Name: optogenetic functional mri
Uploaded: 2016-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
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This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director's New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.

Declaración de Ética: Los procedimientos experimentales que aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford (IACUC). 1. Preparación de cables de conexión y la férula Implantes Nota: A pesar de que los cables de conexión y los implantes de casquillo están disponibles en el mercado, la producción de estos en casa permite diseños especiales y costará menos. <ol><li> Para preparar un cable de conexión de fibra para la entrega de luz desde el láser para el implante en el cerebro, primero escindir la fibra óptica a la longitud deseada. <ol><li> Usando un cuchillo de fibra, terminar la fibra óptica para producir un extremo plano en el punto de terminación. Si la fibra se ha recubierto con una chaqueta, tira de la chaqueta con una herramienta de fibra-stripping de antemano. </li><li> Escindir el otro extremo de la fibra óptica para producir la longitud deseada para el cable, asegurando que el cable es lo suficientemente largo para extenderse desde la fuente de luz para el animal dentro del orificio deel escáner. </li></ol></li><li> Mezcle una pequeña cantidad de pegamento epoxi en una proporción 1: 1 sobre una hoja de papel de aluminio poco antes de la siguiente etapa, como el pegamento de epoxi se vuelve demasiado viscosa para su uso 5 min después de la mezcla. </li><li> El uso de una paleta de madera, aplicar suavemente pegamento epoxi a la parte de la fibra que se coloca dentro del lado cóncavo de la férula de cerámica y luego aplicar una pequeña gota sobre la superficie de la parte plana de la férula. Después de insertar en el casquillo, asegúrese de que una pequeña longitud de fibra (&lt;0,5 mm) sobresale de la parte plana de la férula de cerámica. Deje que el pegamento epoxi se endurezca O / N para obtener resultados óptimos. </li><li> En el lado del cable de conexión de fibra óptica que conectará a la fuente de luz láser, aplicar suavemente pegamento epóxico a la parte de la fibra que se coloca dentro de la parte cóncava de la férula del conector FC / PC y luego aplicar una pequeña caer sobre la superficie del lado plano de la férula. Después de insertarlo en la virola, garantizarque una pequeña longitud de fibra (&lt;0,5 mm) sobresale del lado plano de la férula. Deje que el pegamento epoxi se endurezca O / N para obtener resultados óptimos. </li><li> Pulir el extremo plano de los casquillos de los dos lados del cable por medio de un disco de pulido utilizando pinzas para aplicar una presión suave hacia abajo en la férula al hacer rotaciones en forma de 8 en hojas lapidado óxido de aluminio (de 3 micras a 1 micra y 0,3 micras de grano ). </li><li> Examine el extremo plano de la férula con un microscopio a un aumento de 100X. Asegúrese de que la superficie del extremo plano, incluida la propia superficie de la fibra óptica, está libre de cualquier pegamento epoxi; continuar pulido si pegamento epoxi permanece en la superficie. Asegúrese de que la superficie de la fibra óptica no se ha roto o astillado. PRECAUCIÓN: Asegurar que el personal toman clases de formación de seguridad láser adecuados y usar gafas de seguridad con láser antes de manipular los equipos láser. </li><li> Conectar el cable de conexión de fibra óptica a la fuente de luz láser a través del conector FC / PC y alinear la fIber punta hasta el punto focal del acoplador. Medir la potencia de transmisión de luz de la fibra con un medidor de potencia para asegurar la salida de luz adecuada. Nota: Los siguientes pasos son para la preparación de los casquillos cerámicos con fibra óptica para la implantación crónica en el cerebro; los casquillos cerámicos son huecos en el centro y llevar la fibra óptica que suministra la luz de un cable de conexión a una región de interés (ROI) dentro del cerebro. </li><li> Usando un cuchillo de fibra, terminar la fibra óptica para producir un extremo plano en el punto de terminación. Si la fibra se ha recubierto con una chaqueta, tira de la chaqueta con una herramienta de fibra-stripping de antemano. </li><li> Escindir el otro extremo de la fibra óptica para producir la longitud deseada para su implantación en el cerebro. Determinar la longitud de la fibra utilizando un atlas estereotáxico para orientar la ROI dentro del cerebro. <ol><li> Por ejemplo: para apuntar hipocampo dorsal en rata que es de 3,5 mm por debajo de bregma, asegurarse de que la longitud de la fibra que sobresale de la ferrule es de 3,5 mm + 0,25 mm, que representan el espesor del cráneo y permitiendo margen de error. Por lo tanto, comprobar que la longitud final de la fibra es de 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (longitud de la virola) = 14.25 mm. </li></ol></li><li> Mezclar una pequeña cantidad de pegamento epoxi en una proporción 1: 1 sobre una hoja de papel de aluminio poco antes de la siguiente etapa (la cola epoxi se vuelve demasiado viscosa para su uso 5 min después de la mezcla). </li><li> El uso de una paleta de madera, aplicar suavemente pegamento epoxi a la parte de la fibra que se coloca dentro del lado cóncavo de la férula de cerámica y luego aplicar una pequeña gota sobre la superficie de la parte plana de la férula. Después de insertar en el casquillo, asegúrese de que una pequeña longitud de fibra (&lt;0,5 mm) sobresale de la parte plana de la férula de cerámica. Deje que el pegamento epoxi se endurezca O / N para obtener resultados óptimos. </li><li> Pulir el extremo plano de la férula utilizando un disco de pulido mediante el uso de unas pinzas para aplicar una presión suave hacia abajo en el casquillo mientras que hace la figura 8-rotacións en las hojas de lapidado óxido de aluminio (de 3 micras a 1 micra y 0,3 micras de grano). </li><li> Examine el extremo plano de la férula con un microscopio a un aumento de 100X. Asegúrese de que la superficie del extremo plano, incluida la propia superficie de la fibra óptica, está libre de cualquier pegamento epoxi; continuar pulido si pegamento epoxi permanece en la superficie. Asegúrese de que la superficie de la fibra óptica no se ha roto o astillado. </li><li> Acoplar el casquillo pulido a un cable de conexión de fibra óptica con una manga casquillo y conectar el cable de conexión a una fuente de luz láser. Medir la potencia de transmisión de la luz en la punta de la fibra con un medidor de potencia para asegurar el adecuado. </li><li> Mantener un registro de la salida de potencia requerida de la virola del cable de conexión para cada implante férula para dar salida al nivel de potencia deseado en la punta de la fibra óptica (2,5 mW en este protocolo). Desechar casquillos con una tasa de atenuación de más de 50% y con el patrón de salida no circular. </li></ol> 2. estereotáxica ImpCirugía lantation y de inyección Virus <ol><li> Asegúrese de que todos los procedimientos experimentales sobre la utilización de animales son aprobados por el IACUC local. Mantener las condiciones asépticas durante cirugías de supervivencia siguiendo procedimientos asépticos, incluyendo el uso de guantes estériles, máscaras estériles, paños quirúrgicos estériles e instrumentos quirúrgicos esterilizados. PRECAUCIÓN: Asegúrese de que los cirujanos están usando equipo adecuado de protección personal (EPP) incluyendo gafas de seguridad antes de comenzar el procedimiento. Siga los procedimientos de bioseguridad estándar cuando se trabaja con vectores adeno-asociado (AAV), teniendo cuidado de evitar salpicaduras. Eliminar los residuos de AAV en un contenedor de residuos sanitarios. </li><li> Cargar una jeringa de microlitro suficiente AAV para la inyección en el animal y un poco más para tener en cuenta las pérdidas de volumen potencial (total de 4 l por animal), manteniendo la jeringa en hielo antes de su uso. En este protocolo, se utiliza AAV5-CamKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP a un título de 4x10 12 vg / ml. Colocar el animal bajo isofluranoe anestesia con una cámara de inducción, conectado a un conjunto vaporizador de isoflurano precisión con un 3 - 4% con una fuente de gas oxígeno. </li><li> Afeitarse la cabeza con una maquinilla de afeitar eléctrica y realizar un lavado quirúrgico triple en la piel con betadine y un enjuague de etanol al 70%. </li><li> Una vez que el animal se encuentra en la anestesia profunda (marque reflejo dedo del pie y ritmo respiratorio), inmovilizar el cráneo del animal en un aparato estereotáxico con tacos de posicionamiento intra-aurales y portadientes. Nota: Todo el procedimiento se llevará a 1 - 2 horas, desde la inducción de anestesia para la recuperación. </li><li> Establecer la anestesia a un nivel apropiado (1 - 3% de isoflurano en el vaporizador) y monitorear continuamente los signos vitales de los animales, el ajuste de la anestesia según sea necesario para mantener una tasa de respiración de ~ 40 respiraciones / min. Administrar pomada oftálmica en los ojos de los animales para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. </li><li> Hacer un 15 - incisión en la línea media del cuero cabelludo 20 mm con un bisturí y retraer el cuero cabelludo usando pinzas hemostáticas quirúrgicas unattached al periostio. lambda referencia y bregma para posicionar la broca sobre las coordenadas para el retorno de la inversión. </li><li> Perforar un pequeño craneotomía (2-3 mm) sobre el retorno de la inversión con un taladro dental, teniendo cuidado de no perforar el cerebro. Introduzca lentamente aguja unida a la jeringa de microlitro a través de la craneotomía con el retorno de la inversión en el cerebro. </li><li> Con un controlador de bombas microjeringa, inyectar 2 l de la solución vector en la ROI. Utilice una velocidad de flujo de 150 nl / min para evitar daños en los tejidos. Después de la inyección se ha completado, espere 10 min antes de retirar la jeringa lentamente, a una velocidad de 0,5 mm / min. </li><li> Después de la inyección, se seca la superficie del cráneo. lambda referencia y bregma confirmar las coordenadas y luego insertar el implante férula a la profundidad de destino (por ejemplo: de 3,5 mm por debajo de bregma hipocampo dorsal) a una velocidad de aproximadamente 0,5 mm / min. Montar el implante férula en el cráneo con cemento dental. Después de que el cemento dental se ha solidificado, sellar la incisión con suturas (SIze 5-0 para ratas) alrededor del tapón de cemento dental. </li><li> Después de la cirugía, colocar el animal en su jaula individualmente alojados con un medio de la jaula en la parte superior de un calentador para la recuperación de la anestesia. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No coloque el animal en compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. </li><li> Para la gestión post-quirúrgico del dolor, administrar buprenorfina por vía subcutánea cada 12 horas a una dosis de 0,05 mg / kg durante 24 horas. Administrar polvo antibiótico diario sobre el sitio de la incisión durante 3 días. </li><li> Retire las suturas aproximadamente dos semanas después de la cirugía para prevenir la formación de costras. </li><li> Espere 4 - 6 semanas después de la inyección de virus para la expresión suficiente de genes optogenética antes de realizar los experimentos. </li></ol> 3. resonancia magnética funcional Optogenética PRECAUCIÓN: Tenga precaución alrededor del campo magnético permanente de un escáner de resonancia magnética. equipm seguroent, incluyendo el generador de funciones, fuente de luz, ventilador, tanques capnógrafo y gas, lo suficientemente lejos (al menos más allá del límite de 5 Gauss). <ol><li> Colocar el animal bajo anestesia de gas con una cámara de inducción, conectado a un conjunto vaporizador de isoflurano precisión a 5% con una fuente de gas oxígeno. </li><li> Una vez que el animal se encuentra en anestesia profunda (reflejo del dedo del pie de verificación y frecuencia respiratoria), intubar al animal de acuerdo con el protocolo detallado en Rivard et al. (2006) para permitir la monitorización de dióxido de carbono por la capnografía 26. Nota: la intubación es crítico para mantener los niveles adecuados de CO 2 espiratorio durante la exploración. </li><li> Asegurar el animal en la base del escáner. Nota: En este protocolo, la cuna se produce a medida pero tales cunas están también disponibles comercialmente. Las funciones de la cuna de la rata para asegurar el animal dentro del escáner para la entrega de la anestesia, el aire caliente y para la restricción de movimiento. </li><li> Entregar una mezcla de isoflurano (ranging 1,2-1,5%) en óxido nitroso aproximadamente 60% y 40% de oxígeno a través de la tubería a través de la cuna. Asegúrese de que la cabeza del animal se fija con seguridad a fin de evitar los artefactos de movimiento. </li><li> Proporcionar aire caliente a través de la tubería en la cuna e insertar un termómetro rectal con lubricante para controlar la temperatura del cuerpo. Administrar pomada oftálmica en los ojos de los animales para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. </li><li> Conectar el cable de conexión de fibra óptica a una fuente de luz láser y medir la salida en la punta del casquillo del cable de conexión con un medidor de potencia. </li><li> Ajuste al nivel de potencia apropiado (previamente determinada en el paso 1,15) para producir la salida deseada (2,5 mW en este protocolo) en la punta de la fibra óptica implantado dentro del cerebro. Desde potencia de salida excesiva de la fibra óptica puede potencialmente causar daño a los tejidos dentro del cerebro o provocar el calentamiento del tejido que va a producir artefactos de señal, no aumente significativamente la potencia de salida del lásermás allá de la salida prevista. </li><li> Prevenir las fugas de luz desde el implante con un cono de cinta aislante negro y cubrir los ojos del animal. Acoplar el cable de fibra óptica al implante virola sobre el animal con un manguito de casquillo. </li><li> Coloque la bobina sobre la cabeza del animal. Insertar la cuna con el animal en el orificio del escáner. Nota: En este protocolo, el de un solo lazo transmisión-recepción de la bobina se produce a medida y pre-sintonizado para recibir la frecuencia de radio óptima del tejido cerebral. </li><li> Controlar la frecuencia y la temperatura corporal para respirar durante todo este proceso, el ajuste del respirador artificial y calefacción según sea necesario para mantener los valores fisiológicos dentro de los límites (asegurarse de que la espiración de CO 2 es 3 - 4% girando las perillas en el ventilador para ajustar la longitud de carrera y el volumen y que la temperatura es de 37 ° C haciendo clic en las flechas para el ajuste de la temperatura). </li><li> Seleccionar una secuencia de posicionamiento de la imagen de la ubicación de cabeza de animal. Si la blluvia no está en el centro de iso-para ajustar la posición de cabeza de los animales y repetir la búsqueda del posicionamiento hasta que el cerebro está en el iso-central. Seleccione una secuencia lineal y cuñas de carga, haga clic en la ventana de selección de secuencia. A continuación, haga clic en inicio para reducir la falta de homogeneidad del campo magnético. Nota: Nivelación es un paso crítico que influirá directamente en la integridad de los datos de la fMRI. </li><li> Seleccione una secuencia ponderada en T2 y haga clic en la carga en la ventana de selección de secuencia. A continuación, haga clic en inicio para adquirir imágenes de alta resolución anatómicas coronales ponderadas en T2 antes de la fMRI para comprobar la integridad global del cerebro y para confirmar la ubicación del implante de fibra óptica. Nota: Estas imágenes se pueden utilizar como superposiciones de anatomía para la serie de exploración ofMRI. </li><li> Conectar los cables BNC de la activación de puertos del escáner de resonancia magnética para el generador de funciones de modo que la fuente de luz láser es accionado de acuerdo con un paradigma de estimulación experimental. Nota: En este protocolo, la estimulación pAradigm es de 30 seg de la línea de base, seguido de 20 segundos de encendido / apagado 40 segundos durante seis minutos. </li><li> Seleccionar un multicorte gradiente recordó secuencia de eco (GRE) y haga clic en la carga en la ventana de selección de secuencia. A continuación, haga clic en inicio para adquirir 35 mm x 35 mm (2D FOV) en el plano coronal rebanadas con 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm de resolución espacial. Nota: La secuencia GRE usada aquí tiene un tiempo de repetición (TR) y el tiempo de eco (TE) de TR / TE = 750/12 ms y un ángulo de 30 ° flip. </li><li> A la conclusión de la exploración, retire el animal desde el escáner y monitor hasta que se ha despertado de la anestesia y puede mantener decúbito esternal. </li></ol> 4. Análisis de los datos ofMRI Nota: Los siguientes pasos se realizan en MATLAB como se describe en una publicación de alto rendimiento ofMRI 27. <ol><li> Después de la exploración de datos en bruto se ha transferido a la computadora utilizada para el análisis, la reconstrucción de utilización del deslizamiento ventana para actualizar la imagen de todos los TR, conuna lectura espiral de cuatro intercalación, 750 TR ms y 12 ms tiempo de eco para adquirir 23 rebanadas por la serie de análisis. En lugar de la reconstrucción convencional donde las nuevas imágenes de resonancia magnética funcional se reconstruyen sólo después de que todas las hojas intercaladas se adquieren para cada sector, el método de reconstrucción de ventana deslizante reconstruye las imágenes después de la adquisición de cada 27 intercalada. </li><li> Procesar los datos en bruto para la reconstrucción de dos dimensiones grillado, corrección de movimiento, y el cálculo de series de tiempo como se ha descrito previamente 27. </li><li> Use un método para determinar la coherencia umbral voxels activados mediante el cálculo del porcentaje de modulación de la señal BOLD de cada voxel en relación con el período de referencia recogidos antes de la estimulación como se ha descrito previamente 27. Calcular los valores de coherencia como la magnitud de la transformada de Fourier en la frecuencia de los ciclos de estimulación repetida, dividido por los cuadrados de suma de todos los componentes de frecuencia de 8. </li><li> Utilizando los datos de series de tiempo para cada vOxel, las imágenes de movimiento promedio corregido que pertenecen a las exploraciones consecutivas del mismo paradigma de estimulación primeros. Entonces alinear las imágenes 4D promedio a un sistema de coordenadas común con una transformación cuerpo rígido de seis grados de libertad, más de escala isotrópica para la comparación dentro y entre los animales como se describió anteriormente 27. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

El movimiento del sujeto cuando se toman imágenes es una fuente significativa de artefacto que puede conducir a la corrupción de datos. Apropiadamente asegurar el animal en la base de formación de imágenes puede minimizar tales artefactos como se mantenimiento de los niveles de anestesia apropiadas. En este caso, hemos utilizado isoflurano, pero anestésicos alternativos, tales como la medetomidina o ketamina y xilacina, también deben ser considerados. Sin embargo, los niveles y la elección del anestésico pueden influir en muchos parámetros en el cerebro, incluyendo la respuesta BOLD 28. El isoflurano puede causar cambios en la excitabilidad neuronal 29. Otros anestésicos también pueden afectar a la inhibición sináptica de GABA 30. Por lo tanto, la elección de la anestesia es importante cuando se realizan ofMRI dada su capacidad de afectar a la actividad neuronal. ofMRI en ausencia de anestesia es posible, pero puede ser difícil con el aumento de movimiento del animal, que puede ser reducido si el animal está habituado; anteriormente se han realizado estos estudios despierto ofMRI unand evitaría el efecto de confusión de la anestesia en el cerebro 9,10. Post-procesamiento de los algoritmos de corrección de movimiento se pueden utilizar para mitigar en gran medida los efectos del movimiento. Varios de estos métodos existen, incluyendo la inversa algoritmo de Gauss-Newton empleado en este protocolo, lo que minimiza la suma de los cuadrados función de coste de la imagen de referencia y la imagen en virtud de corrección. El algoritmo es útil, ya que permite la corrección de movimiento rápido y robusto, con un diseño de plataforma paralela de la GPU para reducir los tiempos de procesamiento 27. Para la reconstrucción de datos en este protocolo, software escrito en un entorno de MATLAB se utiliza para la reconstrucción de cuadriculado de dos dimensiones, donde las muestras de espiral se reconstruyen en el espacio k en imágenes reticulares 31-33. series temporales de datos se generaron mediante el cálculo del porcentaje de modulación de la señal BOLD de cada voxel en relación con el período de referencia recogidos antes de la estimulación. Voxels cuyas series de tiempo se synchronized a bloques de estimulación optogenética con un valor coherencia de 0,35 o superior se definieron como los voxels activados; este valor corresponde a una coherencia de menos de 10 -9 valor de p 8. Valores de coherencia se calcularon como la magnitud de la transformada de Fourier en la frecuencia de los ciclos de estimulación repetida, dividido por los cuadrados de suma de todos los componentes de frecuencia de 8,27. familywise de error puede ser controlado utilizando la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples. Los métodos alternativos de análisis pueden ser usados, incluyendo pruebas estadísticas paramétricas como los modelos lineales generales (GLM). El método de la coherencia requiere menos conocimiento previo de la HRF en comparación con el modelo lineal general convencional. Por lo tanto, es ventajoso cuando la exploración de datos utilizando ofMRI. Sin embargo, el método de la coherencia sólo se puede utilizar para los datos con los diseños de bloques o seleccionado diseños relacionados con eventos con un intervalo inter fijo y no se puede usar en los datos ofMRI con otro evento-relaTed diseños o diseños mixtos. Posteriormente, el modelado causal dinámica (DCM) se puede utilizar para analizar las interacciones entre las regiones del cerebro identificados a través de ofMRI. DCM es una técnica estadística bayesiana desarrollado para el análisis de la conectividad funcional a partir de las respuestas del sistema a las entradas experimentales durante fMRI 34. Aquí se discuten las preocupaciones técnicas adicionales para ofMRI. Los implantes pueden ser dañados o se caigan, lo que lleva a la eliminación del animal afectado del estudio. cirugías reimplantación no se recomiendan debido a la incertidumbre adicional de dirigir el mismo retorno de la inversión como en la cirugía de implantación original y debido a cuestiones de bienestar animal. Debido a la cantidad significativa de tiempo y recursos invertidos en cada sujeto animal, la consideración de la resistencia del material es una preocupación significativa cuando la elección de un cemento dental adecuado para su uso en estudios ofMRI. La cirugía de implantación es un factor crítico para maximizar la longevidad de la IMPlant y sujeto animal. Por ejemplo, asegurándose de que el cráneo esté seca antes de aplicar el cemento dental y la colocación de una cantidad adecuada de cemento alrededor del implante férula de cerámica puede garantizar la estabilidad de potencial de línea de tiempo de meses de duración del animal durante el estudio. Además, los diseños alternativos de la jaula pueden ser explorados y discutidos con la instalación de cuidado de animales local para evitar jaulas de alambre con las tapas que llevan a cabo la comida y el agua que a menudo sobresalen en la jaula y proporcionar oportunidades para que el animal dañar el implante. Es importante destacar que, el cemento dental deben ser elegidos cuidadosamente para reducir los artefactos que afectan de imágenes y cementos alternativos pueden ser probados por la aplicación sobre un fantasma y de formación de imágenes en un escáner antes de su uso en experimentos con animales. Ensayo y error con diferentes cementos dentales se ha demostrado que el cemento utilizado en este protocolo da relativamente pocos artefactos. Otro desafío técnico en la realización de ofMRI es la precisión de la colocación de la fibra óptica en el retorno de la inversión prevista, dado el extremely pequeñas distancias que pueden existir entre los núcleos en el cerebro 35. Después de completar las cirugías de implantación, las exploraciones anatómicas ponderadas en T2 se pueden utilizar para determinar la colocación correcta mediante la superposición sobre un atlas cerebral. La habilidad del cirujano y la práctica de realizar estas cirugías puede mejorar las tasas de colocación correctas. La especificidad y la expresión de la opsina en el retorno de la inversión prevista se pueden verificar en la conclusión del estudio de perfusión del animal y se fija el cerebro, mediante inmunohistoquímica o la fluorescencia endógena de una proteína indicadora etiquetados a la opsina para la visualización. Estas proteínas indicadoras también pueden ser colocalized con otras proteínas para asegurar que la opsina se expresa en los tipos de células neuronales deseadas 1,8,15,25. Como se mencionó anteriormente, los artefactos pueden surgir cuando se realiza ofMRI debido al calentamiento de los tejidos de suministro de luz 22. El calentamiento de los tejidos causa la modificación de los tiempos de relajación, lo que resulta en la señal BOLD falsa. Para asegurarse de que activación resultante de la estimulación de luz durante ofMRI no se debe a este artefacto, controles opsina-negativos se deben realizar en los que o bien solución salina inyectada animales o animales inyectados con vectores de control de fluoróforos (tales como AAV-CamKIIa-EYFP) experimentan ofMRI. Además, los implantes de fibra óptica solamente bien construido con una buena eficiencia de transmisión de la luz se deben utilizar para eliminar la necesidad de utilizar potencias de láser de alta. ofMRI estudios se han realizado en los que la activación falsa debido al calentamiento de los tejidos no ha sido un problema 1,6-8,10,11. En cuanto a la elección del vector para introducir los genes en las neuronas optogenética requeridas para la expresión, AAV no se sabe que causan enfermedades en los seres humanos y por lo tanto son una opción conveniente, teniendo en cuenta el nivel de bioseguridad más baja necesaria para utilizar estos agentes (BSL-1). Además, una multitud de núcleos de vectores AAV llevar envasados ​​con diferentes genes optogenética en stock y con múltiples serotipos. El serotipo de AAV debe ser elegido bobre la base de la población de células diana destinadas a garantizar los niveles de expresión óptimos 36,37. Los lentivirus también se pueden utilizar pero requieren un nivel de bioseguridad superior. El período de tiempo requerido para la expresión suficiente de los genes optogenética es variable dependiendo del modelo animal específico utilizado, en el AAV particular usado y en el paradigma experimental específico. En este protocolo, ratas Sprague Dawley de 11 semanas de edad se utilizan y los estudios comienzan optogenética cuatro a seis semanas después de la inyección de virus. Los ratones transgénicos se pueden utilizar también en estudios optogenética. Es necesario llevar a cabo experimentos piloto para determinar la cantidad específica de tiempo requerido para la expresión suficiente de las opsinas. paradigmas de estimulación pueden variar dependiendo de la opsina específico usado. En este protocolo, AAV5-CamKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP se utiliza y el paradigma de estimulación es de 20 segundos de encendido / apagado 40 seg. Si se utiliza un SSFO, el paradigma de estimulación variará debido a que el SSFO requiere sólo un breve pulso de luz para ser activated y luego de un breve pulso de luz en otra longitud de onda para ser terminado. Una preocupación fundamental adicional al realizar ofMRI es la prevención de fugas de luz desde la interfaz implante casquillo con el cable de conexión de fibra óptica durante la estimulación optogenética para evitar una señal de confusión cerebral procedente de la estimulación visual, incluso cuando se anestesia el animal. Conos de cinta aislante negro se pueden utilizar para bloquear la luz de los casquillos y para cubrir los ojos del animal. Es importante destacar que los valores fisiológicos incluyendo espiratorio CO 2 y la temperatura corporal del sujeto deben mantenerse adecuadamente a lo largo de la duración de la formación de imágenes. CO espiratorio 2 debe mantenerse entre 3-4% y la temperatura corporal a 37 ° C. Además, las secuencias de compensación magnética para reducir lo más posible falta de homogeneidad como en el campo magnético antes de iniciar ofMRI escanea en gran medida determina la calidad de los datos BOLD resultantes. El control de estos factoreses crítico en la producción de datos fiables ofMRI. En este protocolo, el láser DPSS se utilizan como fuente de luz para la estimulación optogenética. Debido a que la luz láser es coherente, la potencia que se puede suministrar fácilmente a través de la fibra óptica. fuentes de luz LED junto a la fibra óptica están disponibles de proveedores comerciales, pero tienen la desventaja de potencia reducida de transmisión de la luz. La fuente de luz láser requiere la alineación de cada cable de conexión de fibra óptica particular, pero con la práctica, la alineación se puede lograr en cuestión de segundos a minutos. Las futuras aplicaciones de ofMRI incluyen el uso de opsinas de próxima generación, como opsinas desplazadas al rojo para permitir la estimulación no invasiva durante la exploración. Además, la implantación de MRI compatible-EEG o electrodos de registro similares a lo largo con el implante de fibra óptica podría permitir la adquisición de datos de alta resolución temporal, además de los datos de alta resolución espacial de MRI. ofMRI con Electrophysiologyogical grabación podría proporcionar amplia información sobre la conectividad funcional del cerebro. En resumen, el poder de ofMRI para controlar todo el cerebro en respuesta a la estimulación de las poblaciones de células específicas definidas por identidad genética o anatómica hace ofMRI una herramienta crítica para utilizar en el estudio de enfermedades neurológicas y de las conectómica del cerebro sano.

Optogenética imágenes de resonancia magnética (ofMRI) es una nueva técnica que combina la resolución espacial de alto campo fMRI con la precisión de la estimulación optogenética 1-11,38, lo que permite la cartografía específica del tipo celular de los circuitos neuronales funcionales y su dinámica en el conjunto cerebro. Optogenética permite para determinados tipos de células a ser objeto de estimulación mediante la introducción de canales de conductancia transmembrana, llamados opsinas sensibles a la luz. Los elementos específicos de los circuitos neuronales se modifican genéticamente para expresar estos canales, lo que permite la modulación de milisegundos-escala de tiempo de actividad en el cerebro intacto 1-15. fMRI proporciona un método no invasivo de determinar la respuesta dinámica global de cerebro a la estimulación optogenética de circuitos neuronales específicos a través de la medición de la señal de sangre-oxígeno-dependiente del nivel de (BOLD) 16 a 18, que proporciona una medida indirecta de la actividad neuronal. La combinación de estas dos técnicas, denominado optogenético imágenes de resonancia magnética (ofMRI), es ventajoso sobre otros métodos de grabación de la actividad del cerebro durante la estimulación como electrofisiología ya que puede proporcionar una vista de todo el cerebro a relativamente alta resolución espacial. Esto permite la detección de la actividad neuronal en respuesta a la estimulación dirigida a grandes distancias desde el sitio de estimulación sin la necesidad de implantación de electrodos de registro invasivos 1-11. ofMRI es ventajoso con respecto al método más tradicional de realizar la estimulación eléctrica durante fMRI, que puede reclutar diferentes tipos de células cerca del electrodo y por lo tanto confundir la influencia causal de cada población 19. Además, los electrodos utilizados para la estimulación eléctrica y la corriente generada puede producir artefactos durante la RM 20. De hecho, ofMRI permite la observación de la influencia en la actividad cerebral global desde el modulati específicaen de una amplia variedad de tipos de células a través del uso de técnicas avanzadas de modificación genética dirigida, como el sistema Cre-Lox en animales transgénicos o el uso de promotores. control óptico combinatoria con monitorización de todo el cerebro es posible con ofMRI mediante el uso de ambos NpHR para inhibir y ChR2 para excitar tipos de células específicos. El kit de herramientas optogenético disponibles para su uso en ofMRI también está mejorando rápidamente en el tiempo con la introducción de opsinas con una mayor sensibilidad a la luz o la mejora de la cinética, de opsinas función de paso estabilizados (SSFOs) o de opsinas desplazadas al rojo que puede negar la necesidad de fibra implantada la óptica, lo que permite la estimulación no invasiva durante la exploración 21. Estas posibilidades no están disponibles con la estimulación eléctrica. Sin embargo, los artefactos de señal resultantes de calentamiento del tejido, debido a la entrega de luz en el cerebro se han notificado 22, donde la modificación inducida por la temperatura de los tiempos de relajación se ha demostrado que producen pseuhacer activación. Por lo tanto, los investigadores que realizan ofMRI deben ser conscientes de este potencial factor de confusión. Con la configuración y el control adecuados, el problema puede ser abordado. Además, relativamente baja resolución temporal de la medición de la respuesta hemodinámica en fMRI puede ser un factor limitante para ciertas aplicaciones de esta técnica. Este protocolo describe primero la construcción de los implantes de fibra óptica que permiten la entrega de longitudes de onda específicas de la luz profundamente en el cerebro in vivo. El protocolo a continuación, describe la entrega del vector viral opsina que codifica para una región del cerebro precisa el uso de la cirugía estereotáctica. A continuación, el protocolo describe el proceso de resonancia magnética funcional de todo el cerebro durante la estimulación simultánea de luz. Finalmente, el protocolo describe el análisis de datos de base de los datos adquiridos. Es de destacar que la optogenética descrito aquí requiere un implante crónico para suministro de luz. Sin embargo, los implantes de fibra óptica son estables y biocompatible, lo que permite la exploración longitudinal y la investigación de los circuitos neuronales durante un período de meses 23,24. En resumen, la estimulación más precisa y la capacidad de vigilancia de todo el cerebro de ofMRI son factores cruciales en la toma de ofMRI una poderosa herramienta para el estudio de los conectómica del cerebro. Además, se puede proporcionar nuevos conocimientos sobre los mecanismos de las enfermedades neurológicas 25 cuando junto con diferentes modelos animales. De hecho, ofMRI se ha utilizado para elucidar la actividad de red de subregiones del hipocampo distintos asociados con convulsiones 8. Por lo tanto, los laboratorios interesados ​​en responder a las preguntas de la neurociencia sistemas de nivel encontrarán esta técnica de importancia.

<table><tbody><tr><td>7 Tesla scanner</td><td>Agilent Technologies</td><td>Discovery MR901 System</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley rats</td><td>Charles River</td><td>Crl:SD</td><td>11 weeks old</td></tr><tr><td>fiber cleaver</td><td>Fujikura</td><td>CT-05</td><td></td></tr><tr><td>multimode optical fiber</td><td>Thor Labs</td><td>AFS105/125Y</td><td></td></tr><tr><td>fiber stripper&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thor Labs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>ceramic split sleeve</td><td>Precision Fiber Products</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr><tr><td>epoxy glue</td><td>Thor Labs</td><td>G14250</td><td></td></tr><tr><td>cotton-tipped applicators</td><td>Stoelting Co.</td><td>50975</td><td></td></tr><tr><td>multimode ceramic zirconia ferrules</td><td>Precision Fiber Products</td><td>MM-FER2002</td><td></td></tr><tr><td>FC/PC multimode connector</td><td>Thor Labs</td><td>30128C3</td><td></td></tr><tr><td>fiber optic polishing disk</td><td>Precision Fiber Products</td><td>M1-80754</td><td></td></tr><tr><td>aluminum oxide lapping sheet, 0.3 &amp;micro;m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG03P</td><td></td></tr><tr><td>aluminum oxide lapping sheet, 1 &amp;micro;m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG1P</td><td></td></tr><tr><td>aluminum oxide lapping sheet, 3 &amp;micro;m</td><td>Thor Labs</td><td>LFG3P</td><td></td></tr><tr><td>binocular biological microscope 40X-1,000X</td><td>Amscope</td><td>B100</td><td></td></tr><tr><td>laser safety glasses</td><td>Kentek</td><td>KXL-62W01</td><td></td></tr><tr><td>473 nm DPSS laser</td><td>Laserglow</td><td>LRS-0473</td><td></td></tr><tr><td>594 nm DPSS laser</td><td>Laserglow</td><td>LRS-0594</td><td></td></tr><tr><td>Allen hex wrench set</td><td></td><td></td><td>2.0 mm (5/64&quot;) for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser</td></tr><tr><td>power meter, Si Sensor, 400-1,100 nm</td><td>Thor Labs</td><td>PM121D</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Isothesia)</td><td>Henry Schein&amp;nbsp;</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>isoflurane vaporizer with induction chamber</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil 100 &amp;micro;l syringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>function generator</td><td>A.M.P.I.&amp;nbsp;</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>small animal stereotax</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 940&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Model 683 small animal ventilator&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>550000</td><td></td></tr><tr><td>Type 340 capnograph&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>733809</td><td></td></tr><tr><td>dental drill (rotary micromotor kit)</td><td>Foredom Electric Co.</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>ophthalmic ointment (Artificial Tears)</td><td>Rugby</td><td>00536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>instrument sterilizer</td><td>CellPoint Scientific</td><td>Germinator 500</td><td>glass bead sterilizer</td></tr><tr><td>antibiotic powder</td><td>Pfizer</td><td>NEO-PREDEF</td><td>neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride</td></tr><tr><td>buprenorphine painkiller</td><td>Hospira</td><td>NDC:0409-2012</td><td>schedule III controlled substance, 0.3 mg/ml stock</td></tr></tbody></table>

optogenetic functional mri

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain's global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.

<html> La Figura 1 y la Figura 2 muestran datos representativos que resultan de 20 Hz (15 mseg de ancho de pulso, 473 nm, ciclo de trabajo 30%) estimulación optogenética de la corteza motora. Un paradigma de estimulación de 30 segundos de la línea de base seguido de 20 segundos de encendido / apagado para 40 seg se utilizó seis minutos. Estudios anteriores han demostrado que este paradigma produce señal BOLD robusto de 1,8 estimulación optogenética. La Figura 1 muestra voxels activados detectados tanto en el sitio local de la estimulación (corteza motora) y en el tálamo, como resultado de las conexiones sinápticas de largo alcance entre estas regiones. la Figura 2 muestra que la información temporal se puede extraer de HRF, como la respuesta del tálamo se retrasa (menor pendiente inicial) en comparación con la respuesta de la corteza motora después de la estimulación optogenética. p_upload / 53346 / 53346fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Mapa de activación BOLD señal inducida por la estimulación de las células Optogenética CamKIIa expresan en la corteza del motor. Valores de coherencia de los voxels activos, identificadas como aquellas sincronizadas de manera significativa a las estimulaciones repetidas, se muestra superpuesta sobre una rebanada coronal anatómica en T2. Los datos recogidos durante un período de seis min, 30 seg período (de referencia inicial de 30 segundos y seis ciclos de estimulación de 20 segundos de encendido / apagado 40 segundos con 473 nm de luz, 20 Hz, 15 ms de ancho de pulso) se condensan en un solo mapa de activación. Rodajas secuenciales son de 0,5 mm de distancia y la ubicación del implante de fibra óptica se denota por el triángulo. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53346/53346fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53346/53346fig2.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Función hemodinámica Response. (Izquierda) El porcentaje de modulación de la señal BOLD respecto al valor basal se muestra para voxels activos en la corteza motora y el tálamo durante la estimulación de la corteza optogenético motor (seis ciclos de estimulación de 20 segundos de encendido / apagado 40 sec con 473 nm de luz, 20 Hz, 15 ms de ancho de pulso). barras de error grises sombreadas indican el error estándar en todos los voxels activados dentro de ROI. (Derecha) respuestas promediada en el tiempo están dadas por las funciones de respuesta hemodinámica (HRF). El tálamo HRF muestra una respuesta retardada con respecto a la corteza motora estimulado. Las barras azules indican los períodos de 473 nm fotoestimulación. Barras de error grises sombreadas indican el error estándar a través de seis ciclos. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53346/53346fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Optogenetic Functional MRI

This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

RM funcional Optogenética

The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional ...

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K vistas.  Stanford University. This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.

Video: Optogenetic Functional MRI

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and molecular approaches allow the investigation of either different stimuli on few neurons, or one stimulus in large parts of the brain, blood oxygenation level dependent (BOLD) functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) allows combining both advantages, i.e. compare the neural activation induced by different stimuli in the entire brain at once. fMRI in songbirds is challenging because of the small size of their brains and because their bones and especially their skull comprise numerous air cavities, inducing important susceptibility artifacts. Gradient-echo (GE) BOLD fMRI has been successfully applied to songbirds 1-5 (for a review, see 6). These studies focused on the primary and secondary auditory brain areas, which are regions free of susceptibility artifacts. However, because processes of interest may occur beyond these regions, whole brain BOLD fMRI is required using an MRI sequence less susceptible to these artifacts. This can be achieved by using spin-echo (SE) BOLD fMRI 7,8 . In this article, we describe how to use this technique in zebra finches (Taeniopygia guttata), which are small songbirds with a bodyweight of 15-25 g extensively studied in behavioral neurosciences of birdsong. The main topic of fMRI studies on songbirds is song perception and song learning. The auditory nature of the stimuli combined with the weak BOLD sensitivity of SE (compared to GE) based fMRI sequences makes the implementation of this technique very challenging.

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

This article shows an optimized procedure for imaging of the neural substrates of auditory stimulation in the songbird brain using functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI). It describes the preparation of the sound stimuli, the positioning of the subject and the acquisition and subsequent analysis of the fMRI data.

Resonancia magnética funcional (fMRI) con estimulación auditiva en Songbirds

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Investigación

Comportamiento

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

De alta resolución Magnética Funcional por imágenes de los métodos de resonancia cerebro medio humano

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Neurociencias

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the interactions of these forebrain circuits has been aided recently by the development of optogenetic methods for light-mediated modulation of neuronal activity. Here, we describe a protocol for examining the functional organization of forebrain circuits&#160;in vitro using laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin, expressed optogenetically via viral-mediated transfection. This approach also exploits the utility of cre-lox recombination in transgenic mice to target expression in specific neuronal cell types. Following transfection, neurons are physiologically recorded in slice preparations using whole-cell patch clamp to measure their evoked responses to laser-scanning photostimulation of channelrhodopsin expressing fibers. This approach enables an assessment of functional topography and synaptic properties. Morphological correlates can be obtained by imaging the neuroanatomical expression of channelrhodopsin expressing fibers using confocal microscopy of the live slice or post-fixed tissue. These methods enable functional investigations of forebrain circuits that expand upon more conventional approaches.

We describe a method for characterizing the functional topography and synaptic properties of forebrain circuits using an optogenetic approach to photostimulate neuronal populations&#160;in vitro.

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of single neurons and region-specific transmitter release, up to whole neuronal circuitries in the central nervous system, and allows the direct measurement of behavioral outcomes. Neurons express optogenetic tools via an injection of viral vectors carrying the DNA of choice, such as Channelrhodopsin2 (ChR2). Light is brought into specific brain regions via chronic optical implants that terminate directly above the target region. After two weeks of recovery and proper tool-expression, mice can be repeatedly used for behavioral tests with optogenetic stimulation of the neurons of interest.
Optogenetic modulation has a high temporal and spatial resolution that can be accomplished with high cell specificity, compared to the commonly used methods such as chemical or electrical stimulation. The light does not harm neuronal tissue and can therefore be used for long-term experiments as well as for multiple behavioral experiments in one mouse. The possibilities of optogenetic tools are nearly unlimited and enable the activation or silencing of whole neurons, or even the manipulation of a specific receptor type by light.
The results of such behavioral experiments with integrated optogenetic stimulation directly visualizes changes in behavior caused by the manipulation. The behavior of the same animal without light stimulation as a baseline is a good control for induced changes. This allows a detailed overview of neuronal types or neurotransmitter systems involved in specific behaviors, such as anxiety. The plasticity of neuronal networks can also be investigated in great detail through long-term stimulation or behavioral observations after optical stimulation. Optogenetics will help to enlighten neuronal signaling in several kinds of neurological diseases.

With optogenetic manipulation of specific neuronal populations or brain regions, behavior can be modified with high temporal and spatial resolution in freely moving animals. By using different optogenetic tools in combination with chronically implanted optical fibers, a variety of neuronal modulations and behavioral testing can be performed.

Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

Optogenetic modulation of neuronal circuits in freely moving mice affects acute and long-term behavior. This method is able to perform manipulations of ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for using blood oxygen level dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) to image rodents with simultaneous DBS. DBS fMRI presents a number of technical challenges, including accuracy of electrode implantation, MR artifacts created by the electrode, choice of anesthesia and paralytic to minimize any neuronal effects while simultaneously eliminating animal motion, and maintenance of physiological parameters, deviation from which can confound the BOLD signal.&#160;Our laboratory has developed a set of procedures that are capable of overcoming most of these possible issues. For electrical stimulation, a homemade tungsten bipolar microelectrode is used, inserted stereotactically at the stimulation site in the anesthetized subject. In preparation for imaging, rodents are fixed on a plastic headpiece and transferred to the magnet bore. For sedation and paralysis during scanning, a cocktail of dexmedetomidine and pancuronium is continuously infused, along with a minimal dose of isoflurane; this preparation minimizes the BOLD ceiling effect of volatile anesthetics. In this example experiment, stimulation of the subthalamic nucleus (STN) produces BOLD responses which are observed primarily in ipsilateral cortical regions, centered in motor cortex. Simultaneous DBS and fMRI allows the unambiguous modulation of neural circuits dependent on stimulation location and stimulation parameters, and permits observation of neuronal modulations free of regional bias. This technique may be used to explore the downstream effects of modulating neural circuitry at nearly any brain region, with implications for both experimental and clinical DBS.

This protocol describes a standard method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and deep brain stimulation in the rodent. The combined use of these experimental tools allows for the exploration of global downstream activity in response to electrical stimulation at virtually any brain target.

La estimulación cerebral profunda con simultánea fMRI en roedores

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and postsynaptic projections to the visual cortex. Based on its distinct anatomical structure and convenient accessibility, it has become the favored structure for studies on neuronal survival, axonal regeneration, and synaptic plasticity. Recent advancements in MR imaging have enabled the in vivo visualization of the retino-tectal part of this projection using manganese mediated contrast enhancement (MEMRI). Here, we present a MEMRI protocol for illustration of the visual projection in mice, by which resolutions of (200 &#181;m)3 can be achieved using common 3 Tesla scanners. We demonstrate how intravitreal injection of a single dosage of 15 nmol MnCl2 leads to a saturated enhancement of the intact projection within 24 hr. With exception of the retina, changes in signal intensity are independent of coincided visual stimulation or physiological aging. We further apply this technique to longitudinally monitor axonal degeneration in response to acute optic nerve injury, a paradigm by which Mn2+ transport completely arrests at the lesion site. Conversely, active Mn2+ transport is quantitatively proportionate to the viability, number, and electrical activity of axon fibers. For such an analysis, we exemplify Mn2+ transport kinetics along the visual path in a transgenic mouse model (NF-&#954;B p50KO) displaying spontaneous atrophy of sensory, including visual, projections. In these mice, MEMRI indicates reduced but not delayed Mn2+ transport as compared to wild type mice, thus revealing signs of structural and/or functional impairments by NF-&#954;B mutations.
In summary, MEMRI conveniently bridges in vivo assays and post mortem histology for the characterization of nerve fiber integrity and activity. It is highly useful for longitudinal studies on axonal degeneration and regeneration, and investigations of mutant mice for genuine or inducible phenotypes.

In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice

This video illustrates a method, using a clinical 3 T scanner, for contrast-enhanced MR imaging of the na&#239;ve mouse visual projection and for repetitive and longitudinal in vivo studies of optic nerve degeneration associated with acute optic nerve crush injury and chronic optic nerve degeneration in knock-out mice (p50KO).

Imágenes in vivo de Óptica de Fibras Nerviosas Integridad de la RM con contraste en ratones

The rodent visual system encompasses retinal ganglion cells and their axons that form the optic nerve to enter thalamic and midbrain centers, and ...

Avance del mapeo de la corteza visual para una mejor evaluación de los trastornos de la visión

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) of the Visual Cortex with Wide-View Retinotopic Stimulation

High-resolution retinotopic blood oxygenation level-dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) with a wide-view presentation can be used to functionally map the peripheral and central visual cortex. This method for measuring functional changes of the visual brain allows for functional mapping of the occipital lobe, stimulating &gt;100&#176; (&plusmn;50&#176;) or more of the visual field, compared to standard fMRI visual presentation setups which usually cover &lt;30&#176; of the visual field. A simple wide-view stimulation system for BOLD fMRI can be set up using common MR-compatible projectors by placing a large mirror or screen close to the subject's face and using only the posterior half of a standard head coil to provide a wide-viewing angle without obstructing their vision. The wide-view retinotopic fMRI map can then be imaged using various retinotopic stimulation paradigms, and the data can be analyzed to determine the functional activity of visual cortical regions corresponding to central and peripheral vision. This method provides a practical, easy-to-implement visual presentation system that can be used to evaluate changes in the peripheral and central visual cortex due to eye diseases such as glaucoma and the vision loss that may accompany them.

Autor destacado: Perspectivas sobre la investigación de la corteza visual a través del mapeo de resonancia magnética funcional de visión amplia 

We have developed techniques for mapping the visual cortex function utilizing more of the visual field than is commonly used. This approach has the potential to enhance the evaluation of vision disorders and eye diseases.

Resonancia magnética funcional (fMRI) de la corteza visual con estimulación retinotópica de visión amplia

High-resolution retinotopic blood oxygenation level-dependent (BOLD) functional magnetic resonance imaging (fMRI) with a wide-view presentation can be ...

RM funcional Optogenética

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Resonancia magnética funcional (fMRI) con estimulación auditiva en Songbirds

De alta resolución Magnética Funcional por imágenes de los métodos de resonancia cerebro medio humano

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

La estimulación cerebral profunda con simultánea fMRI en roedores

Imágenes in vivo de Óptica de Fibras Nerviosas Integridad de la RM con contraste en ratones

Resonancia magnética funcional (fMRI) de la corteza visual con estimulación retinotópica de visión amplia

Resonancia magnética funcional (fMRI) de la corteza visual con estimulación retinotópica de visión amplia

Resonancia magnética funcional (fMRI) de la corteza visual con estimulación retinotópica de visión amplia