国立癌研究所の助成金1R03CA172923によって部分的にサポートされています。

倫理文：研究におけるマウスの使用は、それが基本的な生物学のまたは疾患の最終的な治療に向けた人間の理解を進める可能性があるインスタンスでのみ許容されます。 1.注文<ol><li>購入雌のC57BL / 6マウス（6歳 - 8週間）、群当たり5匹のマウス。マウスのための数日間は、調整することができます。 </li></ol> B16-BL6細胞の調製<ol><li>無菌フード内で37度のインキュベーターと場所から細胞培養プレートを取り外します。プレートは、B16-BL6マウス黒色腫細胞と約70％コンフルエントであるべきです。大きなコンフルエント細胞に転移能を変化させることができます。 </li><li> 1分間放置し、プレートあたり1ミリリットル0.05％のトリプシン-EDTAを追加し、トリプシン培地溶液を吸引除去します。 </li><li>プレート当たりトリプシンの1ミリリットルを加え、10分間インキュベーターにプレートを返します。 </li><li>無菌フードにインキュベーターからプレートを移動させた後、無血清ローズウェルパーク記念研究所Mediuの4ミリリットルを追加各プレートにメートル（RPMI）。 </li><li>滅菌、電動式ピペットを用いて細胞を収集します。細胞を破壊するために、非常にわずかな角度で押したチップを用いて、プレートの底から細胞を取り出します。そうでなければ排出針を詰まらせる可能性があり、細胞塊の十分な分離を確実にするために数回繰り返します。思い出すと50mlコニカルチューブに移します。 </li><li>細胞密度を決定するために、血球計数器を使用してください。一定のB16-BL6細胞の総数を維持し、無血清RPMIの量を決定すること0、0.065、0.015、0.25、0.5万個の細胞/ mlの最終濃度に到達するために必要。 </li><li>同様に15ミリリットルコニカルチューブに50ミリリットルチューブ内のメディアを分取。 5分間、2250×gでコニカルチューブを遠心。メディアをデカント。無血清RPMIの適切な量を追加し、血球計数器を経由して所望の細胞密度を確認します。追加のRPMIを追加するか、回転し、それに応じて小さくVOLUME-に再懸濁することによりdensities-調整します。 </li><li>アリコート500μlの氷の上で標識された1.8ミリリットルチューブにそれぞれの細胞懸濁液。 </li></ol> 3.尾静脈注射<ol><li>尾が保持しているマウスを、取り、マウスレストレーナーにリア最初にそれを導きます。制止のメインチャンバー内の胴体により、外側尾で、拘束の終わりに向かってマウスを引っ張ります。マウスが安全になるまでプッシュし続け、拘束具、プランジャーを挿入します。 </li><li>外側尾静脈のいずれかが上を向いていることを90度、マウスを回転させます。アルコールパッドを使用して、積極的に尾静脈が最も表示されている場合は特に、マウスの尾の側面を清掃してください。 注：良い照明はB57BL / 6Jマウスでの効果的な尾静脈の可視化のために不可欠です。加熱ランプまたは加熱手術パッドは、必要ではないが、また、尾静脈の容積を増加させることによって助けます。 </li><li>無菌培養フードで2万個の細胞/ mlのチューブからの細胞培養培地を300μlを収集します。秒をフリック、針を反転IDEとシリンジから気泡を排出するために、プランジャーを押します。 250μlの最終容量をもたらすことが文化-RPMIを取り出します。 </li><li>非利き手でマウスの尾を拡張します。非利き手の人差し指と親指で押し下げ、尾の先端部に上昇尾の近位端部と尾を持ちます。 注：このように、尾静脈を横位置に保持され、尾部のより遠位部分の可能な一致するエントリと、拘束面に平行です。 </li><li>そもそも分下向きの角度で、遠位端に向かって、尾静脈に針を挿入し、さらに挿入時に尾静脈の角度に合わせて、針を調整（針に注射器の相対的なプランジャー端を下げます） 。 </li><li>尾静脈に針約1cmを挿入します。挿入後、着実に針を保持し、プランジャーをプッシュし始めます。 注針が尾静脈内にあり、針の端部がNである場合にotのは、メディアが静脈に妨げられることなく流れるべき遮ら。効果的な注入は、静脈からの血液クリアランスによって特徴付けられます。そこに抵抗がある、またはバブルは、注射中の部位で形成し始める場合は、針を除去し、尾静脈に沿ってより近位の場所で再試行してください。 </li><li>静脈から針を外し、それを捨てます。任意の出血を止めるために進入部位に対するガーゼを保持します。 </li><li>拘束からプランジャーを取り外し、受信者のケージにマウスを置きます。 </li><li>他のすべての濃度について繰り返します。 注：肺病巣確立は約2取る-細胞株と焦点の所望の大きさに応じて変動して、3週間を暫定で9に 、マウスは、過度のあえぎのように、早期の安楽死を保証可能性が症状を監視する必要があります。 </li></ol> 4.肺病巣を数えます<ol><li> CO 2を CO 2チャンバー内に配置し、100％に曝露することによって、マウスを安楽死させます</sUB&gt;は5分間分あたりチャンバ容積の10から30までパーセントで導入しました。頚椎脱臼で従ってください。 </li><li>発泡スチロールの上でマウスをスプレイ。手術用はさみを使用して、胸骨に沿って外科的切開を作成します。 </li><li>胸骨切開の上からと胸郭を露出させ、マウスの肩に向かって分岐の両方、二つの追加の切開を行います。 </li><li>肺と心臓を露出し、胴体から胸郭を削除するには、2カット、胸骨の側面に沿って各してください。 </li><li>手術用ピンセットで心を持ち、マウスから心臓や肺を解放し、食道と気管をカット。より良い視覚化のために、10倍の倍率で、解剖顕微鏡の下に置きます。 </li><li>肺から心臓を解剖し、胸腺を除去し、2つだけ肺を残します。 </li><li>解剖範囲の下の肺では、肺の病巣をカウントし始めます。各病巣は、肺の表面上に円形、茶色の出しゃばりとして表示されます。 <ol><li>ためにマウスとの間の整合性は、葉の表面に病巣の数をカウントし、その葉を反転します。 4ローブの各操作を行うと、個別に簡単にカウントすることができます。 </li></ol></li><li>遺体を捨て、そうでない場合は、保存して、IHCを行った場合、肺を修正。 </li></ol>

<ol>
	<li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perspective+on+cancer+cell+metastasis.">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331, 1559-1564 (2011).</li><li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition.">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> J Clin Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).</li><li>Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+interactions+with+the+extracellular+matrix+during+invasion+and+metastasis.">Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis.</a> Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).</li><li>Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+disease.">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease.</a> Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunoediting:+from+iimmunosurveillance+to+tumor+escape.">Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape.</a> Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).</li><li>Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+and+mesenchymal-epithelial+transition+in+carcinoma+progression.">Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression.</a> J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).</li><li>Kang, Y., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transitions:+Twist+in+development+and+metastasis.">Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis.</a> Cell. 118, 277-279 (2004).</li><li>Hodi, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+survival+with+Ipilimumab+in+patients+with+metastatic+melanoma.">Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma.</a> NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).</li><li>Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+health+burden+and+economic+costs+of+cutaneous+melanoma+motality+by+race/ethnicity-United+States.">The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 65, 133-143 (2011).</li><li>Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis+review:+from+bench+to+bedside.">Metastasis review: from bench to bedside.</a> Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).</li><li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+metastasis+predetermined.">Is metastasis predetermined.</a> Mol. Oncol. 1 (3), 263-264 (2007).</li><li>Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+differentially+expressed+in+B16+murine+melanoma+sublines+with+different+metastatic+potentials.">Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials.</a> Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).</li><li>Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC.">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406, 532-535 (2000).</li><li>Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+metastasis.">Tumor cell metastasis.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5 (2), 87-114 (1986).</li><li>Elkin, M., Vlodavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tail+vein+assay+of+cancer+metastasis.">Tail vein assay of cancer metastasis.</a> Curr Protoc in Cell Biol. , (2001).</li><li>Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+degradation+of+basement+membranes+and+extracellular+matrix+and+their+regulation+by+TGF-beta+in+invasive+carcinomas+(Review).">Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review).</a> Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).</li><li>Hart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+selection+and+characterization+of+an+invasive+variant+of+the+B16+melanoma.">The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma.</a> Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).</li><li>Overwijk, W. W., Restifo, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N.P.+B16+as+a+Mouse+Model+for+Human+Melanoma.">N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma.</a> Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).</li></ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

尾静脈注射からの循環腫瘍細胞の一次成長のサイトを回避し、時折遠隔地の毛細血管床で自分自身を確立し、血流やリンパ系のような経路を通って移動するの転移を表す。上記の14のプロトコルは二次のモデルとして機能します転移。注入されたB16-BL6細胞の最適な数では、実験者は、癌細胞の転移に投与された薬剤または免疫細胞集団、ポスト中和の相対的な効果を決定することができます。 このプロトコルには限界があります。循環腫瘍細胞が転移する能力のために選択され、従って、非免疫原性である、主要組織適合性複合体クラスの下位レベルの1分子を有している。12さらに、転移の多数の突然のクラスタ化導入は、患者における一般的なシナリオとは異なっていますここで、転移性腫瘍細胞の少数原発腫瘍の場所から長期間にわたって放散します。また、静脈内導入した腫瘍細胞は、組織培養物からではなく、原発腫瘍の起源です。したがって、これらの細胞は、細胞接着、遊走、免疫認識および受信者の臓器の確立の変化に起因する二次転移とは違っている。15,16 代替プロトコルは、原発腫瘍の発生や得られた「自発的な」肺転移の分析のためのB16 / BL6の皮下注射であろう。これらの「自発的」転移がより密接に人間の患者のものと一致する、彼らの &quot;実験&quot;の対応よりも多くの不均一性を含んでいることが分かってきました。プロトコルは、転移の実験化合物の影響を決定する能力に制限されます。外側尾静脈注射で、血流中に注入黒色腫細胞の数は、hを介して近似することができます。emocytometer。 「自発的」転移と、しかし、肺病巣を生じたの数に追加の変数を追加し、腫瘍の間に大きな不均一性がある。16 結論として、尾静脈B16-BL6マウス黒色腫モデルは、転移の治療または免疫療法の影響を決定するための単純なモデルを表します。静脈循環腫瘍細胞を注射することによって、研究者は、患者が後転移を、ある程度まで、複製することができます。癌患者における転移性腫瘍細胞の破壊的な影響を考慮すると、このモデルは、転移の多段階プロセスを理解するための強力なツールです。

転移は悪性腫瘍の患者の死亡の主要な原因です。癌細胞の転移性播種の過程はよくわかっていないが、隣接組織への浸潤を含む、いくつかの段階、リンパ管および血管系への血管内、循環系内の生存と転座、転移部位の血管から血管外漏出が関与すると表示され、適応新しい新しいサイトの微小環境、および二次性腫瘍の増殖および形成することにより、新しいサイトでの植民地に。1、これらの生物学的事象のそれぞれは、転移性腫瘍細胞の形質転換、普及および生存を伴います。例えば、細胞外マトリックスとの正常な相互作用と相まって間葉表現型への腫瘍細胞の上皮表現型の変換は、隣接する組織に侵入し、身体の他の部位に転移することを可能に。2,3さらに、これらの転移細胞循環血流内で生き残るためには、ホストからの免疫監視を回避する必要があります。本体内に離れた部位に移植された場合4,5最後に、腫瘍細胞が増殖し、二次腫瘍を形成するために、それらの微小環境に適応しなければならない。6,7ので転移は、がん患者の間で共通の現象であるが、転移性腫瘍細胞は、治療的介入の影響を受けやすい脆弱性の複数の領域を持っています。 メラノーマの免疫原性の性質、および免疫療法の最近の関心を考えると、黒色腫のためのモデルがますます便利です。8米国だけでも、メラノーマは年間推定9000人の死亡の原因である。黒色腫転移の9一般的な場所は、骨、脳であります、肝臓、および肺。遠隔部位への転移の大部分は、血流を介して起こります。血液中の循環腫瘍細胞は、免疫クリアランスを回避遠位臓器の毛細血管床に到達しなければならないし、正常に自分自身を確立するために、血管の内皮細胞を介して侵入する。4-7,10、11 転移の一般的および病原性の現象を模倣するために、マウスB16-BL6細胞株を作成しました。親のC57BL / 6メラノーマ細胞株B16-F0の被相続人は、B16-BL6は、膀胱膜浸透のための6連続した選択に続いて（B16-F10の結果）は、静脈内注射からの肺転移のための10の連続した​​選択範囲の最終産物です。 12このように、静脈内注射、特にとき、マウスにおける転移巣の確立のための信頼性の黒色腫細胞株である。13 B16 / BL6細胞の移植および増殖を可能にするために、二つ以上の週間続くB57BL / 6マウスの尾静脈へのB16-BL6細胞の十分な量の注射後、転移病巣は、肺に形成します。解剖顕微鏡による安楽死や検査の際、数個々の病巣の存在を定量することができます。注入されたB16-BL6細胞の数は、肺の表面に形成された病巣の数と相関し、これは、今度は、用量転移効果を確立するために使用することができます。このモデルは、既知の転移性細胞は、調査の肺、肝臓、または他の器官の迅速かつ予測可能な広がりとの確立を容易に、血流に直接導入される「実験的転移」として知られています。これは、しばしば、皮下、腫瘍細胞が移植されている「自然転移」とは対照的であり、転移は有機癌細胞を流し由来する。14,15 マウスの尾静脈にB16 / BL6細胞の適切な量を注入することが重要です。あまりにも多く、および肺は、転移で覆われると、隣接病巣が互いに区別できないであろう。少なすぎると、治療薬の影響が原因で本来のバリに識別できないだろう注射の間ations。 C57BL / 6マウスの肺の病巣の最適な数を得るためには、アカウントに個別の識別性をながら、肺の表面上に確立された転移巣の量を注入した細胞の数を相関させる必要があります焦点。このプロトコルは、C57BL / 6マウスに対する転移性マウス黒色腫モデルのデモンストレーションを行います。

<table><tbody><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Corning</td><td>MT15040CM</td><td></td></tr><tr><td>Phase Contraast Hemacytometer</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Fine IV Insulin Syringes</td><td>BD</td><td>14-829-1D</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Alcohol Prep Pads</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Restrainer</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9999969</td><td>Restrainer choice depends on age/size of mice</td></tr><tr><td>Heating Pad</td><td>Harry Schein</td><td>NC0012697</td><td>Optional</td></tr></tbody></table>

injection of syngeneic murine melanoma cells to determine their metastatic potential in the lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

目視検査の際に、表面の病巣の変化は明らかです。解剖顕微鏡下で腫瘍の数を計数すること注入腫瘍細胞の数と得られると数えられる病巣の数の間の直線関係を生じるはずです。注射用細胞の最適な数を使用して、彼らは、図1Aの500,000個の細胞/ mlであるように、目標は、肺が完全に覆われていないものであり、彼らは62,500細胞/ mlと125,000個の細胞であるとしてあまりにもまばら/、カバーされていませんミリリットル。これはまた、線形相関（ 図1B）によって定量可能です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54039/54039fig1.jpg" /> 尾静脈注射したB16 / BL6細胞から得られた図1肺病巣。 （A）肺病巣は、茶色の円形の塊（矢印の下で代表病巣）としてC57BL / 6マウスからの肺の表面に可視化することができます。洞穴のように（各画像上）注射し、細胞培養の性が増えるので、（各画像の下）、肺病巣を生じた対応する数がありません。注入した細胞の密度が最も高いマウスからの肺は、肺病巣の最大の視覚的なカバレッジを持っています。スケールバーは20mmでを表す。細胞培養密度に対して肺病巣の相対的な（B）列挙。血球計によって決定されるように125,000細胞/ ml以上のほぼ直線的な関係が存在する。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54039/54039fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs at JoVE.com

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

同系マウスメラノーマ細胞の注入は、肺におけるそれらの転移能を決定するために、

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

injection-syngeneic-murine-melanoma-cells-to-determine-their

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

17.6K ビュー.  Beth Israel Deaconess Medical Center & Harvard Medical School. Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

ビデオ: Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

実験的転移アッセイ

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

医学

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification and testing of novel therapeutic targets that will facilitate the development of better treatments for metastatic disease requires preclinical in vivo models. Demonstrated here is a syngeneic mouse model for assaying breast cancer metastatic colonization and subsequent growth. Metastatic cancer cells are stably transduced with viral vectors encoding firefly luciferase and ZsGreen proteins. Candidate genes are then stably manipulated in luciferase/ZsGreen-expressing cancer cells and then the cells are injected into mice via the lateral tail vein to assay metastatic colonization and growth. An in vivo imaging device is then used to measure the bioluminescence or fluorescence of the tumor cells in the living animals to quantify changes in metastatic burden over time. The expression of the fluorescent protein allows the number and size of metastases in the lungs to be quantified at the end of the experiment without the need for sectioning or histological staining. This approach offers a relatively quick and easy way to test the role of candidate genes in metastatic colonization and growth, and provides a great deal more information than traditional tail vein metastasis assays. Using this approach, we show that simultaneous knockdown of Yes associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with a PDZ-binding motif (TAZ) in breast cancer cells leads to reduced metastatic burden in the lungs and that this reduced burden is the result of significantly impaired metastatic colonization and reduced growth of metastases.

The described approach combines experimental tail vein metastasis assays with in vivo live animal imaging to allow real-time monitoring of breast cancer metastasis formation and growth in addition to the quantification of metastasis number and size in the lungs.

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

がん研究

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a primary tumor has been induced by tamoxifen treatment, an increase in metastatic burden is observed within 4-6 weeks after induction. This paper shows how Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) imaging can be exploited to monitor the increase in metastatic involvement of the inguinal lymph nodes by measuring the increase in their volume.
The UHFUS system is used to scan anesthetized mice with a UHFUS linear probe (22-55 MHz, axial resolution 40 &#181;m). B-mode images from the inguinal lymph nodes (both left and right sides) are acquired in a short-axis view, positioning the animals in dorsal recumbency. Ultrasound records are acquired using a 44 &#181;m step size on a motorized mechanical arm. Afterward, two-dimensional (2D) B-mode acquisitions are imported into the software platform for ultrasound image post-processing, and inguinal lymph nodes are identified and segmented semi-automatically in the acquired cross-sectional 2D images. Finally, a total reconstruction of the three-dimensional (3D) volume is automatically obtained along with the rendering of the lymph node volume, which is also expressed as an absolute measurement.
This non-invasive in vivo technique is very well tolerated and allows the scheduling of multiple imaging sessions on the same experimental animal over 2 weeks. It is, therefore, ideal to assess the impact of pharmacological treatment on metastatic disease.

Melanoma is a very aggressive disease that quickly spreads to other organs. This protocol describes the application of ultra-high-frequency ultrasound imaging, coupled with 3D rendering, to monitor the volume of the inguinal lymph nodes in the Braf/Pten mouse model of metastatic melanoma.

メラノーマのBraf/Pten遺伝子操作マウスモデルにおける超高周波超音波イメージングによるリンパ節容積の解析

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was established using robust, reproducible in vivo models and standardized methods to identify novel players in melanoma metastasis. This approach allows for data inference at specific experimental stages to precisely characterize a gene's role in metastasis. Models are established by introducing genetically modified melanoma cells via intracardiac, intradermal, or subcutaneous injections into mice, followed by monitoring with serial in vivo imaging. Once preestablished endpoints are reached, primary tumors and/or metastases-bearing organs are harvested and processed for various analyses. Tumor cells can be sorted and subjected to any of several 'omics' platforms, including single-cell RNA sequencing. Organs undergo imaging and immunohistopathological analyses to quantify the overall burden of metastases and map their specific anatomic location. This optimized pipeline, including standardized protocols for engraftment, monitoring, tissue harvesting, processing, and analysis, can be adopted for patient-derived, short-term cultures and established human and murine cell lines of various solid cancer types.

This article describes a workflow of techniques employed for testing novel candidate mediators of melanoma metastasis and their mechanism(s) of action.

メラノーマ転移の新規メディエーターの同定のための堅牢な発見プラットフォーム

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...

In Vivo Imaging to Measure Spontaneous Lung Metastasis of Orthotopically-injected Breast Tumor Cells

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple opportunities for therapeutic intervention, and the ability to accurately model them in mice is critical to evaluate their effects. Here, a step-by-step protocol is presented for the establishment of orthotopic primary breast tumors and the subsequent monitoring of the establishment and growth of metastatic lesions in the lung using in vivo bioluminescence imaging. This methodology allows for the evaluation of treatment or its biological effects along the entire range of metastatic development, from primary tumor escape to outgrowth in the lungs. Breast orthotopic tumors are generated in mice via injection of a luciferase-labeled cell suspension in the 4th mammary gland. Tumors are allowed to grow and disseminate for a specific amount of time and are then surgically resected. Upon resection, spontaneous lung metastasis is detected, and the growth over time is monitored using in vivo bioluminescence imaging. At the desired experimental endpoint, lung tissue can be collected for downstream analysis. The treatment of established, clinically evident metastasis is critical to improve outcomes for stage IV cancer patients, and it can be evaluated through tail vein models of experimental lung metastasis. However, metastatic dissemination occurs early in breast cancer, and many patients have latent, subclinical disseminated disease after surgery. Utilization of spontaneous models such as this one provides the opportunity to study the whole spectrum of the disease, especially the systemic effects driven by treatment of the primary tumor such as pre-metastatic niche priming, and evaluate treatments on dormant and subclinical disease after surgery.

<meta charset="utf8"></head><body>同所性注射された乳房腫瘍細胞の自発的な肺転移を測定するためのin vivoイメージング

The manuscript describes a methodology for the establishment as well as longitudinal growth monitoring of spontaneous lung metastasis from orthotopically-injected breast tumors, amenable to intervention at all stages of the metastatic cascade.

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

Metastasis remains the primary cause of cancer-related death. The succession of events that characterize the metastatic cascade presents multiple ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

ex vivoでのライブ肺転移のイメージングとその微小環境

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

同系マウスメラノーマ細胞の注入は、肺におけるそれらの転移能を決定するために、

要約

さらに動画を探す

実験的転移アッセイ

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

メラノーマのBraf/Pten遺伝子操作マウスモデルにおける超高周波超音波イメージングによるリンパ節容積の解析

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

メラノーマ転移の新規メディエーターの同定のための堅牢な発見プラットフォーム

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

ex vivoでのライブ肺転移のイメージングとその微小環境

同系マウスメラノーマ細胞の注入は、肺におけるそれらの転移能を決定するために、

要約

さらに動画を探す

実験的転移アッセイ

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

メラノーマのBraf/Pten遺伝子操作マウスモデルにおける超高周波超音波イメージングによるリンパ節容積の解析

ヒト前立腺癌転移の同所マウスモデル

メラノーマ転移の新規メディエーターの同定のための堅牢な発見プラットフォーム

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ 同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

原発腫瘍と肺転移を研究するためのMEF細胞の単離

ex vivoでのライブ肺転移のイメージングとその微小環境

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング

インビボ同所注射された乳房腫瘍細胞の自然肺転移を測定するためのイメージング