The authors would like to thank all the members of the "Insect Genetics and Genomics" Laboratory, in particular to Lorenzo Ghiringhelli who has worked at developing, adapting and maintaining the rearing of the medfly over the past thirty years. Part of the representative results of this paper have been reprinted from N. Biotechnology, 25(1) by Scolari F. et al., Fluorescent sperm marking to improve the fight against the pest insect Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, with permission from Elsevier (License number 3796240759880). This work received support from Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

1. set-up sperimentale <ol><li> requisiti insectary <ol><li> Mantenere tutto C. vita capitata in scena a 25 ° C, 65% di umidità e 12/12 ore di luce / buio fotoperiodo. </li><li> Mettere circa 1.500-2.000 pupe medfly in una gabbia 6 L. Utilizzare una gabbia con ottone maglia su un lato con fori abbastanza piccolo per stimolare ovideposizione 42. Inserire una striscia di spugna attraverso una piccola apertura nella base della gabbia di fornire mosche con acqua per mezzo di azione capillare. Usare una miscela di lievito e zucchero (1,10) come fonte di cibo per gli adulti (Figura 1A). Aumentare la quantità di lievito (fino a 1: 3, lievito: zucchero) devono le femmine riescono a deporre le uova. </li><li> Collocare un piatto riempito con acqua sotto la gabbia a raccogliere le uova depositate attraverso le maglie. Come femmine vergini possono oviposit, attendere fino a quando le mosche sono almeno 6-7 giorni prima di raccogliere le uova per gli esperimenti di microiniezione. Questo farà sì che le femmine sono accoppiatie che saranno state fecondate le uova. </li><li> Raccogliere le uova filtrando l&#39;acqua con un colino rete fine. Trasferire le uova dal filtro in una scatola di plastica contenente cibo larvale standard (1,5 LH 2 O, 100 ml di HCl 1%, 5 g ampio spettro antimicrobico disciolto in 50 ml di etanolo, 400 g di zucchero, 175 g di lievito di birra demineralizzata, 1 kg crusca di grano tenero) con una pipetta Pasteur. </li><li> Posizionare ogni scatola in un contenitore trasparente chiuso con un coperchio rete per permettere la circolazione dell&#39;aria e contenente uno strato di crusca per favorire impupamento (Figura 1B). </li><li> Dopo circa 10 giorni, verificare la presenza di 3 ° larve instar che emergono dal cibo larvale e saltare giù nello strato di crusca per impupamento. </li><li> 24 ore più tardi, raccogliere le pupe in una tazzina con una spazzola morbida e trasferirli ad una nuova gabbia per adulti. Adulti normalmente emergono 10 giorni dopo impupamento. La mosca emergente utilizza il ptilinum, una tasca gonfiabile situato sulla sua testa sopra esimoe di base delle antenne, per forzare l&#39;estremità del puparium. Dopo la nascita, il ptilinum crolla definitivamente indietro all&#39;interno della testa. </li></ol></li><li> Preparazione di 1 L di cibo per le larve microiniezione <ol><li> Sciogliere 2.5 g di agar in 300 ml di H 2 O. </li><li> Warm 500 ml di H 2 O su una piastra di agitazione caldo e sciogliere 4 g di sodio benzoato, 4,5 ml di 37% di HCl, 42 g di estratto di lievito e 115 g di polvere disidratati carota. </li><li> Aggiungere alla miscela una soluzione di 2,86 g ampio spettro antimicrobico sciolti in 10 ml di etanolo assoluto. </li><li> Distribuire il mezzo in 15 cm rotonde piastre di Petri e lasciare raffreddare. Se necessario, conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> preparazione del vetrino <ol><li> Posizionare una striscia di 2 cm nastro biadesivo su un vetrino da microscopio (75 x 26 mm 2) e segnare i bordi con un pennarello la Cina, per prevenire la diffusione del petrolio e la conseguente essiccazione degli embrioni iniettati. </li></ol></li><li><strong&gt; Nucleic Acid Preparazione <ol><li> Isolare plasmide DNA utilizzando kit disponibili in commercio 34. Precipitare il plasmide usando etanolo e risospendere in tampone di iniezione (0,1 mM tampone fosfato pH 7,4, 5 mM KCl) alla concentrazione desiderata. </li><li> Purificare in vitro sintetizzata lungo dsRNA con fenolo-cloroformio, precipitare con isopropanolo e risospendere in tampone iniezione 43. </li></ol></li></ol> 2. Embryo Preparazione <ol><li> Posizionare un vassoio pieno di acqua sotto una gabbia contenente 6-7 giorni vecchi adulti. </li><li> Lasciare le femmine per oviposit per 30 minuti e poi raccogliere gli embrioni filtrando l&#39;acqua con un colino. Tenere sempre il filtro in acqua per evitare la disidratazione degli embrioni. </li><li> Dechorionate gli embrioni immergendo il filtro per 5 secondi in una soluzione commerciale di candeggina al 50%. </li><li> Lavare accuratamente gli embrioni ripetutamente immergendo il filtro in acqua ultrapura pulita (almeno4-5 volte). Infine, posizionare il filtro in acqua ultrapura pulita. Usare gli embrioni entro massimo 2 ore. NOTA: I tempi di microiniezione è legato alla necessità di iniettare in embrioni pre-blastoderma, durante una fase di divisioni nucleari prima cellularization. In questo modo il DNA iniettato da prendere-up nei nuclei, in particolare nei nuclei delle cellule germinali primordiali che provengono i gameti. In Drosophila, cellularization alle cellule polo inizia a circa 90 minuti dopo la fecondazione (a 25 ° C), con formazione blastoderma che si verificano circa 30 min più tardi 44, mentre nel cellularization medfly si svolge tra il 9 e il 12 ore 45,46. </li><li> Orientamento degli embrioni in righe <ol><li> Utilizzando un pennello fine, raccogliere circa 50 embrioni e metterli su un disco di carta da filtro nero inzuppato d&#39;acqua. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio dissezione, organizzare gli embrioni in fila sulla superficie superiore del nastro biadesivo suil vetrino da microscopio utilizzando un pennello fine (000) (Figura 1C). NOTA: allineare gli embrioni tutte con lo stesso orientamento, l&#39;iniezione viene eseguita nel polo posteriore, dove germinali avrà origine; polo posteriore è opposta alla zona micropilo. </li><li> Coprire gli embrioni con uno strato di olio clorotrifluoroetilene fare in modo che l&#39;olio non fuoriesca la Cina confini marcatori (vedi 1.3). NOTA: Prima di coprire gli embrioni con olio, un ulteriore passo può essere eseguito: gli embrioni possono essere essiccate per alcuni minuti per ridurre il loro contenuto di liquido e facilitare l&#39;ingresso della soluzione di DNA iniettato così. Questo può evitare embrione rottura durante l&#39;iniezione o eccessiva fuoriuscita della soluzione iniettata, in conseguenza della elevata pressione del liquido. </li></ol></li></ol> 3. Embrione microiniezione <ol><li> Riempire un ago (1-2 ml) con il DNA plasmide o una soluzione dsRNA (1-2 mg / mL) con una micropipetta. </li><li&gt; Collegare l&#39;ago all&#39;apparato microiniezione, che controlla il tempo di iniezione (0,5 sec), la pressione (800 hPa) e la contropressione (150 hPa). </li><li> Eseguire microiniezione allo stereomicroscopio, utilizzando un micromanipolatore per controllare i movimenti dell&#39;ago (Figura 1D). Utilizzare il palco microscopio per spostare la diapositiva. <ol><li> Posizionare il vetrino sul palco del campo di applicazione. </li><li> Inserire la punta dell&#39;ago nel polo posteriore dell&#39;embrione (Figura 1E). </li><li> Iniettare la soluzione attivando il sistema microiniezione con il pedale. Il liquido iniettato induce un aumento della pressione interna, causando un leggero movimento dell&#39;embrione. </li><li> Rilasciare il pedale e subito, ma delicatamente, rimuovere l&#39;ago dall&#39;embrione. </li><li> Osservare un po &#39;di dispersione citoplasmatica al sito di iniezione. NOTA: per discriminare tra i potenziali effetti letali di DNA / RNA a doppio filamento / siRNA e la mortalità a causa della microiniezione proprocedura stessa, esperimenti di controllo devono essere eseguite. Questi comprendono l&#39;iniezione di tampone soltanto, o, nel caso di esperimenti di genetica inversa, di una proteina fluorescente verde (GFP) -derived doppio filamento RNA (dsRNA-GFP), o siRNA. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;iniezione incubare gli embrioni a 25 ° C. </li></ol> 4. Procedure post-iniezione <ol><li> Due giorni dopo l&#39;iniezione, controllare le diapositive per le larve schiuse (Figura 1F) sotto uno stereomicroscopio. Le larve può muoversi nell&#39;olio ma devono essere trasferiti al cibo larvale appena possibile. Per questo motivo, controllare le diapositive più volte al giorno. </li><li> Utilizzando un pennello fine (000), trasferire delicatamente le larve schiuse al cibo larvale carota-based. Trasferire fino a un massimo di 200 larve per ogni piatto Petri. </li><li> Incubare le larve al 65% di umidità (25 ° C). Assicurarsi che il coperchio non si attacca al piatto, compromettendo ricambio d&#39;aria. </li><li> Mantenere le piastre di Petri con il coperchioper lo più chiusi in modo che ci sia ancora flusso d&#39;aria alle larve. Per evitare l&#39;asciugatura eccessiva, controllare i piatti tutti i giorni e, se necessario, aggiungere acqua per compensare l&#39;evaporazione. </li><li> Porre le capsule di Petri in un contenitore trasparente chiuso da un coperchio-rete e contenente uno strato di crusca per favorire impupamento. Per quanto riguarda la routine di allevamento insectary, 3 ° larve instar saltare fuori del cibo larvale e pupate nella crusca. </li><li> Raccogliere le pupe e metterli in una piccola gabbia per l&#39;allevamento degli adulti e di screening (questo è Generazione 0, G0). Posteriore la progenie sul cibo larvale standard. </li><li> Nel caso di esperimenti di trasformazione germ-line, verificare la presenza di eventuali individui trasformati nella prossima generazione (G1), come individui iniettati di solito sono chimere. eventi di trasposizione, infatti, potrebbe essersi verificato in uno qualsiasi dei nuclei del sincizio embrionali, che andranno a formare sia il germe-line o il soma. <ol><li> Poco dopo la nascita, anestetizzare gli individui G1 con CO 2 e verificare la presenza di transfeventi ormazione sotto un stereomicroscopio epifluorescenza. Per lo screening per la presenza di fluorescenza rossa, utilizzare un filtro DsRedwide (Ext 546/12;.. Emm 605/75), mentre allo schermo per fluorescenza verde utilizzare il filtro EYFP (Ext 500/20;.. Emm 535/30) . </li><li> Mettere le persone trasformate in una piccola gabbia con wild-type adulti di sesso opposto e originare una nuova, inizialmente eterozigote, ceppo. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Microiniezione di acidi nucleici in embrioni insetti è una tecnica universale che facilita sia l&#39;analisi della funzione genica e applicazioni biotecnologiche. La recente pubblicazione delle sequenze genomiche da un crescente numero di specie di insetti porta ad una necessità urgente di strumenti per la caratterizzazione funzionale dei geni di funzione ancora sconosciute. RNA-interferenza ha dimostrato di essere uno dei metodi più importanti per dedurre funzioni molecolari 49</sup...

La mosca della frutta mediterranea (medfly) Ceratitis capitata è una specie cosmopolita che estesamente danneggia frutta e coltivazioni. Appartiene alla famiglia Tephritidae, che comprende diverse specie di parassiti, come ad esempio quelli appartenenti ai generi Bactrocera e Anastrepha. La medfly è la specie più studiati di questa famiglia, ed è diventato un modello non solo per lo studio delle invasioni insetti 1, ma anche per ottimizzare le strategie di gestione dei parassiti 2. Il medfly è una specie multivoltine che possono attaccare più di 300 specie di selvatici e piante coltivate 3,4. Il danno è causato da entrambi gli adulti ed i stadi larvali: femmine fecondate perforare la superficie del frutto per la deposizione delle uova, permettendo ai microrganismi di influenzare la qualità commerciale, mentre le larve si nutrono della polpa di frutta. Dopo tre stadi larvali, larve emergono dall&#39;host e pupate nel terreno. Ceratitiscapitata mostra una distribuzione quasi tutto il mondo, tra cui l&#39;Africa, il Medio-Oriente, Western Australia, Centro e Sud America, Europa, e le aree degli Stati Uniti 5. Le strategie più comuni per limitare le infestazioni medfly comportano l&#39;uso di insetticidi (ad esempio, Malathion, spinosad) e l&#39;ecologico Sterile Insect Technique (SIT) 6. Il secondo approccio comporta il rilascio nell&#39;ambiente naturale di centinaia di migliaia di maschi resi sterili da esposizione a radiazioni ionizzanti. L&#39;accoppiamento di questi maschi sterilizzati alle femmine selvatiche si traduce in nessun progenie, causando una riduzione della dimensione della popolazione, portando infine alla eradicazione. Anche se SIT si è dimostrato efficace in più campagne in tutto il mondo, i suoi principali svantaggi sono gli alti costi di allevamento e sterilizzazione di milioni di insetti per essere rilasciato. Marcatura di esemplari rilasciati è necessario distinguere sterile da insetti selvatici catturati sul campo duranteattività di monitoraggio ed è attualmente realizzato con polveri fluorescenti. Queste procedure sono costose e hanno effetti collaterali indesiderati 7. Al fine di ottimizzare e / o per sviluppare approcci più efficaci per il controllo di questo parassita, biologia e genetica medfly sono stati ampiamente esplorato da numerosi ricercatori di tutto il mondo. La disponibilità della sequenza del genoma medfly 8,9, faciliterà nuove indagini sulle funzioni dei geni. RNA interferenza è un potente strumento per tali studi e può essere raggiunto attraverso la microiniezione di dsRNA (RNA a doppio filamento) o siRNA (small interfering RNA). Questa tecnica è stata utilizzata, per esempio, per dimostrare che la determinazione del sesso cascata molecolare in C. capitata è solo parzialmente conservata rispetto a quello di Drosophila 10. Lo sviluppo di protocolli per microinject embrioni medfly ammessi C. capitata di essere il primo nonspecie di mosca -Drosophilid da geneticamente modificati. Come le sue uova sono simili a quelli di Drosophila, sia in termini di morfologia e la resistenza all&#39;essiccamento 11, il protocollo per fornire DNA plasmidico in embrioni pre-blastoderma primo sviluppati per D. melanogaster 12,13 inizialmente è stato adattato per l&#39;uso in C. capitata. Questi primi esperimenti autorizzati medfly trasformazione della linea germinale in base all&#39;elemento trasponibili Minos 11. Successivamente, il sistema originale è stato modificato 14 utilizzando altri approcci basati trasposoni. Questo è il caso del piggyBac dal Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Il protocollo è stato poi ulteriormente ottimizzato e questo ha permesso la trasformazione di altre specie tephritid 16-21 e anche di molti altri Ditteri 22-31. Tutti questi sistemi si basano sull&#39;impiego di un tipico / helper sistema plasmidico trasformazione binaria vettoriale: artificiale, Transpo difettosofigli contenenti geni desiderati vengono assemblati in DNA plasmidico e integrato nel genoma dell&#39;insetto fornendo l&#39;enzima trasposasi 32. Un certo numero di linee medfly transgenici sono stati generati, con molteplici funzioni, tra cui i ceppi che trasportano un condizionale gene dominante letale che induce letalità, ceppi produttori di soli uomini prole e quindi non richiedono strategie di sessaggio aggiuntivi, e ceppi con sperma fluorescente, che può migliorare la precisione della fase di monitoraggio SIT 33-37. Anche se il rilascio in natura di organismi transgenici è verificato nei test pilota contro le zanzare solo 38,39, almeno una società sta valutando una serie di ceppi medfly transgenici per il loro utilizzo in campo 40. Embrione microiniezione può anche favorire lo sviluppo di nuovi strumenti di genoma-editing, come la trascrizione nucleasi attivatore simile effettrici (Talens), raggruppati regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CRISPR proteina associata 9 nucleasi (Cas9) e endonucleasi homing geni (HEGs), che permetteranno nuovi studi evolutivi e di sviluppo, così come l&#39;espansione degli strumenti biotecnologico disponibile. Genome-editing approcci già permesso la generazione di sistemi gene-drive in zanzare 41, e il loro trasferimento al medfly è imminente. Qui si descrive un protocollo universale per microinjecting acidi nucleici in embrioni medfly che possono essere utili per tutte le applicazioni di cui sopra.

<table><tbody><tr><td>1 x injection Buffer</td><td></td><td></td><td>0.1 mM phosphate buffer pH 7.4, 5&amp;nbsp;mM KCl</td></tr><tr><td>Construct Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helper Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dsRNA</td><td></td><td></td><td>Phenol-Chloroform purified</td></tr><tr><td>Standard Larval food</td><td></td><td></td><td>1.5 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 100 ml HCl 1%, 5 g broad-spectrum antimicrobial agent used in pharmaceutical products dissolved in 50&amp;nbsp;ml of ethanol, 400 g sugar, 175 g demineralized brewer&#039;s yeast, 1 kg soft wheat bran</td></tr><tr><td>Carrot Larval Food</td><td></td><td></td><td>2.5 g agar, 4 g sodium benzoate, 4.5 ml 37% HCl, 42 g yeast extract, 115 g carrot powder, 2.86&amp;nbsp;g broad-spectrum antimicrobial agent , water to 1 L</td></tr><tr><td>Adult Food</td><td></td><td></td><td>yeast extract and sugar (1:10)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z692247</td><td></td></tr><tr><td>Injection needles&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5242956000</td><td></td></tr><tr><td>Microloaders</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Double slided tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Black circle paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695505</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td></td><td></td><td>Diluite 1:2 before use</td></tr><tr><td>Paintbrush (000)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Femtojet</td></tr><tr><td>Adult cages</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorotrifluoroethylene oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ceratitis capitata&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The strain used is ISPRA</td></tr></tbody></table>

delivery of nucleic acids through embryo microinjection in the worldwide agricultural pest insect, ceratitis capitata

La mosca mediterranea della frutta (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Ditteri: Tephritidae) è una specie di parassiti con altissima rilevanza agricola. Ciò è dovuto al suo comportamento riproduttivo: le femmine danneggiare la superficie esterna di frutta e verdura, quando depongono le uova e le larve si nutrono schiuse sulla loro polpa. Selvaggio C. popolazioni capitata sono tradizionalmente controllati attraverso insetticidi e / o approcci eco-friendly, il maggior successo è la tecnica sterile Insect (SIT). Il SIT deduce mass-allevamento, sterilizzazione radiometrica e abilitazione campo di maschi che mantengono la loro capacità di accoppiarsi, ma non sono in grado di generare progenie fertile. L&#39;avvento e la conseguente rapido sviluppo di strumenti biotecnologici, insieme con la disponibilità della sequenza del genoma medfly, ha notevolmente aumentato la nostra comprensione della biologia di questa specie. Questo ha favorito la proliferazione di nuove strategie per la manipolazione del genoma, che can essere applicata al controllo della popolazione. In questo contesto, embrione microiniezione gioca un duplice ruolo nell&#39;espansione degli strumenti per il controllo della mosca della frutta. La capacità di interferire con la funzione dei geni che regolano i processi biologici chiave, infatti, amplia la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base invasività medfly. Inoltre, la capacità di raggiungere la trasformazione della linea germinale facilita la produzione di più ceppi transgenici che possono essere testati per le future applicazioni sul campo in contesti SIT romanzo. In effetti, la manipolazione genetica può essere utilizzata per conferire tratti desiderabili che possono, ad esempio, essere utilizzati per monitorare le prestazioni maschio sterile nel campo, o che può provocare nei primi mesi di vita letalità stadi. Qui si descrive un metodo per microinject acidi nucleici in embrioni medfly per raggiungere questi due obiettivi principali.

Qui riportiamo due applicazioni di microiniezione dell&#39;embrione diretto alla caratterizzazione funzionale di un gene di interesse (caso 1), e alla generazione di ceppi transgenici (caso 2), rispettivamente. Consegna di dsRNA in embrioni di svelare la funzione del gene. Il gene innexin-5 codifica una gap-junction che, negli insetti, si esprime in partico...

Watch this Scientific Journal Video about Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata at JoVE.com

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,<em&gt; Capitata Ceratitis</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

delivery-nucleic-acids-through-embryo-microinjection-worldwide

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

8.9K Views.  University of Pavia. The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Video: Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Ricerca

Genetica

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjection di embrione e tecnica di trapianto per la manipolazione del genoma di Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embrione microiniezione e elettroporazione in chordate<em&gt; Intestinalis Ciona</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Biologia dello sviluppo

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Tecniche di microiniezione embrionale per un'efficiente mutagenesi sito-specifica in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is applicable to a wide variety of organisms and is highly efficient in the species-rich order Coleoptera (beetles). Here, we summarize the necessary steps for developing this technique in a novel organism and illustrate its application to the different developmental stages of the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus. Target gene sequences can be obtained cost-effectively through the assembly of transcriptomes against a close relative with known genomics or de novo. Candidate gene cloning utilizes a specific cloning vector (the pCR4-TOPO plasmid), which allows the synthesis of double-stranded RNA (dsRNA) for any gene with the use of a single common primer. The synthesized dsRNA can be injected into either embryos for early developmental processes or larvae for later developmental processes. We then illustrate how RNAi can be injected into aquatic larvae using immobilization in agarose. To demonstrate the technique, we provide several examples of RNAi experiments, generating specific knockdowns with predicted phenotypes. Specifically, RNAi for the tanning gene laccase2 leads to cuticle lightening in both larvae and adults, and RNAi for the eye pigmentation gene white produces a lightening/lack of pigmentation in eye tubes. In addition, the knockdown of a key lens protein leads to larvae with optical deficiencies and a reduced ability to hunt prey. Combined, these results exemplify the power of RNAi as a tool for investigating both morphological patterning and behavioral traits in organisms with only transcriptomic databases.

RNA interference is a widely applicable, powerful technique for manipulating gene expression at specific developmental stages. Here, we describe the necessary steps for implementing this technique in the aquatic diving beetle Thermonectus marmoratus, from the acquisition of gene sequences to the knockdown of genes that affect structure or behavior.

Interferenza dell'RNA nei Coleotteri acquatici come potente strumento per manipolare l'espressione genica in punti specifici del tempo di sviluppo

RNA interference (RNAi) remains a powerful technique that allows for the targeted reduction of gene expression through mRNA degradation. This technique is ...

Ambiente

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been developed in traditional model systems, it is difficult to manipulate genes or messenger RNA (mRNA) in most other organisms. At the same time, evolutionary and comparative approaches rely on an exploration of gene function in many different species, necessitating the development and adaptation of techniques for manipulating expression outside currently genetically tractable species. This protocol describes a method for injecting reagents into cricket eggs to assay the effects of a given manipulation on embryonic or larval development. Instructions for how to collect and inject eggs with beveled needles are described. This relatively straightforward technique is flexible and potentially adaptable to other insects. One can gather and inject dozens of eggs in a single experiment, and survival rates for buffer-only injections improve with practice and can be as high as 80%. This technique will support several types of experimental approaches including injection of pharmacological agents, in vitro capped mRNA to express genes of interest, double-stranded RNA (dsRNA) to achieve RNA interference, use of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in concert with CRISPR-associated protein 9 (Cas9) reagents for genomic modification, and transposable elements to generate transient or stable transgenic lines.

Injecting Gryllus bimaculatus Eggs

Here we present a protocol to inject cricket eggs, a technique which serves as a foundational method in many experiments in the cricket, including, but not limited to, RNA interference and genomic manipulation.

Iniezione di uova di Gryllus bimaculatus

Altering gene function in a developing organism is central to different kinds of experiments. While tremendously powerful genetic tools have been ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microiniezione di Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embrioni per la trasformazione di Germline o CRISPR/Cas9 Editing genomico

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Bioingegneria

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Microiniezione di Corn Planthopper, Peregrinus maidis, embrioni per l'editing del genoma CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and evolution of developmental processes. The sea star, Patiria miniata, is gaining prevalence as a model system for these types of studies which were previously performed almost exclusively in the sea urchins, Strongylocentrotus purpuratus and Lytechinus variegatus. An advantage of these model systems is the ease of producing modified embryos in which a particular gene is up or downregulated, labeling a group of cells, or introducing a reporter gene. A single microinjection method is capable of creating a wide variety of such modified embryos. Here, we present a method for obtaining gametes from P. miniata, producing zygotes, and introducing perturbing reagents via microinjection. Healthy morphant embryos are subsequently isolated for quantitative and qualitative studies of gene function. The availability of genome and transcriptome data for this organism has increased the types of studies that are performed and the ease of executing them.

A Method for Microinjection of Patiria minata Zygotes

Methods that produce morphant embryos are essential to study developmental mechanisms and gene regulatory networks. The sea star Patiria miniata is an emerging model system for these studies. Here we present a protocol for obtaining gametes, producing cultures of embryos, and rapid microinjection of zygotes from this species.

Un metodo per la microiniezione di<em&gt; Patiria minata</em&gt; zigoti

Echinoderms have long been a favorite model system for studies of reproduction and development, and more recently for the study of gene regulation and ...

Biologia

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, host-symbiont interactions, speciation, and venom synthesis. Despite the availability of several molecular tools, including CRISPR/Cas9, functional genetic studies are still limited in this organism. The major limitation of applying CRISPR/Cas9 technology in N. vitripennis stems from the challenges of embryonic microinjections. Injections of embryos are particularly difficult in this organism and in general in many parasitoid wasps, due to small embryo size and the requirement of a host pupa for embryonic development. To address these challenges, Cas9 ribonucleoprotein complex delivery into female&#160;ovaries by adult injection, rather than embryonic microinjection, was optimized, resulting in both somatic and heritable germline edits. The injection procedures were optimized in pupae and female wasps using either ReMOT Control (Receptor-Mediated Ovary Transduction of Cargo) or BAPC (Branched Amphiphilic Peptide Capsules). These methods are shown to be effective alternatives to embryo injection, enabling site-specific and heritable germline mutations.

Pupal and Adult Injections for RNAi and CRISPR Gene Editing in Nasonia vitripennis

Here, we describe methods for efficient pupal and adult injections in Nasonia vitripennis as accessible alternatives to embryo microinjection, enabling functional analysis of genes of interest using either RNA-silencing via RNA interference (RNAi) or gene knockout via CRISPR/Cas9 genome editing.

Iniezioni pupali e adulte per l'editing genico RNAi e CRISPR a Nasonia al vetripennis

The jewel wasp, Nasonia vitripennis, has become an efficient model system to study epigenetics of haplo-diploid sex determination, B-chromosome biology, ...

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video