Name: optogenetic functional mri
Uploaded: 2016-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
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This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director's New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.

Etica Dichiarazione: procedure sperimentali qui sono stati approvati dal Comitato di Stanford University istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC). 1. Preparazione Cavi Patch e una boccola impianti Nota: Anche se cavi patch e gli impianti puntale sono disponibili in commercio, la produzione di questi in-casa consente disegni di specialità e costerà meno. <ol><li> Per preparare un cavo patch fibra per fornire luce dal laser per l&#39;impianto nel cervello, prima fendere la fibra ottica alla lunghezza desiderata. <ol><li> Utilizzando una mannaia di fibra, terminare la fibra ottica per produrre un fine appartamento al punto di terminazione. Se la fibra è stato rivestito con un rivestimento, togliere la giacca con un attrezzo fibra-stripping anticipo. </li><li> Fendere l&#39;altra estremità della fibra ottica per produrre la lunghezza desiderata per il cavo, assicurando che il cavo sia sufficientemente lungo da estendersi dalla sorgente luminosa per l&#39;animale all&#39;interno del foro dilo scanner. </li></ol></li><li> Mescolare una piccola quantità di colla epossidica in un rapporto 1: 1 su un foglio di alluminio poco prima del passaggio successivo, come colla epossidica diventa troppo viscosa per uso 5 min dopo la miscelazione. </li><li> Utilizzando un bastoncino di legno, applicare delicatamente colla epossidica alla parte della fibra che verrà inserito all&#39;interno della parte concava della boccola ceramica e poi applicare una piccola goccia sulla superficie della parte piatta del puntale. Dopo inserendolo nella boccola, assicura che un piccolo spezzone di fibra (&lt;0,5 mm) sporge dalla parte piatta del puntale ceramico. Lasciare che la colla epossidica per indurire O / N per ottenere risultati ottimali. </li><li> Sul lato del cavo patch in fibra ottica che si collega alla sorgente di luce laser, applicare delicatamente colla epossidica alla parte della fibra che verrà inserito all&#39;interno del lato concavo della ghiera del connettore FC / PC e quindi applicare una piccola goccia sulla superficie della parte piatta del puntale. Dopo aver inserito nella ghiera, garantireche un piccolo spezzone di fibra (&lt;0,5 mm) sporge dalla parte piatta del puntale. Lasciare che la colla epossidica per indurire O / N per ottenere risultati ottimali. </li><li> Lucidare l&#39;estremità piatta delle ghiere per entrambi i lati del cavo utilizzando un disco di lucidatura utilizzando pinzette per applicare una leggera pressione verso il basso sulla ghiera rendendo rotazioni figura-8 su fogli di ossido di alluminio lappatura (da 3 micron a 1 micron a 0,3 micron graniglia ). </li><li> Esaminate l&#39;estremità piatta del puntale con un microscopio ad ingrandimento 100X. Assicurarsi che la superficie dell&#39;estremità piatta, compresa la superficie della fibra ottica in sé, è priva di qualsiasi colla epossidica; continuare lucidatura se colla epossidica rimane sulla superficie. Assicurarsi che la superficie in fibra ottica non è rotto o tagliato. ATTENZIONE: Assicurarsi che il personale prendono corsi di formazione sulla sicurezza del laser appropriate e indossare occhiali di protezione laser prima di maneggiare apparecchiature laser. </li><li> Collegare il cavo patch in fibra ottica per la sorgente di luce laser attraverso il connettore FC / PC e allineare il fpunta Iber al punto focale del giunto. Misurare la potenza di trasmissione della luce della fibra con un misuratore di potenza per garantire un&#39;adeguata emissione luminosa. Nota: I seguenti passaggi sono per la preparazione di puntali di ceramica con fibre ottiche per l&#39;impianto cronico nel cervello; puntali di ceramica sono vuoti al centro e portano fibre ottiche per fornire luce da un cavo patch ad una regione di interesse (ROI) nel cervello. </li><li> Utilizzando una mannaia di fibra, terminare la fibra ottica per produrre un fine appartamento al punto di terminazione. Se la fibra è stato rivestito con un rivestimento, togliere la giacca con un attrezzo fibra-stripping anticipo. </li><li> Fendere l&#39;altra estremità della fibra ottica per produrre la lunghezza desiderata per l&#39;impianto nel cervello. Determinare la lunghezza della fibra usando un atlante stereotassiche di indirizzare il ROI all&#39;interno del cervello. <ol><li> Ad esempio: per indirizzare ippocampo dorsale di ratto che è di 3,5 mm sotto bregma, assicurarsi che la lunghezza della fibra sporge dal ferrule è 3,5 mm + 0,25 mm, che rappresentano per lo spessore del cranio e che consentono di margine di errore. Pertanto, controllare che la lunghezza finale della fibra è di 3,5 mm + 0,25 mm + 10.5 mm (lunghezza del puntale) = 14,25 millimetri. </li></ol></li><li> Mescolare una piccola quantità di colla epossidica in un rapporto 1: 1 su un foglio di alluminio poco prima del passaggio successivo (la colla epossidica diventa troppo viscosa per uso 5 min dopo la miscelazione). </li><li> Utilizzando un bastoncino di legno, applicare delicatamente colla epossidica alla parte della fibra che verrà inserito all&#39;interno della parte concava della boccola ceramica e poi applicare una piccola goccia sulla superficie della parte piatta del puntale. Dopo inserendolo nella boccola, assicura che un piccolo spezzone di fibra (&lt;0,5 mm) sporge dalla parte piatta del puntale ceramico. Lasciare che la colla epossidica per indurire O / N per ottenere risultati ottimali. </li><li> Lucidare l&#39;estremità piatta del puntale utilizzando un disco di lucidatura utilizzando pinzette per applicare una leggera pressione verso il basso sulla ghiera rendendo figura-8 di rotaziones su alluminio fogli ossido di lappatura (da 3 micron a 1 micron a 0,3 micron grit). </li><li> Esaminate l&#39;estremità piatta del puntale con un microscopio ad ingrandimento 100X. Assicurarsi che la superficie dell&#39;estremità piatta, compresa la superficie della fibra ottica in sé, è priva di qualsiasi colla epossidica; continuare lucidatura se colla epossidica rimane sulla superficie. Assicurarsi che la superficie in fibra ottica non è rotto o tagliato. </li><li> Coppia la ferrula lucidato ad un cavo patch fibra ottica con un manicotto ghiera e collegare il cavo patch ad una sorgente di luce laser. Misurare la potenza di trasmissione della luce sulla punta della fibra con un misuratore di potenza per garantire un&#39;adeguata efficienza. </li><li> Tenere un registro della potenza richiesta dal puntale del cavo patch per ciascun impianto ghiera per emettere il livello di potenza desiderato sulla punta della fibra ottica (2,5 mW in questo protocollo). Eliminare ghiere con un tasso di attenuazione di oltre il 50% e con il modello di uscita non circolare. </li></ol> 2. Stereotassica ImpChirurgia lantation e Virus iniezione <ol><li> Assicurarsi che tutte le procedure sperimentali che prevedono l&#39;uso di animali sono approvati dal IACUC locale. Mantenere condizioni asettiche durante interventi chirurgici di sopravvivenza seguendo procedure asettiche, compreso l&#39;uso di guanti sterili, mascherine sterili, teli chirurgici sterili e strumenti chirurgici sterilizzati. ATTENZIONE: Assicurarsi che i chirurghi indossano un equipaggiamento di protezione individuale (DPI) tra cui gli occhiali di sicurezza prima di iniziare la procedura. Seguire le procedure di biosicurezza standard quando si lavora con vettore adeno-associato (AAV), avendo cura di evitare spruzzi. Smaltire i rifiuti AAV in un contenitore per rischio biologico. </li><li> Caricare una siringa microlitro con abbastanza AAV per l&#39;iniezione nell&#39;animale più extra per tenere conto di eventuali perdite di volume (totale di 4 ml per animale), mantenendo la siringa in ghiaccio prima dell&#39;uso. In questo protocollo, si usa AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP ad un titolo di 4x10 12 VG / ml. Posto l&#39;animale sotto Isofluranoe anestesia con una camera di induzione, collegato ad un isoflurano set vaporizzatore precisione al 3 - 4% con una sorgente di gas di ossigeno. </li><li> Radersi la testa con un rasoio elettrico ed eseguire un lavaggio chirurgico tripla sulla pelle con betadine e un etanolo risciacquo 70%. </li><li> Una volta che l&#39;animale è in anestesia profonda (controllare il riflesso punta e tasso di respirazione), immobilizzare il cranio dell&#39;animale in un apparato stereotassico con borchie di posizionamento intra-auditive e la barra dei denti. Nota: L&#39;intera procedura avrà 1 - 2 ore, da induzione dell&#39;anestesia al recupero. </li><li> Impostare l&#39;anestesia ad un livello appropriato (1 - 3% isoflurano sul vaporizzatore) e monitorare continuamente i segni vitali dell&#39;animale, regolando l&#39;anestesia se necessario per mantenere un tasso di respirazione di ~ 40 respiri / min. Somministrare pomata oftalmica sugli occhi dell&#39;animale per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Fare a 15 - 20 mm linea mediana del cuoio capelluto incisione con un bisturi e ritrarre il cuoio capelluto con emostatici chirurgici unttached al periostio. Riferimento lambda e bregma per posizionare la punta sopra le coordinate per il ROI. </li><li> Praticare un piccolo craniotomia (2-3 mm) sopra il ROI con un trapano dentistico, facendo attenzione a non forare il cervello. Inserire lentamente ago attaccato alla siringa microlitri attraverso craniotomia al ROI nel cervello. </li><li> Con un regolatore della pompa microsiringa, iniettare 2 ml di soluzione di vettore nel ROI. Utilizzare una portata di 150 Nl / min per evitare danni ai tessuti. Dopo l&#39;iniezione è terminata, attendere 10 min prima di rimuovere la siringa lentamente, ad una velocità di 0,5 mm / min. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, asciugare la superficie del cranio. Riferimento lambda e bregma confermare coordinate e quindi inserire l&#39;impianto ferrula alla profondità obiettivo (per esempio 3,5 mm sotto bregma per ippocampo dorsale) ad una velocità di circa 0,5 mm / min. Montare l&#39;impianto puntale al cranio con cemento dentale. Dopo il cemento dentale è solidificato, sigillare l&#39;incisione con punti di sutura (size 5-0 per i ratti) attorno al tappo di cemento dentale. </li><li> Dopo l&#39;intervento chirurgico, collocare l&#39;animale nella gabbia singolarmente alloggiato con la metà della gabbia in cima ad un riscaldatore per il recupero anestesia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non mettere l&#39;animale in compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato. </li><li> Per la gestione post-chirurgica del dolore, amministrare la buprenorfina per via sottocutanea ogni 12 ore ad un dosaggio di 0,05 mg / kg per 24 ore. Somministrare polvere antibiotica giornaliero nel sito di incisione per 3 giorni. </li><li> Rimuovere le suture circa due settimane dopo l&#39;intervento chirurgico per evitare formazione di croste. </li><li> Attendere 4 - 6 settimane dopo l&#39;iniezione di virus per sufficiente espressione di geni optogenetic prima di eseguire esperimenti. </li></ol> 3. optogenetic risonanza magnetica funzionale ATTENZIONE: Fare attenzione intorno al campo magnetico permanente di uno scanner MRI. equipm sicuroent, tra cui il generatore di funzioni, fonte di luce, ventilazione, serbatoi capnografo e del gas, sufficientemente lontano (almeno oltre il limite del 5 Gauss). <ol><li> Posto l&#39;animale in anestesia gas con una camera di induzione, collegato ad un isoflurano set vaporizzatore precisione al 5% con una sorgente di gas di ossigeno. </li><li> Una volta che l&#39;animale è in anestesia profonda (riflesso di controllo punta e la frequenza respiratoria), intubare l&#39;animale secondo il protocollo dettagliato nel Rivard et al. (2006) per consentire il monitoraggio di anidride carbonica da capnografia 26. Nota: l&#39;intubazione è fondamentale per il mantenimento di adeguati livelli di CO 2 espiratorio durante l&#39;imaging. </li><li> Fissare l&#39;animale nella culla dello scanner. Nota: In questo protocollo, la culla era su misura prodotta ma tali culle sono anche disponibili in commercio. Le funzioni di ratto culla per fissare l&#39;animale all&#39;interno dello scanner per la consegna di anestesia, aria riscaldata e per la limitazione del movimento. </li><li> Fornire un mix di isoflurano (Ranging da 1.2 specificato - 1,5%) in ossido di azoto di circa il 60% e il 40% di ossigeno tramite tubazione attraverso la culla. Assicurarsi che la testa dell&#39;animale è fissato saldamente al fine di evitare artefatti da movimento. </li><li> Fornire aria riscaldata attraverso il tubo nella culla e inserire un termometro rettale con il lubrificante per controllare la temperatura del corpo. Somministrare pomata oftalmica sugli occhi dell&#39;animale per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Collegare il cavo patch fibra ottica ad una sorgente di luce laser e misurare l&#39;uscita sulla punta del puntale del cavo patch con un misuratore di potenza. </li><li> Regolare il livello di potenza adeguato (determinata in precedenza nella fase 1.15) per produrre il risultato desiderato (2,5 mW in questo protocollo) sulla punta della fibra ottica impiantato all&#39;interno del cervello. Poiché eccessiva potenza dalla fibra ottica può potenzialmente causare danni ai tessuti all&#39;interno del cervello o causare il riscaldamento dei tessuti che produrrà artefatti del segnale, non aumentare significativamente la potenza del laseral di là della produzione destinata. </li><li> Evitare dispersione di luce dall&#39;impianto con un cono di nastro isolante nero e coprire gli occhi dell&#39;animale. Coppia il cavo di fibra all&#39;impianto ghiera sull&#39;animale con un manicotto ghiera. </li><li> Posizionare la bobina sulla testa dell&#39;animale. Inserire la culla con animali nel foro dello scanner. Nota: In questo protocollo, il singolo-ciclo di trasmissione-ricezione bobina è stato personalizzato prodotto e pre-sintonizzata per ricevere la frequenza radio ottimale dal tessuto cerebrale. </li><li> Monitor della frequenza e la temperatura corporea di respirazione nel corso di questo processo, la regolazione del ventilatore artificiale e riscaldamento se necessario per mantenere i valori fisiologici entro i limiti (in modo che CO espiratorio 2 è 3 - 4% ruotando le manopole sul ventilatore per regolare la frequenza ictus e il volume e che la temperatura è di 37 ° C facendo clic sulle frecce per l&#39;impostazione della temperatura). </li><li> Selezionare una sequenza di posizionamento per l&#39;immagine nella posizione testa di animale. Se la Bpioggia non è al iso-center, regolare la posizione testa di animale e ripetere la scansione posizionamento finché il cervello è al iso-center. Selezionare una sequenza spessoramento lineare e fare clic su Carica nella finestra di selezione sequenza. Avanti, fare clic su Start per ridurre disomogeneità del campo magnetico. Nota: Shimming è un passaggio fondamentale che influenzerà direttamente l&#39;integrità dei dati fMRI. </li><li> Selezionare una sequenza T2-weighted e cliccare carico nella finestra di selezione sequenza. Avanti, fare clic su Start per acquisire immagini ad alta risoluzione anatomiche coronali T2 prima di fMRI per controllare l&#39;integrità complessiva del cervello e per confermare la posizione della protesi in fibra ottica. Nota: Queste immagini possono essere utilizzate come sovrapposizioni di anatomia per la serie di scansione ofMRI. </li><li> Collegare cavi BNC dal porto attivazione dello scanner MRI al generatore di funzione in modo che la sorgente di luce laser viene azionato secondo un paradigma stimolazione sperimentale. Nota: In questo protocollo, la stimolazione pAradigm è di 30 sec di base seguita da 20 sec on / off 40 sec per sei minuti. </li><li> Selezionare un multi-slice gradient eco ricordato sequenza (GRE) e fare clic su Carica nella finestra di selezione sequenza. Avanti, scegliere Avvia per acquisire il 35 mm x 35 mm (2D FOV) nel piano fette coronali con 0,5 mm x 0,5 millimetri x 0,5 mm Risoluzione spaziale. Nota: La sequenza GRE qui utilizzato ha un tempo di ripetizione (TR) e il tempo di eco (TE) del TR / TE = 750/12 msec e un flip angle 30 °. </li><li> Al termine della scansione, rimuovere l&#39;animale dallo scanner e monitor finchè ha risvegliato dall&#39;anestesia e può mantenere decubito sternale. </li></ol> 4. Analisi dei dati ofMRI Nota: Le seguenti operazioni vengono eseguite in MATLAB come descritto in una pubblicazione on high-throughput ofMRI 27. <ol><li> Dopo che i dati di scansione grezzo è stato trasferito al computer utilizzato per l&#39;analisi, utilizzare scorrevole ricostruzione finestra per aggiornare l&#39;immagine ogni TR, conuna lettura a spirale quattro Interleave, 750 msec TR e 12 msec tempo di eco per acquisire 23 fette al serie di scansione. Invece di ricostruzione convenzionale dove nuove immagini fMRI sono ricostruiti solo dopo che tutti gli intercalari sono acquisiti per ogni sezione, il metodo di ricostruzione finestra scorrevole ricostruisce le immagini dopo l&#39;acquisizione di ogni Interleaf 27. </li><li> Elaborare i dati grezzi per la ricostruzione bidimensionale gridding, la correzione del movimento, e il calcolo di serie storiche come descritto in precedenza 27. </li><li> Utilizzare un metodo di soglia coerenza per determinare voxel attivati ​​calcolando la modulazione percentuale del segnale BOLD di ciascun voxel rispetto al periodo di riferimento raccolte prima della stimolazione come descritto in precedenza 27. Si calcolano i valori di coerenza come la grandezza della trasformata di Fourier alla frequenza dei cicli di stimolazione ripetuti divisi dai quadrati somma di tutti i componenti di frequenza di 8. </li><li> Utilizzando i dati di serie temporali per ogni vOxel, immagini media al movimento corretto che appartengono alle scansioni consecutive dello stesso paradigma di stimolazione primi. Quindi allineare le immagini medi 4D ad un telaio di coordinate comune con una trasformazione corpo rigido a sei gradi di libertà più scalatura isotropo di confronto all&#39;interno e tra animali come descritto in precedenza 27. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Movimento del soggetto durante l&#39;imaging è una fonte significativa di manufatto che può portare alla corruzione dei dati. Opportunamente garantire l&#39;animale sul supporto di imaging in grado di ridurre al minimo tali artefatti come sarà il mantenimento di adeguati livelli di anestesia. Qui, abbiamo usato isoflurano ma anestetici alternativi, come medetomidina o ketamina e xilazina, dovrebbe essere considerato. Tuttavia, i livelli e la scelta di anestetico possono influenzare molti parametri nel cervello, tra cui la risposta BOLD 28. Isoflurano può causare cambiamenti nel neuronale eccitabilità 29. Altri anestetici possono anche influenzare GABA inibizione sinaptica 30. Così, la scelta di anestesia è importante quando performing ofMRI data la sua capacità di influenzare l&#39;attività neuronale. ofMRI in assenza di anestesia è possibile ma può essere difficile con maggiore movimento dall&#39;animale, che può essere ridotto se l&#39;animale è abituato; sono stati precedentemente eseguiti tali studi svegli ofMRI unND eviterebbe l&#39;effetto confondente di anestesia sul cervello 9,10. Post-elaborazione algoritmi di correzione di movimento possono essere utilizzati per attenuare notevolmente gli effetti del moto. Molti di questi metodi esistono, compreso l&#39;inverso algoritmo di Gauss-Newton impiegato in questo protocollo, che minimizza la somma dei quadrati funzione costo dell&#39;immagine di riferimento e l&#39;immagine sotto la correzione. L&#39;algoritmo è utile perché permette la correzione del movimento veloce e robusto, con una progettazione della piattaforma parallela della GPU per ridurre i tempi di lavorazione 27. Per la ricostruzione dei dati in questo protocollo, software scritto su misura in un ambiente MATLAB è stato utilizzato per la ricostruzione gridding bidimensionale, in cui i campioni a spirale sono ricostruiti in k-spazio in immagini a griglia 31-33. dati di serie temporali sono stati generati calcolando la modulazione percentuale del segnale BOLD di ogni voxel rispetto al periodo di riferimento raccolti prima della stimolazione. Voxel la cui serie temporali sono stati synsincronizzato alle blocchi di stimolazione optogenetic con un valore di coerenza di 0,35 o maggiore sono stati definiti come voxel attivati; questo valore coerenza corrisponde a meno di 10 -9 valore P 8. Valori di coerenza sono stati calcolati come l&#39;ampiezza della trasformata di Fourier alla frequenza dei cicli di stimolazione ripetuti divisi dai quadrati somma di tutti i componenti di frequenza di 8,27. Errore di Familywise può essere controllato tramite la correzione di Bonferroni per confronti multipli. Metodi alternativi di analisi possono essere utilizzati, compresi i test statistici parametrici, come i modelli lineari generali (GLMS). Il metodo coerenza richiede meno prima conoscenza del HRF rispetto al modello lineare generale convenzionale. Pertanto, è vantaggioso quando esplorare dati utilizzando ofMRI. Tuttavia, il metodo di coerenza può essere utilizzato solo per i dati con disegni a blocchi o selezionato i disegni evento-correlati con un fisso interstimulus intervallo e non possono essere utilizzati nei dati ofMRI con altro evento-relaTed progetta o disegni misti. Successivamente, dinamica modelli causali (DCM) può essere utilizzato per analizzare interazioni tra regioni cerebrali identificate attraverso ofMRI. DCM è una tecnica statistica bayesiana sviluppata per l&#39;analisi della connettività funzionale da risposte del sistema agli ingressi sperimentali durante fMRI 34. Ulteriori problemi tecnici per ofMRI sono discussi qui. Gli impianti possono essere danneggiate o cadere, porta alla rimozione dell&#39;animale colpito dallo studio. ambulatori re-impianto non sono raccomandati a causa dell&#39;incertezza addizionale di colpire lo stesso ROI come nella chirurgia di impianto originale e causa di problemi di benessere degli animali. A causa della notevole quantità di tempo e risorse investire in ogni soggetto animale, considerazione della resistenza del materiale è un problema significativo quando si sceglie un cemento dentale adatto per l&#39;uso in studi ofMRI. L&#39;intervento chirurgico di impianto è un fattore critico nel massimizzare la longevità del implant e soggetti animali. Ad esempio, assicurando che il teschio sia asciutta prima di applicare il cemento dentale e ponendo una quantità adeguata di cemento intorno alla protesi puntale ceramico in grado di garantire la stabilità dei potenziali temporale mesi-lungo dell&#39;animale nel corso dello studio. Inoltre, i disegni della gabbia alternative possono essere esplorati e discussi con la funzione di cura degli animali locale per evitare gabbie con cime di filo che tiene il cibo e l&#39;acqua che spesso sporgono nella gabbia e fornire opportunità per l&#39;animale di danneggiare l&#39;impianto. È importante sottolineare che il cemento dentale deve essere scelto con cura per ridurre gli artefatti che influenzano l&#39;imaging e cementi alternative possono essere testati con l&#39;applicazione su un fantasma e di imaging in uno scanner prima dell&#39;uso in esperimenti su animali. Tentativi ed errori con i vari cementi dentali ha dimostrato che il cemento utilizzato in questo protocollo dà relativamente pochi artefatti. Un&#39;altra sfida tecnica nell&#39;esecuzione ofMRI è l&#39;accuratezza di posizionamento fibra ottica al ROI previsto, data la estremely piccole distanze che possono esistere tra i nuclei nel cervello 35. Dopo aver completato gli interventi chirurgici di impianto, le scansioni anatomiche T2 possono essere utilizzati per determinare il corretto posizionamento sovrapponendo su un atlante del cervello. L&#39;abilità del chirurgo e pratica l&#39;esecuzione di questi interventi può migliorare i tassi di collocamento corretti. La specificità e l&#39;espressione del opsina al ROI previsto possono essere verificati a conclusione dello studio di perfusione l&#39;animale e che fissa il cervello, tramite immunoistochimica o la fluorescenza endogena di un reporter di proteine ​​tag al opsin per la visualizzazione. Queste proteine ​​reporter possono anche essere colocalized con altre proteine ​​per garantire che il opsin è espresso in tipi cellulari neuronali desiderati 1,8,15,25. Come accennato in precedenza, i manufatti possono sorgere quando si esegue ofMRI a causa del riscaldamento del tessuto dalla consegna di luce 22. Il riscaldamento dei tessuti provoca la modifica dei tempi di rilassamento, con conseguente falsa segnale BOLD. Per garantire che accoltiva- derivante dalla stimolazione luminosa durante ofMRI non è a causa di questo manufatto, controlli opsin-negativi devono essere eseguite in cui soluzione salina iniettata animali o animali iniettati con vettori di controllo fluoroforo (come AAV-CaMKIIa-EYFP) subiscono ofMRI. Inoltre, la fibra solo ben costruito impianti ottica con una buona efficienza della trasmissione della luce dovrebbe essere utilizzato per eliminare la necessità di utilizzare i poteri alti laser. studi ofMRI sono stati condotti in cui falsa attivazione a causa di riscaldamento dei tessuti, non è stato un problema 1,6-8,10,11. Per quanto riguarda la scelta del vettore per introdurre i geni optogenetic richieste in neuroni per l&#39;espressione, AAV non sono noti per causare malattie negli esseri umani e sono quindi una scelta conveniente, dato il livello di biosicurezza più basso necessario per utilizzare questi agenti (BSL-1). Inoltre, un gran numero di nuclei vettore trasportare AAV confezionati con vari geni optogenetic in magazzino e con più sierotipi. Il sierotipo di AAV deve essere scelto based sul target popolazione di cellule destinate a garantire livelli ottimali di espressione 36,37. Lentivirus possono anche essere usati ma richiedono un livello di biosicurezza superiore. Il periodo di tempo richiesto per sufficientemente espressione dei geni optogenetic è variabile a seconda del modello animale specifico utilizzato, dalla particolare AAV utilizzato e dalla specifica paradigma sperimentale. In questo protocollo, ratti Sprague Dawley a 11 settimane di età sono utilizzati e gli studi optogenetic cominciano da quattro a sei settimane dopo l&#39;iniezione di virus. Topi transgenici possono essere utilizzati anche in studi optogenetic. È necessario eseguire esperimenti pilota per determinare la quantità di tempo richiesto per sufficientemente espressione dei opsins. paradigmi stimolazione può variare a seconda del opsin specifico utilizzato. In questo protocollo, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP viene utilizzato e il paradigma di stimolazione è di 20 sec on / off 40 sec. Se si utilizza un SSFO, il paradigma di stimolazione varia perché l&#39;SSFO richiede solo un breve impulso di luce per essere acsere attivato e poi un breve impulso di luce ad un&#39;altra lunghezza d&#39;onda da terminare. Un ulteriore preoccupazione critica durante l&#39;esecuzione ofMRI impedisce dispersione di luce dall&#39;interfaccia dell&#39;impianto puntale con il cavo patch in fibra ottica durante la stimolazione optogenetic per evitare che un segnale di confusione cerebrale proveniente da stimolazione visiva, anche quando l&#39;animale è anestetizzato. Coni di nastro isolante nero possono essere usati per bloccare la luce dei puntali e per coprire gli occhi dell&#39;animale. Importante, valori fisiologici inclusi espiratorio CO 2 e la temperatura corporea del soggetto deve essere mantenuto correttamente per tutta la durata del imaging. CO espiratorio 2 deve essere compresa tra 3 - 4% e la temperatura corporea a 37 ° C. Inoltre, le sequenze di spessoramento a ridurre il più disomogeneità possibile nel campo magnetico prima di iniziare ofMRI scansiona notevolmente determina la qualità dei dati BOLD risultanti. Il controllo di questi fattoriè fondamentale nella produzione di dati affidabili ofMRI. In questo protocollo, i laser DPSS sono utilizzati come fonte di luce per la stimolazione optogenetic. Poiché la luce laser è coerente potenza più che sufficiente può essere facilmente fornita attraverso la fibra ottica. sorgenti LED accoppiati a fibre ottiche sono disponibili da fornitori commerciali, ma hanno lo svantaggio di una ridotta potenza di trasmissione della luce. La sorgente di luce laser richiede l&#39;allineamento di ogni particolare cavo patch in fibra ottica, ma con la pratica, l&#39;allineamento può essere realizzato in pochi secondi a minuti. Le future applicazioni di ofMRI includono l&#39;uso di opsine di prossima generazione, come opsine rosso-spostato per consentire la stimolazione non invasiva durante l&#39;imaging. Inoltre, l&#39;impianto di MRI compatibile EEG o elettrodi di registrazione simili lungo con l&#39;impianto in fibra ottica potrebbe consentire l&#39;acquisizione di dati ad alta risoluzione temporale oltre ai dati ad alta risoluzione spaziale di MRI. ofMRI con electrophysiolregistrazione ogical potrebbe fornire informazioni dettagliate sulla connettività funzionale del cervello. In sintesi, il potere di ofMRI per monitorare l&#39;intero cervello in risposta alla stimolazione di popolazioni di cellule specifiche definite per identità genetica o anatomica rende ofMRI uno strumento fondamentale utilizzare nello studio delle malattie neurologiche e dei connectomics del cervello sano.

Optogenetic la risonanza magnetica funzionale (ofMRI) è una tecnica innovativa che combina la risoluzione spaziale di alto campo fMRI con la precisione di stimolazione optogenetic 1-11,38, consentendo cella specifica di tipo mappatura dei circuiti neurali funzionali e la loro dinamica su tutto il territorio cervello. Optogenetics permette di tipi cellulari specifici per essere mirati per la stimolazione con l&#39;introduzione di canali conduttanza transmembrana, chiamati opsins fotosensibili. Elementi specifici di circuiti neurali sono modificati geneticamente per esprimere questi canali, consentendo millisecondo-tempistica modulazione di attività nel cervello intatto 1-15. fMRI fornisce un metodo non invasivo per determinare risposta dinamica globale del cervello alla stimolazione optogenetic di circuiti neurali specifici attraverso la misurazione del segnale di ossigeno nel sangue livello-dipendente (BOLD) 16-18, che fornisce una misura indiretta dell&#39;attività neuronale. La combinazione di queste due tecniche, definito optogenetic risonanza magnetica funzionale (ofMRI), è vantaggioso rispetto ad altri metodi di attività cerebrale registrazione durante la stimolazione quali elettrofisiologia perché può fornire una vista dell&#39;intero cervello relativamente elevata risoluzione spaziale. Questo consente il rilevamento dell&#39;attività neuronale in risposta alla stimolazione mirata a grandi distanze dal sito di stimolazione senza la necessità di impianto di elettrodi di registrazione invasive 1-11. ofMRI è vantaggioso rispetto al metodo più tradizionale di eseguire la stimolazione elettrica durante fMRI, che può assumere diversi tipi di cellule vicino all&#39;elettrodo e quindi confondere l&#39;influenza causale di ogni popolazione 19. Inoltre, gli elettrodi utilizzati per la stimolazione elettrica e la corrente generata possono produrre manufatti durante l&#39;imaging MR 20. Infatti, ofMRI consente l&#39;osservazione della influenza sull&#39;attività cerebrale globale dal modulati specificosu un&#39;ampia varietà di tipi cellulari mediante l&#39;uso di tecniche avanzate di targeting genetica come il sistema Cre-Lox in animali transgenici o l&#39;uso di promotori. controllo ottico combinatoria con controllo tutto il cervello è possibile con ofMRI attraverso l&#39;uso di entrambi NpHR per inibire e ChR2 per eccitare tipi cellulari specifici. Il toolkit optogenetic disponibili per l&#39;uso in ofMRI è anche rapidamente migliorando nel tempo con l&#39;introduzione di opsine con una maggiore sensibilità alla luce o cinetiche migliorati, di stabilizzati opsine funzione passo (SSFOs) o di opsine rosso-spostato che può negare l&#39;esigenza di fibra impiantato ottica, consentendo la stimolazione non invasiva durante l&#39;imaging 21. Queste possibilità non sono disponibili con stimolazione elettrica. Tuttavia, artefatti segnale risultante dal riscaldamento del tessuto a causa di consegna luce nel cervello sono stati riportati 22, dove è stato dimostrato modificazioni temperatura indotta tempi di rilassamento per produrre pseufare attivazione. I ricercatori che svolgono ofMRI devono quindi essere consapevoli di questo potenziale confondente. Con la buona impostazione e controlli, il problema può essere affrontato. Inoltre, relativamente bassa risoluzione temporale di misurare la risposta emodinamica in fMRI può essere un fattore limitante per certe applicazioni di questa tecnica. Questo protocollo prima descrive la costruzione degli impianti in fibra ottica che consentono un&#39;erogazione di specifiche lunghezze d&#39;onda della luce in profondità nel cervello in vivo. Il protocollo descrive quindi la consegna del vettore virale opsina-codifica per una regione precisa del cervello utilizzando la chirurgia stereotassica. Avanti il ​​protocollo descrive il processo di tutto il cervello risonanza magnetica funzionale durante la stimolazione luce simultanea. Infine, il protocollo descrive l&#39;analisi dei dati di base dei dati acquisiti. Da segnalare la optogenetics qui descritto richiede un impianto cronico per la consegna della luce. Tuttavia, gli impianti in fibra ottica sono stabili e biocompatibile, consentendo una lettura longitudinale e ricerca di circuiti neurali in un periodo di mesi 23,24. In sintesi, la stimolazione precisa e tutto il cervello capacità di monitoraggio ofMRI sono fattori determinanti nel fare ofMRI un potente strumento per lo studio delle connectomics del cervello. Inoltre, può favorire la comprensione romanzo sui meccanismi di malattie neurologiche 25 agganciati con differenti modelli animali. Infatti, ofMRI è stato utilizzato per chiarire l&#39;attività di rete di sub-regioni dell&#39;ippocampo distinti associati a crisi epilettiche 8. Pertanto, i laboratori interessati a rispondere a domande di neuroscienze sistemi di livello troveranno questa tecnica di importanza.

<table><tbody><tr><td>7 Tesla scanner</td><td>Agilent Technologies</td><td>Discovery MR901 System</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley rats</td><td>Charles River</td><td>Crl:SD</td><td>11 weeks old</td></tr><tr><td>fiber cleaver</td><td>Fujikura</td><td>CT-05</td><td></td></tr><tr><td>multimode optical fiber</td><td>Thor Labs</td><td>AFS105/125Y</td><td></td></tr><tr><td>fiber stripper&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thor Labs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>ceramic split sleeve</td><td>Precision Fiber Products</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr><tr><td>epoxy glue</td><td>Thor Labs</td><td>G14250</td><td></td></tr><tr><td>cotton-tipped applicators</td><td>Stoelting Co.</td><td>50975</td><td></td></tr><tr><td>multimode ceramic zirconia ferrules</td><td>Precision Fiber Products</td><td>MM-FER2002</td><td></td></tr><tr><td>FC/PC multimode connector</td><td>Thor Labs</td><td>30128C3</td><td></td></tr><tr><td>fiber optic polishing disk</td><td>Precision Fiber Products</td><td>M1-80754</td><td></td></tr><tr><td>aluminum oxide lapping sheet, 0.3 &amp;micro;m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG03P</td><td></td></tr><tr><td>aluminum oxide lapping sheet, 1 &amp;micro;m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG1P</td><td></td></tr><tr><td>aluminum oxide lapping sheet, 3 &amp;micro;m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG3P</td><td></td></tr><tr><td>binocular biological microscope 40X-1,000X</td><td>Amscope</td><td>B100</td><td></td></tr><tr><td>laser safety glasses</td><td>Kentek</td><td>KXL-62W01</td><td></td></tr><tr><td>473 nm DPSS laser</td><td>Laserglow</td><td>LRS-0473</td><td></td></tr><tr><td>594 nm DPSS laser</td><td>Laserglow</td><td>LRS-0594</td><td></td></tr><tr><td>Allen hex wrench set</td><td></td><td></td><td>2.0 mm (5/64&quot;) for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser</td></tr><tr><td>power meter, Si Sensor, 400-1,100 nm</td><td>Thor Labs</td><td>PM121D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Isothesia)</td><td>Henry Schein&amp;nbsp;</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane vaporizer with induction chamber</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil 100 &amp;micro;l syringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>function generator</td><td>A.M.P.I.&amp;nbsp;</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>small animal stereotax</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 940&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Model 683 small animal ventilator&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>550000</td><td></td></tr><tr><td>Type 340 capnograph&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>733809</td><td></td></tr><tr><td>dental drill (rotary micromotor kit)</td><td>Foredom Electric Co.</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>ophthalmic ointment (Artificial Tears)</td><td>Rugby</td><td>00536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>instrument sterilizer</td><td>CellPoint Scientific</td><td>Germinator 500</td><td>glass bead sterilizer</td></tr><tr><td>antibiotic powder</td><td>Pfizer</td><td>NEO-PREDEF</td><td>neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride</td></tr><tr><td>buprenorphine painkiller</td><td>Hospira</td><td>NDC:0409-2012</td><td>schedule III controlled substance, 0.3 mg/ml stock</td></tr></tbody></table>

optogenetic functional mri

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain's global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.

<html> Figura 1 e la Figura 2 mostrano i dati rappresentativi derivanti da 20 Hz (15 larghezza di impulso msec, 473 nm, 30% duty cycle) stimolazione optogenetic della corteccia motoria. Un paradigma stimolazione di 30 secondi di base seguita da 20 sec on / off 40 sec per sei minuti è stato utilizzato. Studi precedenti hanno dimostrato che questo paradigma produce robusto segnale BOLD dall&#39;1,8 stimolazione optogenetic. Figura 1 mostra voxel attivati ​​rilevati sia sul sito locale di stimolazione (corteccia motoria) e nel talamo, come risultato delle connessioni sinaptiche a lungo raggio tra queste regioni. la Figura 2 mostra che le informazioni temporali possono essere raccolte da HRFs, come risposta talamica è ritardata (pendenza iniziale inferiore) rispetto alla risposta corteccia motoria dopo stimolazione optogenetic. p_upload / 53346 / 53346fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Attivazione Mappa di BOLD segnale indotto dalla stimolazione optogenetic di CaMKIIa-cellule che esprimono in Motor Cortex. I valori coerenza dei voxel attivi, identificati come quelli significativamente sincronizzato a stimolazioni ripetute, sono mostrati sovrapposto su una fetta anatomica coronale pesata in T2. I dati raccolti nel corso di un numero minimo di sei, 30 d&#39;epoca sec (30 sec iniziale di base e sei cicli di stimolazione 20 sec on / off 40 sec con 473 nm di luce, 20 Hz, 15 di larghezza di impulso msec) sono condensati in una mappa di attivazione. Fette sequenziali sono di 0,5 mm l&#39;uno dall&#39;altro e la posizione della protesi in fibra ottica è segnato con il triangolo. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53346/53346fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53346/53346fig2.jpg" /> <sTrong&gt; Figura 2. Funzione emodinamica di risposta. (a sinistra) La modulazione percentuale del segnale BOLD rispetto al basale è mostrato per voxel attivi nella corteccia motoria e il talamo durante la stimolazione optogenetic della corteccia motoria (sei cicli di stimolazione di 20 secondi su / 40 sec off con 473 nm di luce, 20 Hz, 15 di larghezza di impulso msec). barre di errore grigio sfumato indicano l&#39;errore standard attraverso voxel attivati ​​entro il ROI. (A destra) le risposte medie nel tempo sono date dalle funzioni di risposta emodinamica (HRF). Il talamo HRF mostra una risposta relativa ritardata alla corteccia motoria stimolata. Le barre blu indicano i periodi di 473 nm fotostimolazione. Barre di errore grigio sfumato indicano errore standard in sei cicli. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53346/53346fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Optogenetic Functional MRI

This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

Optogenetic risonanza magnetica funzionale

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Views.  Stanford University. This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

Video: Optogenetic Functional MRI

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and molecular approaches allow the investigation of either different stimuli on few neurons, or one stimulus in large parts of the brain, blood oxygenation level dependent (BOLD) functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) allows combining both advantages, i.e. compare the neural activation induced by different stimuli in the entire brain at once. fMRI in songbirds is challenging because of the small size of their brains and because their bones and especially their skull comprise numerous air cavities, inducing important susceptibility artifacts. Gradient-echo (GE) BOLD fMRI has been successfully applied to songbirds 1-5 (for a review, see 6). These studies focused on the primary and secondary auditory brain areas, which are regions free of susceptibility artifacts. However, because processes of interest may occur beyond these regions, whole brain BOLD fMRI is required using an MRI sequence less susceptible to these artifacts. This can be achieved by using spin-echo (SE) BOLD fMRI 7,8 . In this article, we describe how to use this technique in zebra finches (Taeniopygia guttata), which are small songbirds with a bodyweight of 15-25 g extensively studied in behavioral neurosciences of birdsong. The main topic of fMRI studies on songbirds is song perception and song learning. The auditory nature of the stimuli combined with the weak BOLD sensitivity of SE (compared to GE) based fMRI sequences makes the implementation of this technique very challenging.

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

This article shows an optimized procedure for imaging of the neural substrates of auditory stimulation in the songbird brain using functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI). It describes the preparation of the sound stimuli, the positioning of the subject and the acquisition and subsequent analysis of the fMRI data.

Risonanza magnetica funzionale (fMRI) con Auditory Stimulation in uccelli canori

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Ricerca

Comportamento

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

Ad alta risoluzione magnetica funzionale per immagini Metodi risonanza per mesencefalo umano

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Neuroscienze

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

La stimolazione cerebrale profonda con simultanea fMRI in Roditori

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

In vivo imaging di Optic Nerve Fiber Integrity by MRI Contrast-Enhanced nei topi

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Migliorare la mappatura della corteccia visiva per una migliore valutazione dei disturbi visivi

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) of the Visual Cortex with Wide-View Retinotopic Stimulation

High-resolution retinotopic blood oxygenation level-dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) with a wide-view presentation can be used to functionally map the peripheral and central visual cortex. This method for measuring functional changes of the visual brain allows for functional mapping of the occipital lobe, stimulating &gt;100&#176; (&plusmn;50&#176;) or more of the visual field, compared to standard fMRI visual presentation setups which usually cover &lt;30&#176; of the visual field. A simple wide-view stimulation system for BOLD fMRI can be set up using common MR-compatible projectors by placing a large mirror or screen close to the subject's face and using only the posterior half of a standard head coil to provide a wide-viewing angle without obstructing their vision. The wide-view retinotopic fMRI map can then be imaged using various retinotopic stimulation paradigms, and the data can be analyzed to determine the functional activity of visual cortical regions corresponding to central and peripheral vision. This method provides a practical, easy-to-implement visual presentation system that can be used to evaluate changes in the peripheral and central visual cortex due to eye diseases such as glaucoma and the vision loss that may accompany them.

Autore in primo piano: approfondimenti sulla ricerca sulla corteccia visiva attraverso la mappatura fMRI ad ampia visuale 

We have developed techniques for mapping the visual cortex function utilizing more of the visual field than is commonly used. This approach has the potential to enhance the evaluation of vision disorders and eye diseases.

Risonanza magnetica funzionale (fMRI) della corteccia visiva con stimolazione retinotopica ad ampio raggio

High-resolution retinotopic blood oxygenation level-dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) with a wide-view presentation can be ...

Optogenetic risonanza magnetica funzionale

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Risonanza magnetica funzionale (fMRI) con Auditory Stimulation in uccelli canori

Ad alta risoluzione magnetica funzionale per immagini Metodi risonanza per mesencefalo umano

Neuroimaging funzionale con l'impiego dell'ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

La stimolazione cerebrale profonda con simultanea fMRI in Roditori

In vivo imaging di Optic Nerve Fiber Integrity by MRI Contrast-Enhanced nei topi

Risonanza magnetica funzionale (fMRI) della corteccia visiva con stimolazione retinotopica ad ampio raggio

Risonanza magnetica funzionale (fMRI) della corteccia visiva con stimolazione retinotopica ad ampio raggio

Risonanza magnetica funzionale (fMRI) della corteccia visiva con stimolazione retinotopica ad ampio raggio