This work was funded by MRC grant MC.PC_13052.

<ol>
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The authors declare they have no competing financial interests.

Descriviamo l&#39;uso di barriere impermeabili per evitare formazione di gemme arto in embrione di pollo. Questa tecnica ha un numero di passaggi critici. A seguito di esperimenti preliminari, abbiamo scoperto che le forma di cerniera barriere utilizzati in 9, 10 restano in vigore nell&#39;embrione molto meglio di barriere diritte. Il lato piatto distale della barriera attacca alla membrana vitellina e mantiene la barriera in posizione (Figura 2C &#39;). Una preparazione accurata di cerniera barriere sagomati di un foglio di alluminio come descritto al punto 1.6 del protocollo è essenziale per il successo dell&#39;operazione. Un secondo passo importante è quello di garantire che le uova non sono lasciati fuori dell&#39;incubatore per troppo tempo in seguito a finestre e messa in scena prima di operare su l&#39;embrione. Nella nostra esperienza, embrioni sopravvivono un&#39;operazione meglio se sono in prossimità o temperatura di incubazione quando l&#39;operazione viene eseguita. Le operazioni dovrebbero quindi essere effettuate il più rapidamente possibile e le uova risigillati prontamente per garantire i tassi di sopravvivenza buoni. Molti ricercatori aggiungere una goccia di antibiotici per l&#39;embrione seguente microchirurgia prima di ritornare le uova per l&#39;incubatore. La presenza del liquido impedito le barriere di attaccarsi bene in posizione. L&#39;aggiunta di antibiotici potrebbe anche rimuovere perline dopo il posizionamento. Quindi non l&#39;uso di antibiotici, le operazioni veloci e buona la pulizia con strumenti si raccomanda di evitare l&#39;infezione. Pulendo strumenti con il 70% di etanolo dopo ogni fase di un&#39;operazione è essenziale per prevenire gli strumenti di diventare appiccicoso dal contatto con la membrana vitellina che può causare sia barriere o perline di aderire alla pinza (vedere il passaggio del protocollo 3.1.2.2). Entrambe le varietà di perline usati potrebbero cadere fuori luogo dopo l&#39;operazione. Quando la posizione barriera è stata verificata il giorno successivo non era possibile vedere attraverso la barriera di verificare se il tallone è rimasto in luogo o meno. Nei casi in cui il tallone era caduto ala gemma conseguenza non è stato salvato ( <strong&gt; Tabella 1). Evitare il trasferimento di liquido con il tallone, quando l&#39;impianto di loro significa che le microsfere attaccano più facilmente al volto taglio della LPM (vedi protocollo 2.3.2.3). Infine assicurando che gli embrioni sono fissati immediatamente dopo la raccolta è fondamentale per una buona successive analisi di espressione genica (vedere il passaggio del protocollo 4.2). Questo protocollo modifica esperimenti precedentemente pubblicati che hanno usato le barriere per impedire arto iniziazione gemma, definisce specifiche larghezze ottimali per le barriere e introduce la combinazione di barriera e il posizionamento tallone seguita da analisi di espressione genica. Abbiamo trovato con un foglio di alluminio convenzionale, che è a buon mercato e facilmente reperibili in tutti i laboratori, produce risultati uguali a quelli che in precedenza utilizzati fogli di tantalio. Il foglio può essere lasciato nell&#39;embrione quando effettuano ibridazione in situ (Figura 2C &#39;) ma di solito rimuoverlo se più di un embrione viene elaborato per evitare gli spigoli della lamina danneggiare embrioni. PStudi Ilot dimostrato che la larghezza della regione gamba barriere è particolarmente importante. Inizialmente le barriere trialed erano troppo breve e escrescenza gamba germoglio non è stato impedito. 1,2-1,3 mm è la larghezza ottimale per una barriera per bloccare completamente escrescenza germoglio gamba. Le barriere ala più stretti che si può collocare con precisione per evitare conseguenza gemma danno i migliori tassi di sopravvivenza. Questo può essere il più stretto 0,5-0,7 mm. Tuttavia, le barriere che sono un po &#39;più ampio hanno maggiori probabilità di tradursi in completo blocco di ala escrescenza gemma perché consentono per un po&#39; di imprecisione di posizionamento (abbiamo usato 0,7-1 mm). Prevenzione dei vasi sanguigni quando si effettua l&#39;incisione è fondamentale per le barriere a livello dell&#39;ala nascere. barriere semi-permeabili sono state precedentemente utilizzato per tagliare in due la gemma pulcino arto. MacCabe e Parker, 1976 e Summerbell 1979 filtri sia utilizzato 0,45 micron e 0,8 micron di dimensione dei pori, rispettivamente, 16, 17. Essi hanno riferito che i segnali diffusibili potrebbero passare attraverso i pori nei filtri e chei risultati hanno guadagnato con barriere semi-permeabile erano a metà strada tra un bocciolo arto con alcuna barriera presente e uno con una barriera foglio di tantalio impermeabile. Questo protocollo potrebbe essere adattato per usare barriere semipermeabili di varia dimensione dei pori di differenziare segnali candidati in base alle dimensioni o per modificare la dinamica di diffusione del segnale. Questo protocollo ha varie limitazioni principalmente associati al modello organismo stesso. Tali tecniche potrebbero essere utilizzati per sondare ulteriori domande in fase di sviluppo degli arti e anche altre questioni di embriogenesi dei vertebrati. Una condizione è che l&#39;organo / area in questione dovrebbe essere in via di sviluppo quando l&#39;embrione pulcino è accessibile a un intervento. La presenza di grandi vasi sanguigni nella zona in cui una barriera deve essere posizionato rende il posizionamento barriera dopo le fasi 13 o 14 tecnicamente impegnativo. Se grandi vasi sanguigni sono tagliati durante il posizionamento barriera questo può causare la mortalità embrionale. La nostra indagine di quando i fattori di trascrizione TBX5 e Tbx4 vengono prima indotte nel LPM è stata limitata dalla prima fase in cui potremmo mettere una barriera che avrebbe poi finire opposta sia l&#39;ala o un batuffolo di gamba, rispettivamente. Potrebbe essere illuminante per tentare di bloccare TBX induzione genica nelle fasi precedenti, più vicino alla gastrulazione. La prima barriera potrebbe essere collocato nella regione fascia presuntiva era successo fase 8 e nella fase zona della gamba 10. Questo protocollo non è probabilmente adatto per lo studio dell&#39;espressione genica oltre fasi arto germoglio perché successiva crescita rapida sposterebbe la barriera e risultati concerne solo alla posizione iniziale della barriera. Dopo aver correlate i limiti del embrione di pollo in questo contesto, i suoi vantaggi rispetto ad altri organismi modello vertebrati sono molti. L&#39;embrione di pollo è un modello animale molto adatto per questo tipo di intervento fisico in un embrione vertebrato. Gli embrioni sono relativamente grandi e sono facilmente accessibili throuGH guscio d&#39;uovo. Si può tornare all&#39;embrione per ulteriori sperimentazioni (ad esempio, la rimozione di un cordone 18 o anche una barriera) o per verificare progresso semplicemente rimuovendo la finestra del nastro. Non è possibile campo di applicazione alle immagini dal vivo o l&#39;imaging lasso di tempo. Descriviamo un metodo di windowing uova di gallina che è particolarmente adatto per operare su embrioni in fase iniziale. Nel caso di studi degli arti è molto importante ed utile che ci sia un arto di controllo controlaterale per ogni esperimento che serve come controllo interno ideale per ogni replica biologica. La combinazione di utilizzo di barriere impermeabili per evitare arto conseguenza e perline imbevuto di molecole di segnalazione non è stata segnalata in precedenza. La nostra analisi di espressione dell&#39;mRNA a seguito di tali interventi è anche romanzo. Queste tecniche ci hanno permesso di sezionare il difficile problema di quando specifici fattori di trascrizione degli arti Tbx5 e Tbx4 sono indotti nel LPM e ancheper dimostrare che successivamente, prima dell&#39;inizio arto germoglio, la presenza di questi geni tbx nel LPM non è sufficiente per l&#39;attivazione di FGF10 trascrizione e l&#39;inizio di conseguenza arto gemma. Figure 2G, 2D e 2E illustrano bene questi risultati. L&#39;assenza di espressione Tbx4 seguito dell&#39;inserimento di una barriera nella fase 10 nella figura 2G è in netto contrasto con la sua presenza in 2D e 2E seguente inserimento facilitato nella fase 15, dopo l&#39;induzione di Tbx4. L&#39;impianto di perline RA imbevuti facilitato il salvataggio di arto iniziazione gemma dopo l&#39;inserimento di barriera e così indica RA dai somiti che sono essenziali nel LPM prima arto gemma conseguenza può iniziare. Tali tecniche potrebbero essere usate per risolvere ulteriori domande in fase di sviluppo degli arti, ma anche altre questioni di vertebrati embriogenesi. Aree del cervello, occhio e tronco sono suscettibili di essere adatto.

embriologi classici tradizionalmente impiegate tecniche fisiche per interrogare i meccanismi che controllano lo sviluppo embrionale. Negli anni 1960 e 1970 ricercatori hanno sviluppato tecniche che hanno usato le barriere impermeabili inseriti tra i tessuti dell&#39;embrione in via di sviluppo per dimostrare l&#39;importanza dei segnali induttivi durante l&#39;embriogenesi. Il nostro interesse è in vertebrati sviluppo degli arti e, in particolare, quali eventi precedono escrescenza arto gemma. Ad esempio, l&#39;inserimento di una barriera può impedire arto gemma conseguenza di verificarsi su un lato del embrione di pollo pur consentendo di procedere normalmente sul lato non operato controlaterale. I materiali utilizzati per rendere queste barriere vario; per esempio, piastre di mica 1 e tantalio lamina 2. Queste barriere separano efficacemente la piastra mesoderma laterale (LPM), da cui le forme arto germoglio, dai somiti formano dalla mesoderma parassiale. tecniche di innesto chirurgico dimostrano che stretta associazione ingegnoh la somiti è essenziale se iniziazione arto germoglio deve avvenire nel LPM 3 4. Negli anni &#39;80 e &#39;90 biologi dello sviluppo hanno scoperto diffusibile molecole che sono essenziali nel controllo dei processi di sviluppo di segnalazione. Perle imbevuti di queste molecole di segnalazione possono essere impiantati in specifiche regioni del dell&#39;embrione e produrre alterazioni dello sviluppo embrionale. Ad esempio, l&#39;acido retinoico (RA) ripresa da perle di scambio ionico viene rilasciato per un periodo di 24 ore quando impiantato in un embrione di pollo e può produrre speculare la duplicazione delle cifre 5. Eparina perline acrilici contenenti proteine FGF possono avviare arto gemma conseguenza dal interlimb LPM 6. Più di recente il mouse e pesce genetica hanno preso lo studio dei vertebrati arto iniziazione in una nuova era (rivisto in 7). Ci sono buone evidenze che RA presente nei somiti prima dell&#39;inizio arto gemma è il segnale diffusibile essenziale, prevista dal LPM per avviare arto in erba. Abbiamo voluto sfruttare l&#39;accessibilità e la robustezza sperimentale del embrione di pollo di sezionare l&#39;effetto di sbarramento dell&#39;impianto sull&#39;espressione genica nel LPM intorno al periodo di iniziazione arto gemma. Un romanzo adattamento del nostro metodo è quello di combinare una barriera che blocca i segnali dai tessuti assiali con posizionamento tallone laterale alla barriera esogenamente fornitura candidati fattori endogeni che sono stati bloccati dalla barriera. I seguenti protocolli sono quelli sviluppati per prendere in giro i meccanismi di induzione arto gemma e l&#39;iniziazione. Studiare iniziazione arto gemma significa usare embrioni dello stadio precoce. Molte uova di gallina finestra ricercatori di primo rimuovendo alcune dell&#39;albumina attraverso la sacca d&#39;aria con un ago ipodermico. L&#39;embrione, che si trova sulla parte superiore del tuorlo, poi giacere inferiore nell&#39;uovo. Questo è un vantaggio per alcune tecniche, come l&#39;elettroporazione, ma può essere uno svantaggio se manipolazione chirurgica dell&#39;embrione è desiderato.Troviamo avendo l&#39;embrione come vicino all&#39;apertura nell&#39;uovo possibile è un vantaggio. Le domande rimangono per quanto riguarda i segnali che controllano vertebrati arto induzione gemma e l&#39;iniziazione e le seguenti protocolli sono adatti per affrontarle. Siamo i primi a sviluppare un protocollo per l&#39;inserimento di barriere per impedire pulcino arto gemma conseguenza in una fase precedente alla fase 12 8. versioni modificate di questi protocolli potrebbero essere utilizzati anche per affrontare altre questioni sull&#39;origine e la tempistica di segnali induttivi in ​​cui un tessuto Induzione accessibili si trova adiacente al primordio essere indotta. Purché la regione dell&#39;embrione è accessibile in fase di sviluppo rilevante, quindi una barriera potrebbe essere inserito tra i due tessuti e conseguenti cambiamenti nello sviluppo studiati. Esempi possono essere trovati in sviluppo del cervello, estensione dell&#39;asse e sviluppo possibilmente organo come fegato o reni induzione.

<table><tbody><tr><td>Dumont No. 5 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No. 4 watchmakers forceps, x2</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont strong forceps, type AA</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>11210-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved scissors with blades 2.5 cm long</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>14061-11</td><td></td></tr><tr><td>Blunt ended curved forceps, ends approx 0.5&amp;nbsp;cm long</td><td>Fine Science Tools www.finescience.de</td><td>11065-07</td><td></td></tr><tr><td>Steel pin, 0.2 mm wide</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Sharpening stone, square</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>29008-01</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp; www.finescience.de</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Clear tape, 50 mm x 66&amp;nbsp;m</td><td>www.5staroffice.com</td><td>295985</td><td></td></tr><tr><td>FGF4 protein</td><td></td><td></td><td>A gift from Cliff Tabin.</td></tr><tr><td>all-trans-retinoic acid</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>R2625-50MG</td><td>Remember to protect from light.</td></tr><tr><td>BMS 493</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>B6688-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel blade No. 15</td><td>www.swann-morton.com</td><td>cat no. 0105</td><td></td></tr><tr><td>Affi-Gel Blue, affinity chromatography gel</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>153-7301</td><td>Beads for delivering protein.</td></tr><tr><td>AG1-X2 Ion exchange resin</td><td>Bio-Rad www.bio-rad.com</td><td>140-1251</td><td>Beads for delivering RA or BMS 493.</td></tr><tr><td>Incubator for eggs</td><td>Memmert www.hce-uk.com</td><td>LAB128</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>P6148-1KG</td><td>Harmful, irritant, corrosive.&amp;nbsp; Handle powder in fumehood with full protective clothing.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma www.sigmaaldrich.com</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose</td><td>Gibco www.thermofisher.com</td><td>41965-039</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific webshop.fishersci.com</td><td>D/4121/PB08</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Binocular Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica www.leica-microsystems.com</td><td>MZ6</td><td>Replaced by M60</td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Henry Stewart &amp;amp; Co Ltd sales@medeggs.com</td><td></td><td>Brown Eggs</td></tr></tbody></table>

application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick

L&#39;embrione pulcino fornisce un modello vertebrato superba che può essere utilizzato per sezionare domande di sviluppo in modo diretto. La sua accessibilità e la robustezza dopo l&#39;intervento chirurgico sono importanti punti di forza sperimentali. Piatti Mica sono state le prime barriere usati per prevenire pulcino arto gemma iniziazione 1. Protocolli che utilizzano un foglio di alluminio come una barriera impermeabile al germoglio ala o induzione gamba gemma e l&#39;iniziazione o sono descritti. Uniamo questa tecnica con posizionamento tallone laterale alla barriera esogenamente fornitura candidati fattori endogeni che sono stati bloccati dalla barriera. I risultati vengono analizzati mediante ibridazione in situ della successiva espressione genica. Il nostro obiettivo principale è il ruolo della segnalazione dell&#39;acido retinoico nella induzione e iniziazione successiva alla ribalta embrione di pollo e degli arti posteriori. Usiamo BMS 493 (un agonista inverso di recettori dell&#39;acido retinoico (RAR)) perline bagnati impiantati nella piastra laterale mesoderma (LPM) per simulare l&#39;effetto di un barrier posto tra i somiti (una fonte di acido retinoico (RA)) e la LPM da cui gemme degli arti crescono. versioni modificate di questi protocolli potrebbero essere utilizzati anche per affrontare altre questioni sull&#39;origine e la tempistica di spunti induttivi. Purché la regione di embrione di pollo è accessibile in fase di sviluppo rilevante, una barriera potrebbe essere inserito tra i due tessuti e conseguenti cambiamenti nello sviluppo studiati. Esempi possono essere trovati nel cervello di sviluppo, l&#39;estensione dell&#39;asse e nello sviluppo di organi, come il fegato o il rene induzione.

Il protocollo descritto sopra descritti i metodi utilizzati per Nishimoto et al. 2015. Il documento studia arti induzione gemma e l&#39;iniziazione sia in primo piano e arti posteriori del embrione di pollo. I risultati dopo l&#39;inserimento di barriere impermeabili per evitare la conseguenza della gemma zampa anteriore sono stati pubblicati in precedenza 1, 2, 9, ma c&#39;è stato solo uno studio che descrive gli ostacoli che impediscono la gamba gemma iniziazione 1. I dati degli arti posteriori da Nishimoto et al. 2015 sono presentati qui come risultati rappresentativi dello studio di espressione di mRNA seguenti inserimento di barriera. Tbx4 ​​Espressione nella LPM non è sufficiente ad avviare degli arti posteriori escrescenza: Figure 2B e C (Tabella 2) mostra che l&#39;inserimento facilitato nella fase 15 (Figura 2A) (vedi protocollo 3.2) porta ad entrambi FGF10ed espressione Fgf8 assente nella zona della gamba germoglio (indicato con staffa) sul lato destro operato. Confronto con il lato non operato di sinistra. Tuttavia, l&#39;espressione Tbx4 è osservata sia fase 19 e la fase 23 sul lato operato (Figura 2D e E). Concludiamo che l&#39;espressione Tbx4 da sola non è sufficiente per avviare degli arti posteriori escrescenza dal LPM. Altri studi nel pulcino hanno suggerito che l&#39;espressione TBX gene è sufficiente per avviare la formazione degli arti anteriori gemma 12, 13. Figura 2C &#39;è incluso per illustrare come una barriera sembra inserita in regione tappa del fissaggio dell&#39;embrione palo. Nella maggior parte dei casi ostacoli sono stati rimossi prima ibridazione in situ (protocollo 4.3). RA dalle Somiti è essenziale nel LPM prima FGF10 Induce Limb Bud Outgrowth: La figura 3A è uno schema che rappresenta l&#39;aggiunta di un distale tallone RA imbevuto di una barriera inserita nella fase 15 (protocollo 3.2.1.3). Successivamente a tale operazione escrescenza arto gemma (contrassegnata da un asterisco) si osserva sul lato destro gestito e Tbx4, FGF10 e Fgf8 sono espressi sul nascere come sono nel lato di comando sinistra (Figura 3B, C e D, tabella 2) . Così aggiunta di RA al LPM supera l&#39;effetto barriera e degli arti procede iniziazione gemma. Abbiamo concluso che in normali RA sviluppo dal somiti è essenziale nella LPM prima conseguenza arto gemma può essere avviata. I germogli arti posteriori risultanti sono generalmente più piccoli di quelli sul lato di controllo. Ciò può essere dovuto alla dose RA nella LPM non essendo equivalente alla situazione wild type. Se la dose RA è troppo alto il apicale ectodermica Ridge (ARE) può essere abbreviato e boccioli più piccoli si tradurrebbe14, 15. Per confermare che RA (dai somiti) nella LPM è necessaria per la normale iniziazione arto gemma un agonista inverso di RAR, BMS 493, è stato utilizzato. Beads vengono impiantati nella regione LPM gamba allo stadio 15 (vedi protocollo 3.2.1.4) (Figura 3E). Espressione FGF10 è downregulated seguente applicazione di BMS 493 perline in LPM, con conseguente più piccole gemme arti posteriori rispetto al lato di controllo (Figura 3F; Tabella 3). Le sfere di controllo DMSO non causano questi difetti (Figure 3G e 3H; Tabella 3). I difetti osservati dopo l&#39;applicazione BMS 493 sono più miti rispetto a quelli indotti da un&#39;operazione di sbarramento; vale a dire, FGF10 è ancora espresso e si formano gemme degli arti. Questo è probabilmente perché gli effetti di BMS 493 sono limitate a livello locale intorno alle perline e potrebbero non essere in grado di antagonizzare tutto il RA prodotto da axiAl tessuti. All&#39;inizio Segnali assiali Specificare le cellule LPM che espresso poi Tbx4: Abbiamo testato quando il LPM acquisisce la sua capacità di esprimere Tbx4 nella regione prospettico gamba di formazione. La prima fase in cui un ostacolo può essere inserito che saranno successivamente bloccare gamba gemma conseguenza, è palcoscenico 10. Siamo i primi a sviluppare un protocollo per inserire le barriere nelle fasi precedenti alla fase 12. Le barriere inseriti tra il mesoderma parassiale e la gamba presuntiva LPM nella fase 10 (vedi protocollo 3.4) formazione di gemme blocco gamba e l&#39;espressione del Tbx4 alla gamba formazione LPM (figure 2F e 2G, Tabella 2), suggerendo che un segnale da tessuti assiali nella fase 10 è necessaria per l&#39;espressione successiva Tbx4 in hindlimb LPM. Confrontare questo risultato con le figure 2D e E dove l&#39;inserimento di barriera in seguito permette l&#39;espressione Tbx4da stabilire. Inoltre, abbiamo testato se questo segnale assiale potrebbe essere RA osservando se l&#39;agonista inverso di RAR riduce espressione Tbx4. Un BMS 493 tallone collocato nella LPM arti posteriori allo stadio 10 (vedi protocollo 3.4.1.3) diminuisce l&#39;espressione Tbx4 (figure 2H e 2I), mentre sfere di controllo imbevuti di DMSO non influenzano l&#39;espressione Tbx4 (figure 2J e 2K). Insieme, questi risultati supportano un modello che un segnale RA dai tessuti assiali regola induzione arto regolando positivamente Tbx4 in arti posteriori LPM 7. La morte post-operatorio: Tabelle 1, 2 e 3 forniscono dettagli di risultati sperimentali, tra cui il numero di embrioni di pollo, che è morto post operazione e prima della raccolta. Alcuni decessi sono da aspettarsi dopo microchirurgia di questa natura. La morte numeri può essere mantenuto<html> al minimo facendo in modo che gli strumenti sono pulite, il foro nell&#39;uovo è la dimensione minima richiesta, che gli embrioni sono lasciati senza la protezione della guarnizione nastro adesivo per un tempo minimo e, in combinazione con questo ultimo punto che l&#39;operazione viene effettuata il più rapidamente possibile. Nessuna di queste operazioni sono molto in termini di tempo, ma le operazioni che coinvolgono perline e barriere prendere un po &#39;più di tempo. Nonostante queste misure, le operazioni effettuate nelle prime fasi e quelle della regione dell&#39;ala hanno maggiori probabilità di provocare la morte. Ci sono grandi vasi sanguigni intorno alle regioni degli arti di formazione e la rottura accidentale di questi vasi possono portare alla morte a causa di perdita di sangue. Troviamo che le uova aperte in fase di 8 o 9, in cui gli embrioni non sono stati operati, spesso muoiono entro il giorno successivo. Pertanto, l&#39;unica soluzione a questi problemi è di effettuare un elevato numero di esperimenti. d / 54618 / 54618fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Marker I cambiamenti di espressione genica seguenti barriera o tallone di inserimento presuntiva Leg livello. (A) posizione mostra Schema barriera (linea verde) a livello delle gambe presuntiva (somiti 26-32) in una fase embrionale 15. (B - E e G) analisi WISH sugli embrioni gestite. La regione gamba è delineato (parentesi). (B) l&#39;espressione FGF10 è assente nel LPM operato, ma l&#39;espressione robusto viene rilevato sul nascere sinistra. (C) espressione Fgf8 è assente nel lato operato, suggerendo non c&#39;è AER. (C &#39;) Lo stesso embrione prima della barriera è stato rimosso. (D) Tbx4 è espresso nel LPM allo stesso livello rostro-caudale come il germoglio di controllo. (E) espressione Tbx4 è mantenuto nella regione gamba destra nonostante assenza di crescita dell&#39;arto. (F) Schema di uno stadio<html> 10 embrionali di pollo mostrando posizione di barriera (linea verde) a livello della gamba presuntiva. (G) espressione Tbx4 è assente nel operato destra LPM (staffa). (H) Schema di uno stadio 10 embrionali di pollo mostrando BMS 493 posizione tallone (cerchio viola) a livello della gamba presuntiva. (I) espressione Tbx4 è inibiti sul lato destro azionato dopo trattamento con BMS 493. (J) Schema di uno stadio 10 embrionali di pollo che mostra controllo di posizione DMSO tallone (cerchio grigio). (K) Tbx4 è espresso sul lato destro funzionare ad un livello simile a quello del controllo laterale sinistra seguendo trattamento con solo DMSO. Questa cifra è stata modificata da 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> d / 54618 / 54618fig3.jpg &quot;/&gt; Assenza Figura 3. RA Rescues Limb di Bud causato dalla Barriera inserimento ed è essenziale nel LPM Prima di Leg Bud escrescenza. (A) Schema che indica la posizione di barriera (linea verde) a livello della gamba presuntiva (somiti 26-32) ed un tallone RA-imbevuto (cerchio rosso). (B - D) RA salvataggi escrescenza gamba gemma (indicato da un asterisco). (B) l&#39;espressione Tbx4 è presente sul nascere gamba salvato simile al lato non-operato. (C) FGF10 è espressa nella gamba salvato gemma simile al lato non-operato. (D) Fgf8 si esprime nella AER della gemma gamba destra in salvo. (E) Schema che indica dove BMS 493 perline (cerchi viola) sono stati collocati in una gamba LPM presuntiva di fase 15 embrioni. (F) espressione FGF10 è downregulated sul lato destro gestito e il bocciolo gamba è piccolo BMS 49 segue3 trattamento. Beads sono asterisco. (G) schematica simile a (E), che indica la posizione di controllo DMSO perline (cerchi grigi). (H) perle di DMSO (indicati con un asterisco) non ha modificato l&#39;espressione FGF10 o dimensione gamba gemma. Questa cifra è stata modificata da 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54618/54618fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Barriera Fase posto (+ tallone) * </td><td> numero operato </td><td> Ala mancante ** </td><td> Ala presente ** </td><td> numero morti </td></tr><tr><td> fase 12-14 </td><td> 40 </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> fase 8/9 </td><td> 65 </td><td> 23 </td><td> 0 </td><td> 42 </td></tr><tr><td> Fase 12-13 (FGF4 tallone) </td><td> 41 </td><td> 7 (mancante tallone) </td><td> 17 </td><td> 17 </td></tr><tr><td> Fase 12-13 (RA tallone) </td><td> 75 </td><td> 9 (mancante tallone) </td><td> 32 </td><td> 34 </td></tr><tr><td> Tappa 13 (microsfera di controllo) </td><td> 5 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 2 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 0,7-1 mm barriere stagnola poste tra somiti 15-20 e la piastra mesoderma laterale. 0,35 mg / ml tallone FGF4. 0,05-0,1 mg / ml tallone RA. </td></tr><tr><td colspan="5"> microsfera di controllo DMSO. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** fasi embrioni di pollo fisse 21-23 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Ala Livello barriera e Experiment Bead risultati. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Barriera Fase posto (+ tallone) * </td&gt; <td> numero operato </td><td> Leg mancante ** </td><td> Leg presente ** </td><td> numero morti </td></tr><tr><td> fase 12-15 </td><td> 43 </td><td> 39 </td><td> 0 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> fase 10/11 </td><td> 23 </td><td> 16 </td><td> 0 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> Fase 15 (tallone FGF4) </td><td> 8 </td><td> 0 </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Fase 15 (tallone RA) </td><td> 18 </td><td> 0 </td><td> 18 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 0,7-1,3 mm barriere stagnola poste tra somiti 26-32 e la piastra mesoderma laterale. 0,35 mg / ml tallone FGF4. 0,05-0,1 mg / ml tallone RA. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** fasi embrioni di pollo fisse 18-24 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Leg Barriera e Bead Esperimento risultati. <table border = &quot;1&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot; fo: keep-con-next.within-page = &quot;always&quot;&gt; <tbody><tr><td> numero operato </td><td> Leg gemma piccola </td><td> Leg gemma po &#39;piccolo </td><td> Leg gemma dimensioni normali </td><td> numero morti </td></tr><tr><td> BMS 493 perline * </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 </td><td> 12 </td><td> 3 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> perline DMSO ** </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 12 </td><td> 0 </td><td> 3 </td><td> 9 </td><td> 0 </td></tr><tr><td colspan="5"> * 2-3 perline imbevute di 5 mg / ml BMS 493 collocati nella giusta fase 14-15 LPM a livello della gamba. </td></tr><tr><td colspan="5"> ** 2-3 perline imbevute di DMSO solo collocati nella giusta fase 15 LPM a livello delle gambe. </td></tr><tr><td colspan="5"> embrioni di pollo fissati nelle fasi 17-19. </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Leg livello BMS 493 Bead Experiment risultati.

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Application of Impermeable Barriers Combined with Candidate Factor Soaked Beads to Study Inductive Signals in the Chick

Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

L&#39;applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

The chick embryo provides a superb vertebrate model that can be used to dissect developmental questions in a direct way. Its accessibility and robustness ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K Views.  King's College London, Guy's Campus. Protocols using impermeable barriers to block induction events between tissues of the main body axis and flank in the chick embryo required for limb formation are described. Beads soaked in candidate inductive signals are used to overcome the effect of barrier placement and analysis of gene expression confirms this.

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Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

Ottimizzato<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Coltura di Chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

L&#39;innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l&#39;espressione genica

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Posizionamento Growth Factor-Coated Perline su embrioni di pollo Stadio

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Biologia

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Time-lapse imaging di Chick primi embrioni

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying the formation and initial patterning of the nervous system. This video demonstrates how to graft organizer tissue into a host, a method by which Hensen s node (the organizer in the chick embryo) is grafted to a host competent ectoderm. The organizer graft instructs overlying na ve tissue to adopt a neural fate via neural inducing signals. This mechanism is referred to as neural induction, and constitutes the initial step in the formation of brain and spinal cord in amniotes. This method is essentially used for the characterization of putative neural inducing molecules in chick. This video demonstrates the different steps in the assay for neural induction; First, the donnor embryo is explanted and pinned on a dish. Then, the host embryo is prepared for New culture. The graft is excised and transplanted to the host area pellucida margin. The host is cultured for 18-22 hrs. The assembly is fixed and processed for further applications (e.g. in situ hybridization). This method was originally devised by Waddington 1,2 and Gallera 3,4.

Neural induction is the first step in the formation of the brain. It is a mechanism by which Hensen's node (organizer), instructs adjacent tissue to adopt a neural fate, i.e. to give rise to the nervous system. This video demonstrates an assay for neural induction in chick embryo.

Test di induzione neurale nell&#39;embrione Chick

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Neuroscienze

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

Cella Transfection singola in embrioni di pollo

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of somatic cells, tissues, and organs. The precise activation of these genetic programs is regulated by morphogens, diffusible molecules that direct cell fate at different thresholds. Understanding how genetic activation coordinates morphogenesis requires the study of local interactions triggered by morphogens during development. The use of beads soaked in proteins or drugs implanted into distinct regions of the embryo enables studying the role of specific molecules in the establishment of digits and other developmental processes. This experimental technique provides information on the control of cell induction, cell fate, and pattern formation. Thus, this soaked bead assay is an extremely powerful and valuable experimental tool applicable to other embryonic models.

The soaked bead assay involves targeted delivery of test reagent at any developmental time point to study the regulation of cell differentiation and morphogenesis. A detailed protocol, applicable to any experimental animal model, for preparing three different types of soaked beads and implanting these in the interdigit of a chicken embryo is presented.

Analisi della differenziazione cellulare, della morfogenesi e del pattern durante l'embriogenesi del pollo utilizzando il test Soaked-Bead

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

L'applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Ottimizzato

L'innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l'espressione genica

Posizionamento Growth Factor-Coated Perline su embrioni di pollo Stadio

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine

Test di induzione neurale nell'embrione Chick

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

Cella Transfection singola in embrioni di pollo

Analisi della differenziazione cellulare, della morfogenesi e del pattern durante l'embriogenesi del pollo utilizzando il test Soaked-Bead

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

La valutazione delle proprietà di segnalazione di ectodermica epiteli durante lo sviluppo craniofacciale