">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotechnol. 32, 347-355 (2014).</li><li>Szulc, J., Wiznerowicz, M., Sauvain, M. -. O., Trono, D., Aebischer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+tool+for+conditional+gene+expression+and+knockdown.">A versatile tool for conditional gene expression and knockdown.</a> Nat. Methods. 3, 109-116 (2006).</li><li>Nimesh, S., Halappanavar, S., Kaushik, N. K., Kumar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Gene+Delivery+Systems.">Advances in Gene Delivery Systems.</a> BioMed Res. Int. 2015, 610342 (2015).</li><li>Kamimura, K., Suda, T., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+gene+delivery+systems.">Advances in gene delivery systems.</a> Pharm. Med. 25, 293-306 (2011).</li><li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li><li>Giacca, M., Zacchigna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+gene+delivery+for+human+gene+therapy.">Virus-mediated gene delivery for human gene therapy.</a> J. Control Release. 161, 377-388 (2012).</li><li>Witlox, M., Lamfers, M., Wuisman, P., Curiel, D., Siegal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+gene+therapy+approaches+for+osteosarcoma+using+viral+vectors:+review.">Evolving gene therapy approaches for osteosarcoma using viral vectors: review.</a> Bone. 40, 797-812 (2007).</li><li>De Miguel, M. P., Cheng, L., Holland, E. C., Federspiel, M. J., Donovan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+the+c-Kit+signaling+pathway+in+mouse+primordial+germ+cells+by+retroviral-mediated+gene+transfer.">Dissection of the c-Kit signaling pathway in mouse primordial germ cells by retroviral-mediated gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 10458-10463 (2002).</li><li>Nagano, M., Shinohara, T., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+delivery+into+male+germ+line+stem+cells.">Retrovirus-mediated gene delivery into male germ line stem cells.</a> FEBS Lett. 475, 7-10 (2000).</li><li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants.">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 4626-4630 (1991).</li><li>Katz, R. A., Greger, J. G., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cell+cycle+status+on+early+events+in+retroviral+replication.">Effects of cell cycle status on early events in retroviral replication.</a> J. Cell. Biochem. 94, 880-889 (2005).</li><li>Escors, D., Breckpot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+in+gene+therapy:+their+current+status+and+future+potential.">Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. 58, 107-119 (2010).</li><li>M&#225;trai, J., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+lentiviral+vector+development+and+applications.">Recent advances in lentiviral vector development and applications.</a> Mol. Ther. 18, 477-490 (2010).</li><li>Miyazaki, Y., Miyake, A., Nomaguchi, M., Adachi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+retroviral+genome+and+the+packaging.">Structural dynamics of retroviral genome and the packaging.</a> Front. Microbiol. 2, 1-9 (2011).</li><li>Douglas, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery.">Adenovirus-Mediated Gene Delivery.</a> Gene Delivery to Mammalian Cells: Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques. , 3-14 (2004).</li><li>Armend&#225;riz-Borunda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+first+generation+adenoviral+vectors+for+preclinical+protocols:+amplification,+purification+and+functional+titration.">Production of first generation adenoviral vectors for preclinical protocols: amplification, purification and functional titration.</a> J. Biosci. Bioeng. 112, 415-421 (2011).</li><li>Snyder, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus-mediated+gene+delivery.">Adeno-associated virus-mediated gene delivery.</a> J Gene Med. 1, 166-175 (1999).</li><li>Samulski, R. J., Muzyczka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+gene+therapy+for+research+and+therapeutic+purposes.">AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes.</a> Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+transfer+in+porcine+myocardium+after+coronary+infusion+of+an+adeno-associated+virus+vector.">Long-term gene transfer in porcine myocardium after coronary infusion of an adeno-associated virus vector.</a> Ann. Thorac. Surg. 62, 1669-1676 (1996).</li><li>Kaspar, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+gene+transfer+and+long-term+expression+following+intracoronary+delivery+of+adeno-associated+virus.">Myocardial gene transfer and long-term expression following intracoronary delivery of adeno-associated virus.</a> J. Gene. Med. 7, 316-324 (2005).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trbp+regulates+heart+function+through+microRNA-mediated+Sox6+repression.">Trbp regulates heart function through microRNA-mediated Sox6 repression.</a> Nat. Genet. 47, 776-783 (2015).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac-specific+YAP+activation+improves+cardiac+function+and+survival+in+an+experimental+murine+MI+model.">Cardiac-specific YAP activation improves cardiac function and survival in an experimental murine MI model.</a> Circ. Res. 115, 354-363 (2014).</li><li>Wahlquist, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+miR-25+improves+cardiac+contractility+in+the+failing+heart.">Inhibition of miR-25 improves cardiac contractility in the failing heart.</a> Nature. 508, 531-535 (2014).</li><li>Carroll, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+for+adult+cardiac-specific+gene+deletion+with+CRISPR/Cas9.">A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 113, 338-343 (2016).</li><li>Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+silencing+of+mutant+Myh6+transcripts+in+mice+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy.">Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy.</a> Science. 342, 111-114 (2013).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat. Methods. 6, 343-345 (2009).</li><li>Rychlik, W., Spencer, W., Rhoads, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+annealing+temperature+for+DNA+amplification+in+vitro.">Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 18, 6409-6412 (1990).</li><li>Allocca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype-dependent+packaging+of+large+genes+in+adeno-associated+viral+vectors+results+in+effective+gene+delivery+in+mice.">Serotype-dependent packaging of large genes in adeno-associated viral vectors results in effective gene delivery in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1955-1964 (2008).</li><li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging.">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol. Ther. 18, 80-86 (2010).</li><li>Li, J., Sun, W., Wang, B., Xiao, X., Liu, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+trans-splicing+as+a+means+for+viral+vector-mediated+in+vivo+gene+therapy.">Protein trans-splicing as a means for viral vector-mediated in vivo gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 19, 958-964 (2008).</li><li>Piras, B. A., O'Connor, D. M., French, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+delivery+of+shRNA+by+AAV9+provides+highly+efficient+knockdown+of+ubiquitously+expressed+GFP+in+mouse+heart,+but+not+liver.">Systemic delivery of shRNA by AAV9 provides highly efficient knockdown of ubiquitously expressed GFP in mouse heart, but not liver.</a> PLoS One. 8, e75894 (2013).</li><li>Lovric, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+cardiac+and+skeletal+myocytes+induces+permissivity+to+AAV+transduction+by+relieving+inhibition+imposed+by+DNA+damage+response+proteins.">Terminal differentiation of cardiac and skeletal myocytes induces permissivity to AAV transduction by relieving inhibition imposed by DNA damage response proteins.</a> Mol. Ther. 20, 2087-2097 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

È importante minimizzare indesiderato ricombinazione ITR durante la costruzione del plasmide. Prima di generare il virus, si deve sempre monitorare l&#39;integrità ITR dei plasmidi AAV utilizzando restrizione digestione e elettroforesi su gel di agarosio. È impossibile ottenere 100% plasmidi intatte, ma il rapporto ricombinazione dovrebbe essere minimizzata il più possibile. Meno del 20% è accettabile per l&#39;imballaggio rAAV9 successo. Da segnalare, la coltura dei batteri, a temperatura più bassa (30 ° C), con...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.
One of the authors names and affiliation was corrected from:
Jian-Ming Jiang3,4 
3 Department of Genetics, Harvard Medical School 
4 Howard Hughes Medical Institute
to:
Jianming Jiang5 
5 Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/54787">Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts</a>.

Erratum: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controllo dell&#39;espressione o dell&#39;attività di geni specifici in vari sistemi biologici è diventato una strategia valida nello studio della funzione genica 1. Un mezzo diretto di realizzazione di questo obiettivo è quello di manipolare sequenze nucleotidiche e generare alleli mutanti. Anche se fare precise, modifiche mirate al genoma delle cellule viventi è ancora un tempo e la pratica alta intensità di lavoro, lo sviluppo di potenti strumenti Talen e CRISPR / Cas9 ha aperto una nuova era di editing genoma 2-5. Un metodo di laboratorio di routine di più per la manipolazione genetica si è concentrata sull&#39;introduzione di materiale genetico (DNA e RNA che contengono sequenze codificanti o siRNA / shRNAs) nelle cellule per esprimere o caduta del gene (s) di interesse 1,6. In molti casi, il principale ostacolo manipolazione genetica è la consegna di DNA, RNA, o proteine ​​nelle cellule. Per quanto riguarda gli studi in vitro, transfecti efficienteNei sistemi sono stati istituiti in molte linee di cellule in coltura. Tuttavia, nel modello murino in particolare, in vivo consegna del gene è più impegnativo. Ci sono una serie di barriere extra-intracellulari e che devono essere bypassato per conseguire efficace assorbimento cellulare dei reagenti esogeni. Ostacoli aggiuntivi includono la rapida clearance e la breve durata dei materiali 7,8 consegnato. Una strategia per aggirare questi problemi è quello di utilizzare vettori virali come &quot;portatori&quot; o &quot;veicoli&quot; per in vivo consegna del gene. Le proprietà di trasduzione naturalmente evoluti di virus consentono la fornitura efficiente di un gene di interesse in cellule 7,9,10. Numerosi tipi di vettori virali sono stati sviluppati e consentire flessibilità nella manipolazione genica in vivo in diversi tipi di cellule e organi topi. I sistemi virali più comunemente utilizzati includono Retrovirus, Lentivirus, Adenovirus, e adeno-associato virus (AAV) <sup&gt; 11. I retrovirus sono virus a singolo filamento di RNA e possono presentare il loro materiale genetico genoma della cellula ospite in modo stabile durante la divisione mitotica, fornendo la possibilità di espressione permanente dei geni trasdotte nelle cellule bersaglio e organi 12-14. Tuttavia, molti tipi di retrovirus infettano solo le cellule in divisione, e la loro efficacia in cellule non-divisione è molto bassa 15. Questo limita la loro utilità per la consegna del gene. Lentivirus è un genere della famiglia Retroviridae. Diverso da altri retrovirus, Lentivirus può infettare sia cellule in divisione e non di divisione ed è stato ampiamente utilizzato per il trasferimento genico in post-mitotico e cellule altamente differenziate-16. Il ciclo di vita di Lentivirus coinvolge anche l&#39;integrazione del DNA vettore nel genoma dell&#39;ospite. Gene delivery Così, Lentivirus-mediata consente espressione stabile e di lunga durata degli elementi genetici trasdotte 16-18. Tuttavia, questa caratteristica può rappresentare un doppio-espada dged nell&#39;uso di questi virus per manipolare l&#39;espressione genica, come integrazione di DNA vettoriale può portare a mutagenesi inserzionale nelle cellule ospiti e può causare effetti artefattuali. Adenovirus è un altro sistema di consegna del gene ampiamente utilizzato. A differenza dei retrovirus e lentivirus, Adenovirus sono non integrati e non interferiscono con l&#39;integrità genomica delle cellule ospiti 8,10,11,19. Inoltre, adenovirus può trasfezione di DNA in molti tipi di cellule, e l&#39;infezione non dipende divisione cellulare attiva 19. Un&#39;altra caratteristica importante di adenovirus è la facilità di purificazione vettoriale, come i vettori virali hanno la capacità di essere replicato 19,20. Tuttavia, l&#39;avvertimento importante di questo sistema è che l&#39;infezione da adenovirus può innescare forti risposte immunitarie cellule bersaglio e organi 19, limitando il suo utilizzo in molte indagini, in particolare studi di terapia genica. Rispetto a queste tipo diversos di vettori virali, virus ricombinante adeno-associato (rAAV) sembra essere il sistema di erogazione del gene ideale 21,22. Esibisce immunogenicità minimale e patogenicità 23,24. Inoltre, rAAV infetta una vasta gamma di tipi di cellule, inclusi sia demarcazione e cellule non-dividendo. Nella maggior parte dei casi, rAAV non si integra nel genoma di accoglienza; in tal modo, il rischio di cambiamenti genetici o genomiche indesiderate nelle cellule bersaglio è bassa 22. Recentemente, i sistemi rAAV sono stati utilizzati con successo per la consegna in vivo di proteine di codifica del DNA, miRNA, shRNAs, e CRISPR-gRNAs in un mouse muscolo cardiaco 23,25-29. Questa metodologia è facilitato ricerche fondamentali e studi di terapia genica nel campo della ricerca cardiovascolare. Qui, la procedura dettagliata per generare vettori rAAV9 che iperesprimono efficiente o Knockdown i geni di interesse nei cuori del mouse è stato descritto. Il protocollo fornisce un metodo semplice ed efficacemanipolazione genica cardiaca in modelli sperimentali murini.

<table><tbody><tr><td>Polyethylenimine, Linear (MW 25,000)</td><td>Polysciences, Inc.&amp;nbsp;</td><td>#23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Tube, Polypropylene, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (qty. 56)</td><td>Beckman Coulter, Inc</td><td># 362183</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease, ultrapure</td><td>SIGMA</td><td>#E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Density Gradient Medium(Iodixanol)</td><td>SIGMA</td><td>#D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>#UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory pipetting needle with 90&amp;deg; blunt ends,gauge 14, L 6 in., nickel plated hub</td><td>SIGMA</td><td>#CAD7942-12EA</td><td></td></tr><tr><td>Poloxamer 188 solution (Pluronic&amp;reg; F-68 solution)</td><td>SIGMA</td><td>P5556-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA</td><td>3115828001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge machine</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004260</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge System</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Atlanta Biologicals&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>rAAV9 vector</td><td>Penn Vector Core</td><td>P1967</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of raav9 to overexpress or knockdown genes in mouse hearts

Controllare l&#39;espressione o l&#39;attività di specifici geni attraverso la consegna del miocardio del materiale genetico in modelli murini permette l&#39;indagine delle funzioni dei geni. Il loro potenziale terapeutico nel cuore può anche essere determinato. Ci sono approcci limitati di intervento molecolare in vivo nel cuore del mouse. Ricombinante virus adeno-associato (rAAV) ingegneria del genoma basata su è stata utilizzata come uno strumento essenziale per in vivo manipolazione genetica cardiaco. I vantaggi specifici di questa tecnologia sono ad alta efficienza, alta specificità, basso tasso di integrazione genomica, minimal immunogenicità e patogenicità minima. Qui, una procedura dettagliata per la costruzione, il pacchetto, e purificare i vettori rAAV9 è descritto. L&#39;iniezione sottocutanea di rAAV9 in cuccioli neonatali traduce in espressione robusta o efficiente knockdown del gene (s) di interesse nel cuore del mouse, ma non nel fegato e in altri tessuti. Utilizzando la cardiaco-specific TnnT2 promotore, alta espressione del gene GFP nel cuore è stato ottenuto. Inoltre, mRNA è stato inibito nel cuore, quando un rAAV9-U6-shRNA è stato utilizzato. Lavorando conoscenza della tecnologia rAAV9 può essere utile per le indagini cardiovascolari.

Le strategie per la costruzione di rAAV9 rAAV9.cTNT :: plasmidi rAAV9.U6 :: shRNA GFP o sono riportati nelle figure rispettivamente 1 e 2,. Come dimostrano gli esempi, il vettore rAAV9 è stato generato per iperespressione del gene GFP nei cuori del mouse. Il plasmide risultante contiene la cTnT :: cassetta GFP affiancato da due ITR siti (Figura 1). Il vettore rAAV9.U6 :: shRNA è stato costruito per atterramento Trbp mR...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts at JoVE.com

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Preparazione di rAAV9 per iperespressione o Knockdown geni in Cuori mouse

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

preparation-of-raav9-to-overexpress-or-knockdown-genes-in-mouse-hearts

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

12.7K Views.  Boston Children's Hospital. In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described. 

Video: Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising treatment option for heart disease, owing to its efficiency and exceptional therapeutic effects. In an effort to repair the damaged tissue post-MI, various studies have employed DNA-based or viral gene therapy but have faced considerable hurdles due to the poor and uncontrolled expression of the delivered genes, edema, arrhythmia, and cardiac hypertrophy. Synthetic modified mRNA (modRNA) presents a novel gene therapy approach that offers high, transient, safe, nonimmunogenic, and controlled mRNA delivery to the heart tissue without any risk of genomic integration. Due to these remarkable characteristics combined with its bell-shaped pharmacokinetics in the heart, modRNA has become an attractive approach for the treatment of heart disease. However, to increase its effectiveness in vivo, a consistent and reliable delivery method needs to be followed. Hence, to maximize modRNA delivery efficiency and yield consistency in modRNA use for in vivo applications, an optimized method of preparation and delivery of modRNA intracardiac injection in a mouse MI model is presented. This protocol will make modRNA delivery more accessible for basic and translational research.

This protocol presents a simple and coherent way to transiently upregulate a gene of interest using modRNA after myocardial infarction in mice.

Consegna di mRNA modificato in un modello di topo di infarto miocardico

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Ricerca

Genetica

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Biologia

Transgenesi basata sull'elettroporazione di cellule cardiache in cuori di topo

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

Autore in primo piano: Transgenesi delle cellule cardiache per lo screening genico rapido

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Biologia dello sviluppo

Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and living organisms from a wide variety of species. The CRISPR technology has also been explored as novel therapeutics for a number of human diseases. Proof-of-concept data are highly encouraging as exemplified by recent studies that demonstrate the feasibility and efficacy of gene editing-based therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy (DMD) using a murine model. In particular, intravenous and intraperitoneal injection of the recombinant adeno-associated virus (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) has enabled efficient cardiac delivery of the Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9 (SaCas9) and two guide RNAs (gRNA) to delete a genomic region with a mutant codon in exon 23 of mouse Dmd gene. This same approach can also be used to knock out the gene-of-interest and study their cardiac function in postnatal mice when the gRNA is designed to target the coding region of the gene. In this protocol, we show in detail how to engineer rAAVrh.74-CRISPR vector and how to achieve highly efficient cardiac delivery in neonatal mice.

Here we provide a detailed protocol to carry out in vivo cardiac gene editing in mice using recombinant Adeno-Associated Virus(rAAV)-mediated delivery of CRISPR. This protocol offers a promising therapeutic strategy to treat dystrophic cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy and can be used to generate cardiac-specific knockout in postnatal mice.

Adeno-associato Virus-mediate consegna di CRISPR per Gene cardiaco nei topi di Editing

The clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system has greatly facilitated genome engineering in both cultured cells and ...

Medicina

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

In vitro Assessment of Cardiac Reprogramming by Measuring Cardiac Specific Calcium Flux with a GCaMP3 Reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), fibroblasts can be reprogrammed into induced cardiomyocytes (iCMs). These iCMs, when generated in situ in an infarcted heart, integrate electrically and mechanically with the surrounding myocardium, leading to a reduction in scar size and an improvement in heart function. Because of the relatively low reprogramming efficiency, purity, and quality of the iCMs, characterization of iCMs remains a challenge. The currently used methods in this field, including flow cytometry, immunocytochemistry, and qPCR, mainly focus on cardiac-specific gene and protein expression but not on the functional maturation of iCMs. Triggered by action potentials, the opening of voltage-gated calcium channels in cardiomyocytes leads to a rapid influx of calcium into the cell. Therefore, quantifying the rate of calcium influx is a promising method to evaluate cardiomyocyte function. Here, the protocol introduces a method to evaluate iCM function by calcium (Ca2+) flux. An &#945;MHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 mouse strain was established by crossing Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (referred to as Myh6-Cre below) with Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referred to as Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 below) mice. Neonatal cardiac fibroblasts (NCFs) from P0-P2 neonatal mice were isolated and cultured in vitro, and a polycistronic construction of MGT was introduced to NCFs, which led to their reprogramming to iCMs. Because only successfully reprogrammed iCMs will express GCaMP3 reporter, the functional maturation of iCMs can be visually assessed by Ca2+ flux with fluorescence microscopy. Compared with un-reprogrammed NCFs, NCF-iCMs showed significant calcium transient flux and spontaneous contraction, similar to CMs. This protocol describes in detail the mouse strain establishment, isolation and selection of neonatal mice hearts, NCF isolation, production of retrovirus for cardiac reprogramming, iCM induction, the evaluation of iCM Ca2+ flux using our reporter line, and related statistical analysis and data presentation. It is expected that the methods described here will provide a valuable platform to assess the functional maturation of iCMs for cardiac reprogramming studies.

We describe here, the establishment and application of an Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (referred to as &#945;MHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 below) mouse reporter line for cardiac reprogramming assessment. Neonatal cardiac fibroblasts (NCFs) isolated from the mouse strain are converted into induced cardiomyocytes (iCMs), allowing for convenient and efficient evaluation of reprogramming efficiency and functional maturation of iCMs via calcium (Ca2+) flux.

Valutazione in vitro della riprogrammazione cardiaca mediante misurazione del flusso di calcio specifico cardiaco con un GCaMP3 Reporter

Cardiac reprogramming has become a potentially promising therapy to repair a damaged heart. By introducing multiple transcription factors, including ...

Silenziamento genico selettivo nel plesso coroideo

Targeted Knockdown of Genes in the Choroid Plexus

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and pathological conditions. Recent research has shown that regulating ChP activity may offer protection against CNS disorders. However, studying the biological function of the ChP without affecting other brain regions is challenging due to its delicate structure. This study presents a novel method for gene knockdown in ChP tissue using adeno-associated viruses (AAVs) or cyclization recombination enzyme (Cre) recombinase protein consisting of TAT sequence (CRE-TAT). The results demonstrate that after injecting AAV or CRE-TAT into the lateral ventricle, the fluorescence was exclusively concentrated in the ChP. Using this approach, the study successfully knocked down the adenosine A2A receptor (A2AR) in the ChP using RNA interference (RNAi) or Cre/locus of X-overP1 (Cre/LoxP) systems, and showed that this knockdown could alleviate the pathology of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This technique may have important implications for future research on the ChP's role in CNS disorders.

Autore in primo piano: Approfondimenti e innovazioni nelle tecniche di manipolazione dell'espressione genica per la ricerca sul plesso coroideo 

Here, we describe a method to selectively alter gene expressions in the choroid plexus while avoiding any impact in other brain areas.

Knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo

The choroid plexus (ChP) serves as a critical gateway for immune cell infiltration into the central nervous system (CNS) under both physiological and ...

Preparazione di rAAV9 per iperespressione o Knockdown geni in Cuori mouse

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Consegna di mRNA modificato in un modello di topo di infarto miocardico

L'isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo

Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo

Un approccio efficiente alla transgenesi per la consegna genica nel cuore embrionale di topo

Adeno-associato Virus-mediate consegna di CRISPR per Gene cardiaco nei topi di Editing

Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse

Valutazione in vitro della riprogrammazione cardiaca mediante misurazione del flusso di calcio specifico cardiaco con un GCaMP3 Reporter

Knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo

Knockdown mirato dei geni nel plesso coroideo