Supportato in parte da una sovvenzione del National Cancer Institute 1R03CA172923.

Etica Dichiarazione: L&#39;uso di topi nella ricerca è accettabile solo nei casi in cui si potrebbe avanzare la comprensione umana della biologia fondamentale o verso l&#39;eventuale trattamento della malattia. 1. Ordine <ol><li> Acquisto femminile C57BL / 6 topi (all&#39;età di 6 - 8 settimane), 5 topi per gruppo. Consentire diversi giorni per i topi per regolare. </li></ol> 2. Preparazione di cellule B16-BL6 <ol><li> Rimuovere piastre di coltura di cellule da incubatore a 37 gradi e posto in una cappa sterile. Le piastre devono essere circa il 70% confluenti con cellule di melanoma murino B16-BL6. Una maggiore confluenza può alterare le cellule potenziale metastatico. </li><li> Aggiungere 1 ml di 0,05% tripsina-EDTA per piastra, lasciate riposare per 1 minuto, e poi aspirare la soluzione di tripsina-media. </li><li> Aggiungere 1 ml di tripsina per piastra e tornare piastre incubatrice per 10 min. </li><li> Dopo aver spostato le piastre dal termostato alla cappa sterile, aggiungere 4 ml di privo di siero Rosewell Park Memorial Institute Medium (RPMI) per ogni piatto. </li><li> Raccogliere le cellule con una sterile, pipetta motorizzato. Estrarre cellule contro il fondo della piastra, con la punta pressata a una leggera angolazione, per rompere le cellule. Ripetere più volte al fine di garantire un&#39;adeguata separazione dei grumi di cellule, che altrimenti potrebbero intasare l&#39;ago espulsione. Ricordare e trasferire in una provetta conica da 50 ml. </li><li> Utilizzare un emocitometro per determinare la densità cellulare. Mantenere il numero totale di cellule B16-BL6 costante, determinare il volume di RPMI senza siero necessario per raggiungere concentrazioni finali di 0, 0,065, 0,015, 0,25 e 0,5 milioni di cellule / ml. </li><li> Altrettanto un&#39;aliquota media del tubo da 50 ml a 15 ml provette coniche. Centrifugare le provette coniche a 2.250 xg per 5 min. Decantare il supporto. Aggiungere un volume adeguato di RPMI senza siero e confermare la densità cellulare desiderato tramite emocitometro. Regolare densities- con l&#39;aggiunta di ulteriore RPMI o filatura e risospensione in un volume- più piccolo di conseguenza. </li><li> Aliquota 500 microlitridi ciascuna sospensione cellulare in etichettato 1,8 ml provette su ghiaccio. </li></ol> 3. Tail Vein Injection <ol><li> Prendere un topo, che si tiene per la coda, e guidarla posteriore prima nel dispositivo di immobilizzazione del mouse. Con il torso nella camera principale del dispositivo di immobilizzazione, con la coda fuori, tirare il mouse verso la fine del dispositivo di immobilizzazione. Inserire il dispositivo di immobilizzazione-stantuffo, continuando a spingere fino a quando il mouse è sicuro. </li><li> Ruotare il mouse 90 gradi in modo che una delle vene coda laterale rivolta in alto. Usando un tampone di alcool, vigorosamente pulire il lato di coda del topo, in particolare quando la vena della coda è più visibile. Nota: Una buona illuminazione è essenziale per la coda efficace visualizzazione vena sul B57BL 6J /. lampade di calore o pastiglie chirurgia riscaldata, mentre non necessario, aiuterà anche aumentando il volume della vena della coda. </li><li> In una cappa sterile cultura, raccogliere 300 ml di terreni di coltura delle cellule dal / tubo di 2 milioni di cellule ml. Invertire l&#39;ago, sfogliando le side e spingendo lo stantuffo, per espellere le bolle dalla siringa. Estrarre coltura RPMI-tradursi in un volume finale di 250 microlitri. </li><li> Estendere il mouse-coda con la mano non dominante. Tenere la coda con l&#39;estremità prossimale della coda elevata con l&#39;indice della mano non dominante, e la porzione distale della coda premuto con il pollice. Nota: In questo modo, la vena della coda viene tenuto in posizione laterale, parallelo alla superficie restrainer, con una voce congruente possibile nella parte più distale della coda. </li><li> Inserire l&#39;ago nella vena della coda, verso l&#39;estremità distale, ad un angolo verso il basso minuti per cominciare, e quindi regolare l&#39;ago per abbinare l&#39;angolo della vena caudale dopo ulteriore inserimento (abbassamento fine stantuffo della siringa rispetto all&#39;ago) . </li><li> Inserire l&#39;ago di circa 1 cm nel vena della coda. Dopo l&#39;inserimento, iniziano a spingere lo stantuffo, tenendo l&#39;ago costante. Nota: Se l&#39;ago è in vena della coda e l&#39;estremità dell&#39;ago è not ostruito i media dovrebbero fluire senza ostacoli nella vena. iniezione efficace è caratterizzata da depurazione del sangue dalla vena. Se c&#39;è resistenza, o una bolla inizia a formarsi il sito in iniezione, rimuovere l&#39;ago e riprovare in una posizione più prossimale lungo la vena della coda. </li><li> Rimuovere l&#39;ago dalla vena e disfarsene. Tenere garza contro il sito di entrata per fermare le emorragie. </li><li> Rimuovere lo stantuffo dalla restrainer e posizionare il mouse nella gabbia destinatario. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per tutte le altre concentrazioni. Nota:. Lung stabilimento foci richiede circa 2 - 3 settimane, con variabilità a seconda della linea cellulare e la dimensione desiderata dei fuochi 9 Nel frattempo, i topi devono essere monitorati per sintomi che potrebbero giustificare l&#39;eutanasia presto, come ansimante eccessivo. </li></ol> 4. Contare il polmone Foci <ol><li> Euthanize il mouse posizionando in una camera di CO 2 ed esponendo al 100% CO 2 </sub&gt; introdotto al 10-30% del volume della camera per minuto per 5 min. Seguire con una dislocazione cervicale. </li><li> Splay il mouse sul polistirolo. Utilizzando forbici chirurgiche, creare una incisione chirurgica lungo lo sterno. </li><li> Fare due incisioni aggiuntivi, sia dalla parte superiore dell&#39;incisione sterno e ramificazione verso le spalle del mouse, esponendo la gabbia toracica. </li><li> Fare due tagli, ciascuno lungo i lati laterali dello sterno, per rimuovere la gabbia toracica dal tronco, esponendo i polmoni e il cuore. </li><li> Tenendo cuore con le pinzette chirurgiche, tagliare l&#39;esofago e la trachea, liberando il cuore ei polmoni dal mouse. Mettere sotto un microscopio da dissezione, a 10X di ingrandimento, per una migliore visualizzazione. </li><li> Sezionare cuore dai polmoni e rimuovere il timo, lasciando solo i due polmoni. </li><li> Con i polmoni sotto un ambito dissezione, cominciare a contare i fuochi polmone. Ogni foci dovrebbe apparire come circolare, obtrusion marrone sulla superficie dei polmoni. <ol><li> Percoerenza tra topi, contare il numero di focolai sulla superficie di un lobo, e poi invertire tale lobo. Facendo ciascuno dei quattro lobi permette singolarmente per il conteggio più facile. </li></ol></li><li> Salvare e fissare i polmoni se l&#39;esecuzione di IHC, in caso contrario, eliminare i resti. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Circolanti cellule tumorali da una iniezione coda vena rappresentare le metastasi che eludono i siti di crescita primaria e migrare attraverso percorsi come il sangue o il sistema linfatico, di tanto in tanto si stabilisce nei letti capillari di luoghi distanti. 14 Il protocollo sopra descritto serve da modello per la secondaria metastasi. Con un numero ottimale di cellule B16-BL6 iniettato, sperimentatori in grado di determinare l&#39;effetto relativo di un farmaco somministrato o di una popolazione di cellule immunitarie, post-neutralizzazione, sulle metastasi delle cellule tumorali. Questo protocollo ha limitazioni. Le cellule tumorali circolanti sono state selezionate per la loro capacità di metastatizzare e sono quindi non immunogenica, con livelli inferiori di maggiore di istocompatibilità di classe complessa 1 molecole. 12 Inoltre, l&#39;introduzione improvvisa e cluster di gran numero di metastasi è diverso scenario tipico in pazienti dove un piccolo numero di cellule tumorali metastatichedissipare per un periodo prolungato di tempo dalla localizzazione del tumore primario. Inoltre, le cellule tumorali per via endovenosa introdotte sono da coltura tissutale e non di origine tumore primario. Pertanto, queste cellule sono a differenza delle metastasi secondarie che derivano da alterazioni nella adesione cellulare, la migrazione, il riconoscimento immunitario e stabilimento organo ricevente. 15,16 Un protocollo alternativo sarebbe l&#39;iniezione sottocutanea di B16 / BL6 per la generazione di tumori primari e l&#39;analisi delle risultanti metastasi polmonari &quot;spontanee&quot;. Queste metastasi &quot;spontanee&quot; sono stati trovati per contenere più l&#39;eterogeneità delle loro controparti &quot;sperimentali&quot;, più strettamente corrispondono a quelli dei pazienti umani. Il protocollo è limitante nella sua capacità di determinare l&#39;influenza di un composto sperimentale di metastasi. Con una laterale iniezione vena della coda, il numero di cellule di melanoma iniettato nel sangue può essere approssimata tramite hemocytometer. Con metastasi &quot;spontanee&quot;, tuttavia, vi è una maggiore eterogeneità tra tumori, aggiungendo un&#39;ulteriore variabile per il numero di foci risultante polmonare. 16 In conclusione, la B16-BL6 modello di melanoma murino vena della coda rappresenta un modello semplice per determinare l&#39;influenza di un trattamento o immunoterapia in metastasi. In via endovenosa iniezione di cellule tumorali circolanti, i ricercatori possono replicare, in una certa misura, i pazienti post-metastasi. Considerando gli effetti distruttivi delle cellule tumorali metastatiche nei pazienti affetti da cancro, questo modello è un potente strumento per la comprensione del processo multistep di metastasi.

Metastasi è una delle principali cause di morte tra i pazienti con neoplasie. Il processo di diffusione metastatica delle cellule tumorali è poco conosciuta, ma sembra coinvolgere diversi passaggi, tra cui invasione dei tessuti adiacenti, intravasation nei vasi linfatici e vasi, la sopravvivenza e la traslocazione all&#39;interno del sistema circolatorio, stravaso dal sistema vascolare presso il sito di metastasi, l&#39;adattamento al nuovo microambiente del nuovo sito, e la colonizzazione al nuovo sito proliferazione e formazione di tumori secondari. 1 Ciascuno di questi eventi biologici coinvolgono la trasformazione, la diffusione e la sopravvivenza delle cellule tumorali metastatiche. Per esempio, la trasformazione del fenotipo epiteliale della cellula tumorale in un fenotipo mesenchimale, accoppiato con l&#39;interazione positiva con la matrice extracellulare, consentire loro di invadere i tessuti adiacenti e metastasi in altre parti del corpo. 2,3 Inoltre, questi metastatico celluledeve sopravvivere all&#39;interno del flusso sanguigno circolante e evadere la sorveglianza immunitaria dall&#39;host. 4,5 Infine, quando impiantato in un sito lontano all&#39;interno del corpo, le cellule tumorali devono adattarsi al loro microambiente per proliferare e formare tumori secondari. 6,7 Pertanto , anche se le metastasi è un fenomeno comune tra i pazienti affetti da cancro, le cellule tumorali metastatiche hanno molteplici aree di vulnerabilità che sono suscettibili di intervento terapeutico. Data la natura immunogenica del melanoma, e il recente interesse per le immunoterapie, modelli per il melanoma sono sempre più utile. 8 Nei soli Stati Uniti, il melanoma è la causa di una stima di 9.000 morti l&#39;anno. 9 sedi comuni di metastasi del melanoma sono ossa, cervello , fegato e polmoni. La maggior parte delle metastasi a siti distanti avviene attraverso il flusso sanguigno. Circolanti cellule tumorali nel sangue deve eludere spazio immunitario, raggiungere un letto capillare di un organo distale einvadono attraverso le cellule endoteliali dei vasi sanguigni per stabilire correttamente se stessi. 4-7,10, 11 Per simulare i fenomeni comuni e virulenti di metastasi, è stato creato la linea cellulare B16-BL6 murino. Un defunto della parentali C57BL / 6 linea di cellule di melanoma B16-F0, B16-BL6 è il prodotto finale di 10 selezioni successive per metastasi polmonari da iniezione endovenosa (con conseguente B16-F10), seguita da 6 selezioni successive per la penetrazione della membrana della vescica. 12 come tale, è una linea cellulare di melanoma affidabile per la creazione di foci metastatici nel topo, in particolare quando iniettato per via endovenosa. 13 Dopo l&#39;iniezione di una quantità sufficiente di B16-BL6 cellule nella vena della coda di un B57BL / 6 del mouse, seguito da due o più settimane per permettere impianto e la crescita delle cellule B16 / BL6, foci metastatici formerà nei polmoni. Al momento l&#39;eutanasia e l&#39;ispezione al microscopio dissezione, il numero difoci presente individuo può essere quantificato. Questo, a sua volta, può essere utilizzato per stabilire un effetto dose-metastasi, come il numero di cellule B16-BL6 iniettati è correlato al numero di foci formata sulla superficie dei polmoni. Questo modello è conosciuto come &quot;metastasi sperimentale&quot;, in cui le cellule conosciute metastatico vengono introdotti direttamente nel flusso sanguigno, favorendo una diffusione rapida e prevedibile e stabilimento nel polmoni, fegato, o di altro organo di indagine. Questo è in contrasto con &quot;metastasi spontanee&quot;, in cui le cellule tumorali vengono impiantati, spesso per via sottocutanea, e metastasi provengono da organicamente capannone cellule tumorali. 14,15 E &#39;importante per iniettare una quantità appropriata di cellule B16 / BL6 nelle vene coda dei topi. Troppi, ei polmoni saranno coperti con metastasi e la vicina focolai saranno indistinguibili gli uni dagli altri. Troppo pochi, e l&#39;influenza di un agente terapeutico sarà indistinguibile causa intrinseca varizioni tra le iniezioni. Per ottenere un numero ottimale di foci sui polmoni dei C57BL 6 topi /, è necessario correlare il numero di cellule iniettate con la quantità di foci metastatici stabilito sulla superficie dei polmoni tenendo conto la distinguibilità dei singoli foci. Questo protocollo dimostrerà un modello murino di melanoma metastatico in topi C57BL / 6.

<table><tbody><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Corning</td><td>MT15040CM</td><td></td></tr><tr><td>Phase Contraast Hemacytometer</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Fine IV Insulin Syringes</td><td>BD</td><td>14-829-1D</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Alcohol Prep Pads</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Restrainer</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9999969</td><td>Restrainer choice depends on age/size of mice</td></tr><tr><td>Heating Pad</td><td>Harry Schein</td><td>NC0012697</td><td>Optional</td></tr></tbody></table>

injection of syngeneic murine melanoma cells to determine their metastatic potential in the lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Su ispezione visiva, la variazione foci superficie è evidente. Contando il numero di tumori sotto un microscopio da dissezione dovrebbe produrre una relazione lineare tra il numero di cellule tumorali iniettate e il numero di foci risultante e numerabile. Utilizzando un numero ottimale di cellule iniettabili, l&#39;obiettivo è quello in cui i polmoni non sono completamente coperti, in quanto sono a 500.000 cellule / ml in figura 1A, e non troppo scarsamente coperte, come sono a 62.500 cellule / ml e 125.000 cellule / ml. Questo è anche quantificabile dalla correlazione lineare (Figura 1B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54039/54039fig1.jpg" /> Figura 1. Lung Foci risultante dalla vena della coda hanno iniettato cellule B16 / BL6. (A) foci polmone può essere visualizzata sulla superficie dei polmoni da C57BL / 6 topi come masse circolari marrone (foci rappresentante alle frecce). Come le tanelità della coltura cellulare iniettato (sopra ogni immagine) aumenta, così fa il corrispondente numero di focolai risultante polmone (sotto ogni immagine). I polmoni del mouse con la più alta densità di cellule iniettate ha la maggiore copertura visiva di foci del polmone. Barre di scala rappresentano 20 mm. (B) enumerazione dei fuochi polmone rispetto alla densità di coltura cellulare. Esiste una relazione approssimativamente lineare sopra 125.000 cellule / ml, come determinato da emocitometro. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54039/54039fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Iniezione di cellule singenici del topo melanoma per determinare il loro potenziale metastatico nei polmoni

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

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17.6K Views.  Beth Israel Deaconess Medical Center & Harvard Medical School. Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

Video: Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Metastasi di analisi sperimentale

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

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Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

Ricerca sul cancro

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a primary tumor has been induced by tamoxifen treatment, an increase in metastatic burden is observed within 4-6 weeks after induction. This paper shows how Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) imaging can be exploited to monitor the increase in metastatic involvement of the inguinal lymph nodes by measuring the increase in their volume.
The UHFUS system is used to scan anesthetized mice with a UHFUS linear probe (22-55 MHz, axial resolution 40 &#181;m). B-mode images from the inguinal lymph nodes (both left and right sides) are acquired in a short-axis view, positioning the animals in dorsal recumbency. Ultrasound records are acquired using a 44 &#181;m step size on a motorized mechanical arm. Afterward, two-dimensional (2D) B-mode acquisitions are imported into the software platform for ultrasound image post-processing, and inguinal lymph nodes are identified and segmented semi-automatically in the acquired cross-sectional 2D images. Finally, a total reconstruction of the three-dimensional (3D) volume is automatically obtained along with the rendering of the lymph node volume, which is also expressed as an absolute measurement.
This non-invasive in vivo technique is very well tolerated and allows the scheduling of multiple imaging sessions on the same experimental animal over 2 weeks. It is, therefore, ideal to assess the impact of pharmacological treatment on metastatic disease.

Melanoma is a very aggressive disease that quickly spreads to other organs. This protocol describes the application of ultra-high-frequency ultrasound imaging, coupled with 3D rendering, to monitor the volume of the inguinal lymph nodes in the Braf/Pten mouse model of metastatic melanoma.

Analisi del volume dei linfonodi mediante imaging ecografico ad altissima frequenza nel modello murino geneticamente modificato braf/Pten del melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was established using robust, reproducible in vivo models and standardized methods to identify novel players in melanoma metastasis. This approach allows for data inference at specific experimental stages to precisely characterize a gene's role in metastasis. Models are established by introducing genetically modified melanoma cells via intracardiac, intradermal, or subcutaneous injections into mice, followed by monitoring with serial in vivo imaging. Once preestablished endpoints are reached, primary tumors and/or metastases-bearing organs are harvested and processed for various analyses. Tumor cells can be sorted and subjected to any of several 'omics' platforms, including single-cell RNA sequencing. Organs undergo imaging and immunohistopathological analyses to quantify the overall burden of metastases and map their specific anatomic location. This optimized pipeline, including standardized protocols for engraftment, monitoring, tissue harvesting, processing, and analysis, can be adopted for patient-derived, short-term cultures and established human and murine cell lines of various solid cancer types.

This article describes a workflow of techniques employed for testing novel candidate mediators of melanoma metastasis and their mechanism(s) of action.

Una solida piattaforma di scoperta per l'identificazione di nuovi mediatori delle metastasi del melanoma

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>Imaging in vivo per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Tumore primario e isolamento delle cellule MEF per studiare Lung Metastasi

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex vivo dal vivo Imaging di polmone metastasi e il loro micro

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Iniezione di cellule singenici del topo melanoma per determinare il loro potenziale metastatico nei polmoni

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Metastasi di analisi sperimentale

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Analisi del volume dei linfonodi mediante imaging ecografico ad altissima frequenza nel modello murino geneticamente modificato braf/Pten del melanoma

Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Una solida piattaforma di scoperta per l'identificazione di nuovi mediatori delle metastasi del melanoma

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

Tumore primario e isolamento delle cellule MEF per studiare Lung Metastasi

Ex vivo dal vivo Imaging di polmone metastasi e il loro micro