Name: spatiotemporal mapping of motility in ex vivo preparations of the intestines
Uploaded: 2016-01-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines at JoVE.com

DMK è stata sostenuta da una sovvenzione IRACDA da NIGMS (K12GM093857) alla Virginia Commonwealth University. Questo lavoro è stato sostenuto da NIDDKD concessione DK34153 a John R. Grider.

Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali della Virginia Commonwealth University (IACUC) ha approvato tutti gli animali e le procedure di eutanasia utilizzati in questo protocollo. 1. Preparazione di soluzioni <ol><li> Preparare 4 L di tampone Krebs (composto [in mm]: 118 NaCl, KCl 4.75, 1.19 KH 2 PO 4, 1.2 MgSO4, 2.54 CaCl 2, 25 NaHCO3, 11 glucosio). Pesare le quantità appropriata di ogni sostanza chimica solida, mettere nel volume adeguato di acqua deionizzata e miscelare con un vortice fino a quando la soluzione è limpida. </li><li> Poi, aerare la soluzione con carboxygen (95% O 2, 5% CO 2) per 30 minuti durante il riscaldamento a 37 ° C. </li><li> Determinare il pH della soluzione, mentre a 37 ° C (la stessa temperatura come nel bagno organo) e regolare a pH 7,4 con HCl, se necessario. Mantenere il tampone Krebs continuamente carboxygenated ea 37 ° C per tutta la durata dell&#39;esperimento. </li><li> Metterei tubi di afflusso e deflusso delle pompe peristaltiche nel serbatoio tampone e accendere le pompe peristaltiche per iniziare perfusione del buffer di tutto il sistema vasca tubi e organo. NOTA: Buffer può inizialmente essere pompata nel contenitore originale fino l&#39;aggiunta di due tessuti nei bagni d&#39;organo o di sostanze chimiche nel buffer di perfusione. Questo riduce la quantità totale di tampone richiesto per la sperimentazione. Poi le linee di perfusione tampone in uscita deve essere collocato in un contenitore vuoto in modo che i buffer uscita che in entrata non si mescolano. </li><li> Calibrare la temperatura del sistema di riscaldamento sul circolatore bagno in modo che il buffer nei bagni organo diventa e rimane 37,0 ± 0,5 ° C per tutta la durata dell&#39;esperimento. Conferma e modificare, se necessario, il pH del tampone Krebs almeno una volta prima immissione segmenti del tessuto nel bagno nel passo 2.8. </li></ol> 2. Preparazione di tessuti <ol><li> Eutanasiauna cavia utilizzando anidride carbonica inalazione / asfissia in una camera sigillata o un altro metodo di eutanasia approvato dalla cura degli animali e l&#39;uso comitato locale. </li><li> Dopo aver confermato l&#39;eutanasia degli animali, tagliare aprire la parete addominale longitudinalmente con le forbici dissezione e individuare gli intestini. Tagliare il mesentere attaccato al piccolo intestino per aiutare a smascherare cieco. NOTA: Per verificare l&#39;eutanasia eseguire una procedura secondaria, come la toracotomia bilaterale come approvato da un comitato cura degli animali e l&#39;uso. </li><li> Individuare l&#39;estremità distale del cieco e il colon prossimale transetto appena distale al suo collegamento al cieco. Poi transetto il colon prossimale di nuovo ~ 8 cm distalmente alla prima resezione. </li><li> Collocare il tessuto del colon in soluzione Krebs riscaldato e carboxygenated (descritto nella sezione 1) per ulteriori dissezione. Pin i due punti nel bagno dissezione e utilizzare un insieme ridotto di forbici per rimuovere la maggior quantità mesenterio e grasso possibile. </li><li> Nella hvassoio dissezione eated, rimuovere tutti i contenuti endoluminale delicatamente perfusione di tampone Krebs attraverso il lume con una siringa accoppiato ad un catetere estremità smussata (per aiutare a prevenire la perforazione del tessuto). Evitare sovradistensione del segmento durante questo processo perfusione. </li><li> Ottenere due cateteri tubo di vetro ribruciate (diametro 3 mm) e posizionare un breve pezzo di tubo di polietilene (~ diametro 3 mm di lunghezza e ~ 3 mm) attorno alla porzione del tubo di vetro di entrare nel lume del tessuto. NOTA: Questo permetterà la sutura da collocare intorno al tubo di tessuto di vetro e di rimanere sicuro e non scivolare la preparazione viene posto nel bagno organo e durante variazioni di lunghezza del tessuto. </li><li> Inserire un catetere nel fine orale della preparazione dei tessuti e legare una sutura intorno al piccolo pezzo di tubo che circonda il catetere con il nodo di un chirurgo. Cercate delicatamente di catetere di nuovo fuori per assicurarsi il nodo è comodo. Quindi, eseguire la stessa azione dall&#39;altro t catetere entrareegli aboral fine del tessuto. </li><li> Una volta che i cateteri sono fissati, spostare l&#39;intera preparazione (tessuto più cateteri) dal vassoio dissezione in uno dei bagni d&#39;organo. Posizionare la preparazione nel bagno con l&#39;estremità orale rivolto verso l&#39;utente. </li><li> Successivo montare / fissare i cateteri tubo di vetro al bagno organo di uno dei due metodi suggeriti. NOTA: fissare il vetro tubi impediscono il segmento tessuto di modificare la lunghezza durante l&#39;esperimento o venendo sopra il livello del tampone Krebs nel bagno. <ol><li> Opzione A: Fissare la parte superiore del tubo di vetro alla parte superiore del lato della vasca organo plastica attraverso l&#39;uso di argilla di modellatore o una clip di plastica. </li><li> Opzione B: Fissare i tubi di vetro per i pali di metallo che tengono le telecamere sopra la preparazione bagno organo mediante l&#39;uso di clip di plastica. </li></ol></li><li> Una volta che i cateteri sono fissate alla vasca, collegare a 5 cm pezzo di tubo all&#39;estremità aperta di ciascun catetere. Per il gatto oraleheter, collegare questi tubi ad una siringa da 10 ml, che sarà utilizzato per iniettare tampone nel lume del colon prossimale segmento. Per il catetere aboral, questo pezzo di tubo consentirà il deflusso luminale di essere diretto in un contenitore di raccolta (50 ml becher, serbatoio, etc.). </li><li> Usando la siringa attaccata all&#39;estremità orale, lentamente a filo riscaldato tampone Krebs attraverso il lume del tessuto per garantire che il liquido può fluire attraverso il tessuto. Il flusso viene confermato uscendo liquido catetere aboral. Calibrare il sistema di video-registrazione (sezione protocollo 3), mentre il tessuto equilibra per 30 min. </li></ol> 3. La calibrazione del sistema di video-recording <ol><li> Calibrare il posizionamento altezza della telecamera, le impostazioni video per la luminosità e il contrasto, e la distanza orizzontale utilizzando il software. NOTA: Le impostazioni migliori per configurazioni perfusione intraluminali sono diverse rispetto alle impostazioni utilizzate per determinare la velocità di pellet di propulsione 13. </li><li> Click sulla scheda esperimento per la fotocamera da calibrare. Poi nel menu &#39;File&#39; click &#39;Calibra&#39;. </li><li> Una volta che il video viene visualizzato nella finestra &#39;calibrare workstation&#39;, impostare la fotocamera a un&#39;altezza dove l&#39;immagine comprende le estremità dei cateteri inseriti nel lume del colon. </li><li> Poi, calibrare la distanza orizzontale visualizzato nell&#39;immagine utilizzando l&#39;adesivo righello traslucido allegato ad ogni vasca. NOTA: Questa calibrazione è fondamentale per i calcoli del software successive di diametro luminale e velocità delle onde contrattili. </li><li> Nella stessa finestra &#39;workstation calibrare&#39;, impostare le linee guida verticali rosse in modo che essi sono di 10 mm l&#39;uno dall&#39;altro secondo il righello nell&#39;immagine della telecamera. Poi, digitare la distanza adeguata (10 mm) nella finestra &#39;cursori a distanza »e fare clic sul pulsante&#39; CAL &#39;. </li><li> Avanti, regolare il guadagno, la luminosità, e otturatore cursori all&#39;interno della finestra &#39;calibrare workstation&#39; per modificare l&#39;immagine della telecamera in modo cheil segmento di tessuto appare come una sagoma scura su uno sfondo chiaro. NOTA: La figura 4 mostra esempi di questa procedura di calibrazione buoni e cattivi. </li><li> Per regolare correttamente l&#39;immagine, regolare anche il focus e apertura manopole la fotocamera stessa. </li><li> La calibrazione è ora completa. Fare clic su &#39;Salva&#39;, quindi su &#39;OK&#39; nel pop-up, e infine fare clic sul pulsante &#39;EXIT&#39;. </li></ol> 4. Procedure Generale Sperimentali <ol><li> Dopo le procedure di calibrazione della fotocamera e 30 minuti per il raggiungimento dell&#39;equilibrio del tessuto sono completi, il nome delle prove in ciascun protocollo sperimentale. Nomi di prova possono essere basati sul nome e la concentrazione del composto e il volume di liquido che viene endoluminale perfusi nel segmento di tessuto durante quella parte dell&#39;esperimento. </li><li> Poi, occludere il tubo che sporge dal catetere aboral attraverso l&#39;uso di un morsetto del tubo. NOTA: Questo impedisce luminale liquido di uscire alla fine aboral durante Fusperimentazione rther, permettendo l&#39;uso di specifici volumi nel lume di provocare vari livelli di distensione (Figura 1). </li><li> Iniettare circa 0,7 ml di tampone Krebs nel lume del colon prossimale per fornire abbastanza distensione di avviare contrazioni propulsive nella cavia ex vivo preparazione. NOTA: Questo volume può variare leggermente (0,1 - 0,2 ml) in funzione della lunghezza complessiva del segmento intatto e la quantità di stirata applicata al segmento nel bagno organo. </li><li> Una volta che il segmento è dilatato dal fluido luminale, accendere la fotocamera e quindi registrare la motilità per un periodo predeterminato di tempo (ad esempio, 10 min). <ol><li> In particolare, fare doppio clic sul processo nome appropriato per aprire la vista sperimentale fotocamera e quindi l&#39;interruttore in posizione &quot;ON&quot; per visualizzare il campo della fotocamera. Quindi, fare clic sul pulsante di registrazione per iniziare la registrazione (pulsante di registrazione rimarrà rosso mentre la fotocamera è di registrazione) unand fare di nuovo clic sul pulsante di registrazione per interrompere la registrazione. </li></ol></li><li> Al termine di questo processo iniziale distensione controllo, svitare / rimuovere il morsetto occludere il catetere aboral per consentire il segmento tissue per spingere il liquido distendere fuori del lume. </li><li> Dopo 10 min periodo di riequilibrio, ripetere questa procedura con qualsiasi di una varietà di sostanze nutritive, agenti bioattivi, farmaci o agonisti / antagonisti nel fluido luminale modificare la motilità propulsiva del segmento (ad esempio, acidi grassi a catena corta o decanoico L&#39;acido) 10,18. <ol><li> Per aiutare calibro quando il nuovo fluido sperimentale entra nel segmento colico, lasciare una bolla d&#39;aria vicino al porto della siringa in modo che dopo la perfusione della nuova soluzione nel colon lume il progresso della bolla permetterà all&#39;utente di sapere quando il fluido sperimentale ha raggiunto il lume. </li><li> Continuare perfusione intraluminale con il catetere aborale aperta finché la bolla è stato premuto completamente attraverso ilsistema di perfusione luminale (può richiedere 2-3 ml di perfusato). Poi, consentono il segmento tessuto di espellere fluido attraverso il catetere aboral aperta per 5 min. NOTA: Dopo questa procedura, il lumen conterrà un volume d&#39;fluido, consentendo perfusione di un volume noto di liquido nel lume. </li></ol></li><li> Re-occludere il tubo del catetere luminale aboral utilizzando un morsetto tubo (come al punto 4.3) iniettare lo stesso volume di distensione fluido come nella condizione di controllo attraverso la siringa. Registra gli schemi di motilità del periodo sperimentale per successiva analisi e confronto alla condizione Krebs di controllo (come nel passaggio 4.5). </li><li> Ripetere paragrafi 4.4 - 4.7 del protocollo con diversi composti luminali o diverse concentrazioni dello stesso composto luminale. </li></ol> 5. Costruzione di mappe spazio-temporale (STmaps) <ol><li> Dopo il completamento della registrazione dell&#39;esperimento, fare doppio clic sul nome di un processo specifico per aprire il vento analisiow per la costruzione di un STmap. </li><li> All&#39;interno dell&#39;area di riproduzione video, regolare i cursori contrasto e della luminosità nella finestra di analisi per rendere l&#39;immagine appropriata per l&#39;analisi (nero silhouette tessuto su sfondo chiaro, figura 4). NOTA: Se la calibrazione fotocamera non è stata eseguita in modo appropriato prima di iniziare l&#39;esperimento l&#39;immagine può essere modificata solo in misura minore, a questo punto. </li><li> Quando l&#39;immagine è contrastata correttamente, impostare le linee orizzontali e verticali rossi all&#39;interno della finestra immagine video per isolare la regione di tessuto per l&#39;analisi e rimuovere le aree contenenti artefatti. Inoltre, selezionare il segmento temporale appropriata dalla registrazione determinando inizio e fine punti di tempo per l&#39;analisi. <ol><li> In particolare, selezionare il punti iniziali e finali all&#39;interno del video utilizzando i pulsanti gialli &#39;B&#39; verde &#39;A&#39; e all&#39;interno del software di analisi. Impostare il cursore tempo per l&#39;inizio del segmento video per analizzare e lan fare clic sul pulsante &#39;A&#39; verde. Quindi, impostare il cursore alla fine del segmento per analizzare e fare clic sul pulsante giallo &#39;B&#39;. </li></ol></li><li> Avanti, fare clic sulla scheda &#39;analisi motore&#39; per aprire la finestra STmap e fare clic sul pulsante &#39;cronometro&#39;. Dopo aver cliccato il cronometro, prossimo clicca il cursore a croce all&#39;interno della sagoma nera del tessuto all&#39;interno del filmato registrato per iniziare generazione STmap. </li><li> Dopo aver cliccato il mirino nella silhouette del tessuto, il software genera e visualizza il STmap per quella regione del video. NOTA: Questa operazione potrebbe richiedere alcuni minuti a seconda della lunghezza del video selezionato per l&#39;analisi. </li><li> Fare clic su &#39;Zoom&#39; per vedere l&#39;immagine ingrandita della STmap e controlli per regolare l&#39;immagine. <ol><li> Selezionare l&#39;opzione &#39;colore&#39; nella finestra appena creata per visualizzare l&#39;STmap come colore invece che in scala di grigi. Inoltre, fare clic sull&#39;opzione &#39;Abilita&#39; per essere in grado di posizionare il cursore su specifici pixel all&#39;interno della mappa e view un tracciato della variazione di diametro luminale per quella regione tessuto specifico. Fare clic su &#39;Exit&#39; una volta terminato. </li></ol></li><li> Esportare un STmap per l&#39;uso in documenti o presentazioni o per analizzare ulteriormente in ImageJ selezionando il menu &#39;File&#39;, poi selezionando &#39;esportazione dati&#39; e poi &#39;Meta File&#39;. Nome della STmap, che sarà salvato come file EMF e fare clic sul pulsante &#39;Salva&#39;. </li><li> In alternativa, salvare le immagini del STmap catturando uno screenshot. Ciò è necessario per salvare le versioni pseudo-colore del STmap. </li></ol> 6. Analisi della contrattile della velocità dell&#39;onda in STmaps <ol><li> Per analizzare la velocità di propagazione contrattile o la durata di contrazione, prima convertire il file STmap .emf a .tiff, .gif, .jpg, .bmp o formati che siano accettabili per ImageJ attraverso un programma di conversione di file di scelta. NOTA: ImageJ non apre il formato di output EMF dei STmaps dal software. <ol><li> Alternatively, uso software cattura screenshot per scattare una foto di un STmap sullo schermo e salvarlo in un formato di file appropriato. </li></ol></li><li> Quindi aprire il STmap ri-formattato in ImageJ e quindi aprire il plugin GIMMProcessor aprendo il &#39;menu e selezionando&#39; &quot;Plugins GIMMProcessor &#39;. Si aprirà due&#39; finestre GIMMProcessor &#39;e&#39; Misure Tabella. </li><li> Fare clic sul &#39;strumento di selezione rettangolare&#39; all&#39;interno della finestra di ImageJ e quindi utilizzarlo per delineare cliccando e trascinando l&#39;intera area della barra di scala nell&#39;angolo in alto a destra della STmap. Dopo aver selezionato quella regione, fare clic sul pulsante &#39;set di calibrazione&#39; nel plugin. Infine, inserire la distanza adeguata (mm) e il tempo (sec) nella casella di taratura secondo i valori sulla barra di scala e fare clic su &#39;Fatto&#39;. </li><li> Avanti, fare clic sullo strumento di disegno riga nella finestra di ImageJ. Tracciare una linea sul STmap attraverso il centro di una contrazione propaga lungo l&#39;angolo di the pendenza cliccando e trascinando l&#39;immagine STmap su. In alternativa, tracciare una linea verticale attraverso una banda di non propagazione contrazione per determinare la durata di contrazione. </li><li> Dopo che la linea è disegnata in modo appropriato (una sola riga, può essere oggetto alla volta), fare clic sul pulsante &#39;prendere la misura&#39; nel plugin per generare una lettura-out della distanza orizzontale, distanza verticale, e la pendenza della linea; che corrispondono alla lunghezza (mm), il tempo (sec), e la velocità (mm / sec), rispettivamente. Questi dati vengono visualizzati nella finestra &#39;Misure Table&#39;. </li><li> Ripetere il disegno al tratto e l&#39;analisi i passaggi più volte all&#39;interno di un determinato STmap e salvare i dati in un file .gmd. Fare clic sul pulsante &#39;Salva&#39; nel plugin e il nome del file. Quindi fare clic di nuovo &#39;Salva&#39; per completare il processo. Questi dati possono poi essere confrontati con altri dati di prova o utilizzati per ri-disegnare linee su un STmap. </li></ol>

Catamount Research and Development, Inc., creator of the GIMM system, covered publication fees for this manuscript.

Motilità intestinale è stato visto e descritto da diversi punti di vista in base alla natura dei parametri in registrazione. Video registrazione e mappatura spaziotemporale è dimostrato uno strumento prezioso che permette l&#39;analisi di movimento complessivo e / o spinta su lunghe segmenti di intestino e analisi dell&#39;attività in punti specifici lungo il segmento. Il metodo adottato per la registrazione video e mappatura spaziotemporale può essere duplice e è riflettente della regione esaminato e la natura del contenuto luminale. Nei segmenti intestinali cui contenuto luminale più fluidi e colon prossimale cui contenuti sono più semi-solido, l&#39;attività è indotta dall&#39;introduzione di fluido intraluminale in bolo o per infusione. Mappe spazio-temporali in queste registrazioni video sono progettati per rappresentare il movimento dell&#39;intera segmento come descritto sopra. Al contrario, nel medio colon distale, dove i contenuti sono più solide, l&#39;attività è iniziata da inserimento di una pelle fecalet (epossidiche pellet naturali o artificiali pellet) e le mappe spazio-temporali sono progettati per riflettere il movimento del pellet attraverso i due punti come illustrato nell&#39;articolo JOVE di Hoffman et al. 13. Così la configurazione dell&#39;esperimento e l&#39;analisi sono cruciali e dipende dal tipo di stimolo e la regione in fase di studio. Pertanto, le fasi critiche per la generazione e l&#39;analisi delle mappe spazio-temporali di liquido indotta motilità intestinale sono: 1) corretta eliminazione del mesentere dal tessuto sezionato; 2) calibrazione dell&#39;immagine corretta prima della registrazione; 3) la corretta rimozione di artefatti durante la generazione e l&#39;analisi STmap; 4) la corretta configurazione del sistema di analisi; e 5) conquistando la manualità cateterizzare e suturare i segmenti senza danneggiarli. Mentre l&#39;uso di STmaps di diametro luminale hanno migliorato la capacità di visualizzare e analizzare i modelli completi motilità su una regione dell&#39;intestino, la tecnica è ottimale quando accoppiato conmisurazioni funzionali di pressione o di contrazione muscolare 2,15,20. Ad esempio, mentre alcune contrazioni muscolari possono cambiare diametro luminale leggermente ed essere visibile su alcuni STmaps (cioè, ondulazione miogenici) non possono effettivamente causare alcun propulsione o la miscelazione del contenuto intestinale 25. Questo non può essere conosciuta senza giunto di questa tecnica per altre misurazioni funzionali. Inoltre, la natura di molti preparati tissutali in questo tipo di sistema (cioè, un sistema chiuso o luminale costante perfusione luminale da un sistema di pompa) comporta difetti all&#39;interno STmaps. Così, l&#39;utente deve essere a conoscenza di come la loro preparazione organo specifico e esperimento può portare ad artefatti nei dati e modi per evitare o escludere questi artefatti di analisi dei dati (ad esempio, linee verticali mesentere indotta o pixelation buio a causa dell&#39;incapacità del tessuto espellere fluido dal sistema in un preparato luminale chiuso). Esistono diversi metodi per perfusione luminale di un intatto segmento intestinale oltre ad un sistema chiuso. Un metodo è quello di utilizzare invece un sistema aperto che mantiene costante intraluminale / indietro pressione attraverso l&#39;uso di un tubo in rilievo e / o la valvola unidirezionale sull&#39;estremità anale della preparazione 8-10,30. Questo permette al fluido di muoversi fuori dalla preparazione durante contrazioni propulsive. Poiché il sistema è configurato principalmente per rilevare i cambiamenti di diametro luminale, quelle contrazioni o modelli di motilità che non incidono notevolmente diametro luminale sono spesso difficili da visualizzare da questo protocollo. Poiché l&#39;evoluzione delle shading pixel all&#39;interno della STmap sono basati su variazioni di diametro luminale, schemi di motilità che non provocano grandi cambiamenti nel diametro non saranno visualizzati anche in questo metodo se contrazioni forti sono presenti anche all&#39;interno della stessa registrazione. Come descritto per la visualizzazione e l&#39;analisi di ondulazione tipo di contrazione (figura 3), cala analisi della registrazione video vicina to la parete tessuto può ovviare a questo problema. Questo metodo riduce il diametro massimo visualizzato all&#39;interno STmap, così contrazioni che cambiano solo minimamente diametro tessuto possono essere visualizzati. Un&#39;altra opzione per risolvere questo problema sta cambiando la durata del segmento video analizzato, per escludere contrazioni che influenzano notevolmente diametro luminale, cosicché contrazioni più piccoli sono più facilmente visualizzate. Questo porta al potenziale problema di motilità che cambia minimamente diametro luminale cercando simile a un STmap separato dove contrazioni notevolmente cambiati diametro luminale. Questo perché la determinazione di pixel bianchi sulla mappa si basa sul diametro più piccolo in un determinato video. Se non c&#39;è molto variabilità del diametro all&#39;interno del video (poca o nessuna contrazione del muscolo circolare) molto piccole contrazioni che non cambiano il diametro del preparato può notevolmente simile a contrazioni peristaltiche da un altro video. Pertanto, è importante considerare la figuraleggenda nell&#39;angolo in alto a destra della mappa. Se la differenza tra i diametri massimo e minimo è piccola, è importante confrontare il STmap al video è stato generato per determinare la validità del cambiamento ombra pixel come rappresentato nel STmap. Pertanto, l&#39;esame della barra della scala in collaborazione con la registrazione effettiva è fondamentale per la corretta interpretazione della mappa. Registrazione video e mappatura spazio-temporale di segmenti intestinali e del colon sono stati applicati a una varietà di specie, tra cui 26 zebrafish, topo 25,27 - 30, ratto 7,9,30 - 33, cavia 5,6,8,13 - 19, 24,30,32,34,35, trichosurus 12,36, coniglio 2,30,37,38, pollo 39, maiale 40,41 e umano 42. Le specie più studiati è la cavia. Questo non è sorprendente perché la cavia sistema nervoso enterico hcome stato più completamente caratterizzata e storicamente è stato l&#39;animale più studiato in vitro per quanto riguarda la motilità propulsiva dell&#39;intestino 43. Mappatura spazio-temporale è stato per lo più applicata ai segmenti tubolari di budella da piccoli animali; tuttavia, gli studi nei sistemi modificati utilizzando il coniglio e maiale dimostrano l&#39;applicazione di questa metodologia di animali più grandi. Nel caso del coniglio, l&#39;approccio è identico a quello degli animali inferiori, salvo che i segmenti grandi e bagni di organi sono stati utilizzati 30. L&#39;approccio utilizzato nel maiale era di utilizzare un ciclo di esteriorizzato dell&#39;intestino da un suino anestetizzato piuttosto che l&#39;immersione di un segmento di tessuto sezionato in un bagno d&#39;organo. Inoltre, STmaps sono stati generati da cross-correlazione piuttosto che il metodo utilizzato nella transilluminazione maggior parte degli studi 40. L&#39;isolato, vascularly perfuso preparazione loop per la registrazione video e la mappatura spazio-temporale è stata applicata anche alle specie più piccole, come ratto <sup&gt; 33. Un recente studio condotto da Kuizenga et al. è il primo uso di STmaps dei video registrati modelli di motilità in ex vivo segmenti dell&#39;intestino umano 42; sebbene, approcci STmapping sono stati applicati all&#39;analisi di manometriche (pressione) registrazioni nell&#39;uomo in vivo 3,44. Gli schemi di motilità registrati nel tessuto umano sono simili a quelli già registrati in modelli animali con tecniche simili e convalidare l&#39;estensione di questo approccio di tessuti umani. È interessante notare che questo studio STmaps combinati derivano da registrazioni video con misurazione della contrazione muscolare registrata da trasduttori di forza. La misurazione della pressione intraluminale da una fibra ottica catetere manometrico inserito nel segmento ex vivo è stata anche convertito in STmap, che mostra la versatilità del STmap visualizzare più di cambiamenti di diametro luminale. Questo approccio tensione muscolare correlazione combinata, pressione endoluminale e il movimento della parete permetteper un&#39;analisi funzionale delle STmaps generate da registrare video più approfondita. Studi di STmaps generati dai movimenti a muro e variazioni del diametro luminale (chiamato anche DMAP) hanno permesso la descrizione dettagliata dei modelli di motilità come le onde peristaltiche propulsive e le contrazioni segmentale localizzati. Mentre questi modelli sono stati identificati con metodi sperimentali precedenti, l&#39;attuale approccio consente una definizione più raffinata dei movimenti contrattili localizzati, come increspature e nuove contrazioni anti-peristaltiche 9,24,25,30,31,42. La costruzione di STmaps e analisi delle variazioni del pattern di motilità sono stati applicati alle domande chiave nella motilità gastrointestinale dell&#39;intestino e del colon. Questi includono: la differenziazione delle contrazioni neurogena e miogenici e la definizione del ruolo delle cellule interstiziali di Cajal 6,9,11,12,16,24,26,27,29 - 31,33,37 - 40,42, la comprensione del complessointerazioni tra gli strati muscolari circolari e longitudinali 2,7,8,11,12,32,39,40, esaminando gli effetti dei nutrienti intraluminali 10,18,19, 34 ceppi microbici, e viscosità 12,36 su vari modelli di motilità, e la comprensione del ruolo di vari agenti neuro-ormonali endogeni e agenti farmacologici esogeni 2,4 - 7,9,10,13 - 17,28,35,40 nella generazione e modifica della motilità. Il futuro di questa tecnica comporta l&#39;accoppiamento con altre misure, tra cui pressione, elettrofisiologia e tensione / contrattilità. Recenti studi hanno spesso incorporato una o più di queste misurazioni in combinazione con registrazione video e mappatura spaziotemporale per fornire ulteriori dettagli correlativo 2,42. Inoltre, il sistema può essere utilizzato per misurare la motilità in altri organi tubolari e non tubolari. Ad esempio, si è tentato di misurare la motilità gastrica usandoun tale sistema, ma la tecnica e il software necessario raffinatezza quantificare meglio motilità in un organo simile non-tubolare 45. Non vi è dubbio che l&#39;utilizzo di tecniche di mappatura spatiotemporal solo e in combinazione con i metodi più tradizionali di analisi porterà ad una più approfondita e completa comprensione della motilità gastrointestinale in futuro.

Vari metodi di registrazione e l&#39;analisi motilità intestinale sono state sviluppate nel corso degli ultimi 150 anni 1. Questi hanno spaziato da quella iniziale in vivo osservazioni e descrizioni di William Beaumont e di Walter Cannon ai metodi più recenti di misura e l&#39;interpretazione di registrazione multisito di tensione muscolare, pressione intraluminale, e / o potenziale di membrana (cioè potenziali giunzionali) 2 - 6. Questi ultimi approcci forniscono un&#39;istantanea di modelli generali motilità, ma sono limitati dal numero di siti di registrazione e la validità interpolazione dei dati da zone tra i siti di registrazione. Il recente sviluppo di registrazione video e le tecniche di mappatura spazio-temporale (STmap) hanno permesso di osservare e analizzare i modelli di motilità complessi ex vivo interi segmenti di colon e dell&#39;intestino. Approcci iniziali, prima descritte per intessegmenti fonodale alla fine del 1990, 7,8 dipendeva software investigatore-progettato per analizzare la registrazione video; molti gruppi hanno ora creato o modificato il software per questo scopo 2,8 - 12. Mentre molti gruppi hanno generato i loro pacchetti software propri o plugin, tutti analizzano diametri di un segmento di tessuti e convertire i vari diametri alla rappresentazione in scala di grigi. Un sistema di registrazione e di analisi disponibili in commercio chiamato il Sistema di monitoraggio motilità gastrointestinale (GIMM) fornisce un approccio chiavi in mano che consente di analizzare sia motilità propulsiva via fecale determinazione velocità pellet nella cavia colon distale 13 così come l&#39;analisi dei modelli di motilità propulsiva e miscelazione con uno stimolo liquido nei segmenti intestinali intatte 4,5,14 - 19. Quest&#39;ultimo approccio dipende la generazione e l&#39;analisi di STmaps ed è descritto in questo documento. L&#39;obiettivo di questo metodo è quello di aumentare tha capacità di analizzare qualitativamente e quantitativamente diversi schemi di motilità presenti nell&#39;intestino. Mentre altri gruppi hanno usato il STmap per l&#39;analisi della motilità attraverso il proprio software, questa è la prima descrizione di come utilizzare il GIMM per analizzare i modelli di motilità dalla generazione di STmaps. Nel presente lavoro, forniamo istruzioni dettagliate passo-passo su: la preparazione dei tessuti intestinali per la registrazione video, la corretta impostazione dei parametri di registrazione video per massimizzare la capacità di rilevare variazioni del diametro del tessuto, la creazione di STmaps, così come il interpretazione e analisi dei STmaps utilizzando il sistema GIMM e software ImageJ. Il metodo qui descritto è specifico per l&#39;analisi della perfusione luminale dei liquidi o semisolidi contenenti composti che influenzano gli schemi di motilità intestinale. Un metodo per l&#39;analisi di fecale pellet propulsione è descritto in un articolo di Mawe e colleghi 13. Il metodo generale qui descritto potrebbe essereapplicato ad altri organi tubolari muscolari lisce quali: tenue, vasi sanguigni, uretra, ureteri, ecc Mentre questo metodo da solo non fornisce dati sulle variazioni di pressione o tensione muscolare, potrebbe essere accoppiato con l&#39;uso di pressione trasduttori, trasduttori di forza o misurazioni elettrofisiologiche per fornire un quadro più completo dei modelli di motilità come alcuni altri gruppi hanno dimostrato 2,15,20,21.

<table><tbody><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>For Krebs buffer.</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>For Krebs buffer.</td></tr><tr><td>Potassium Phosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher</td><td>P285</td><td>For Krebs buffer.</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>For Krebs buffer.</td></tr><tr><td>Calcium Chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>For Krebs buffer.</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td>For Krebs buffer.</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>For Krebs buffer.</td></tr><tr><td>Carboxygen (95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting trays/dishes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dunkin Hartley Guinea Pigs</td><td>Charles River</td><td>Strain 051</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td>Freely available online.</td></tr><tr><td>GastroIntestinal Motility Monitor (GIMM)</td><td>Catamount Inc., St. Albans, Vermont</td><td></td><td>Includes parts listed below.</td></tr><tr><td>Peristaltic Pumps</td><td></td><td></td><td>Included with GIMM.</td></tr><tr><td>Bath Cameras</td><td></td><td></td><td>Included with GIMM.</td></tr><tr><td>Bath TransIllumination Backlights</td><td></td><td></td><td>Included with GIMM.</td></tr><tr><td>Organ Baths</td><td></td><td></td><td>Included with GIMM.</td></tr><tr><td>Backlight Intensity Controls</td><td></td><td></td><td>Included with GIMM.</td></tr><tr><td>GIMM Processor ImageJ Plugin</td><td></td><td></td><td>Included with GIMM.</td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing</td><td></td><td></td><td>Included with GIMM.</td></tr><tr><td>Tubing Connectors</td><td></td><td></td><td>Included with GIMM.</td></tr><tr><td>Masterflex tubing for Peristaltic Pumps</td><td></td><td></td><td>Included with GIMM.</td></tr><tr><td>Heating Bath/Water Circulator</td><td></td><td></td><td>Included with GIMM.</td></tr></tbody></table>

spatiotemporal mapping of motility in ex vivo preparations of the intestines

Molteplici approcci sono stati utilizzati per registrare e valutare la motilità gastrointestinale, tra cui: i cambiamenti di registrazione in tensione muscolare, la pressione endoluminale, e potenziale di membrana. Tutti questi approcci dipendono misurazione dell&#39;attività in una o più posizioni lungo l&#39;intestino contemporaneamente che vengono poi interpretati per fornire un senso di schemi generali di motilità. Recentemente, lo sviluppo di registrazione video e le tecniche di mappatura spazio-temporale (STmap) hanno permesso di osservare e analizzare modelli complessi in ex vivo interi segmenti di colon e dell&#39;intestino. Una volta registrati e digitalizzati, registrazioni video possono essere convertiti in STmaps in cui il diametro del lume viene convertito in scala di grigi oa colori [chiamato mappe di diametro (DMAP)]. STmaps possono fornire dati sulla direzione motilità (ossia, stazionario, peristaltica, antiperistaltici), velocità, durata, frequenza e la forza contrattile dei modelli di motilità. I vantaggi di questo approccio sono: analysis di interazione o sviluppo simultaneo di diversi schemi di motilità in diverse regioni dello stesso segmento, visualizzazione del modello motilità cambia nel tempo, e l&#39;analisi di come l&#39;attività in una regione influenza l&#39;attività in un&#39;altra regione. Le registrazioni video possono essere riprodotti con differenti scadenze e parametri di analisi in modo che STmaps separati ed i modelli di motilità possono essere analizzati in modo più dettagliato. Questo protocollo dettagli in particolare gli effetti della distensione fluida e intraluminali stimoli intraluminali che influenzano la generazione motilità. L&#39;uso di agonisti e antagonisti dei recettori luminali fornisce informazioni su come meccanicistica specifici modelli sono iniziati e come un modello può essere convertito in un altro modello. La tecnica è limitata dalla capacità di misurare solo la motilità che provoca cambiamenti nel diametro luminale, senza fornire dati su cambiamenti di pressione intraluminale o tensione muscolare, e la generazione di artefatti basate su apparato sperimentale; anche se, analysimetodi s possono spiegare questi problemi. Rispetto alle precedenti tecniche la registrazione video e l&#39;approccio STmap fornisce una comprensione più completa della motilità gastrointestinale.

Comprendere mappe spazio-temporali (STmaps) come mappe Diametro (DMAP) Mentre le mappe generati da questa tecnica sono spaziotemporale, variazioni del diametro luminale del tessuto è il parametro specifico sia visualizzato in distanza e tempo. Il STmap ritrae distanza orizzontale lungo il segmento tissue l&#39;asse x (in mm) e l&#39;ora l&#39;asse y (in sec) con il tempo di avviamento al momento alto e termina nella parte inferiore. Nell&#39;angolo in alto a destra è una leggenda, che visualizza diametro luminale minimo e massimo, nonché di scala sia per la xey assi (Figure 1-4). Così, diverse tonalità di pixel all&#39;interno dell&#39;immagine in scala di grigio corrispondono a differenti diametri luminale. Più scuri pixel corrispondono ai diametri più ampi e pixel più chiari corrispondono ai diametri più piccoli. Pertanto, onde contrattili del muscolo circolare appariranno come regioni di pixelation leggero a causa della riduzione del diametro luminale ( <strong&gt; Figura 1 frecce nere). Al contrario, distensione luminale causa rilassamento muscolare circolare o un grande bolo di fluido provoca un aumento del diametro luminale e scuri pixel nelle (frecce bianche Figura 1C) STmap / Dmap. Un ulteriore discussione della formazione e del significato della STmaps può essere trovato in un articolo di gruppo di Lammers 11. Luminal distensione-indotte moltiplicazione Contrazioni Nella figura 1, cavia colon prossimale è dilatato con 0,5, 1,0, 1,5, e 2,0 ml di tampone Krebs per 5 minuti a ciascun volume. Contrazioni moltiplicazione stati suscitato da tutti i volumi ≥1.0 ml e appaiono bande bianche sottili nella STmap (Figura 1). La distensione del lume intestinale provoca l&#39;apertura di contrazioni moltiplicazione. Come mostrato in figura 1, il diametro del lume aumenta con maggiori volumi intraluminali e i pixel del STmapcorrisponde al suo diametro diventa più scuro creando uno sfondo scuro complessiva. Ad un certo livello di distensione viene attivato il riflesso peristaltico (1,0 ml; Figura 1), che avvia onde propulsive di contrazione al termine orale che riducono il diametro del lume e si muovono verso la fine anale del segmento (mostrato come bande bianche nelle figure 1 e 4). Il bianco contrazione banda rappresenta è spesso preceduta da una banda scura, che rappresenta il rilassamento aboral avanti dell&#39;onda peristaltica (frecce bianche Figura 1C). Questi pixel bianchi e neri corrispondono alla contrazione ascendenti e discendenti componenti rilassamento del riflesso peristaltico, rispettivamente 22,23. Nella STmap nella figura 1 pannello A, ci sono 0 onde propulsive a 0.0 ml, 0 onde propulsivi a 0,5 ml distensione, 3 onde propulsivi a 1,0 ml distensione, 6 onde propulsivi a 1,5 ml distensione, e 5 onde propulsivi unt 2,0 ml distensione. Stazionari / contrazioni miscelazione nutrienti indotta Ondate di moltiplicazione contrazione non sono l&#39;unico motivo motilità che può essere visualizzato con STmaps. Modelli miscelazione della motilità come segmentazione può essere visto anche in STmaps e corrispondente immagine (Figura 2A). Questo modello è diverso da quello di moltiplicazione contrazioni. Durante la miscelazione modelli molti piccoli, contrazioni stazionari si verificano in diverse aree contemporaneamente (visualizzato come più piccoli quadrati bianchi nella stessa linea orizzontale, ma non si toccano). Mentre ogni contrazione segmentale è fermo e non si muove nella orale maniera anale come descritto per contrazioni di moltiplicazione, la capacità dei STmaps per illustrare modelli contrattili complessi lunghi periodi di tempo permette la visualizzazione della lenta progressione delle contrazioni anally nel tempo (Figura 2A freccia nera). La durata diogni individuo contrazione può essere determinato anche tracciando una linea verticale attraverso la piazza contrazione bianco utilizzando ImageJ e il plugin associato (Figura 2A). In questo particolare STmap generato da perfusione intra-colon degli acidi grassi a catena corta, la durata media contrazione stazionaria è ~ 2 sec (range: 1,9-2,1 sec). Mentre mesentere rimanente su un segmento tessuto può causare artefatti di analisi, gli artefatti generati da linee verticali mesentere (figure 1B, 2B) possono essere utilizzati per determinare movimenti muscolari longitudinali. Nelle figure 1B e 2B il movimento orizzontale della linea verticale nera è dovuta alla contrazione e rilassamento della muscolatura longitudinale. Questo movimento laterale del muscolo longitudinale può essere visualizzato su STmaps come movimenti orizzontali delle bande verticali generati dai manufatti mesentere (figure 1B, 2B). ImageJ e Plugin Analisi di STmaps Sia la velocità di un&#39;onda di propagazione (Figura 3) così come la durata di contrazione (figura 2) può essere determinata utilizzando ImageJ e il plugin GIMMProcessor. Nella Figura 3, la velocità di propagazione delle onde sia ortograda e retrogrado era ~ 0.25 mm / sec (range: 0.21 al 0.35 mm / sec). Come si può vedere l&#39;immagine video sopra la mappa in ST, le linee di analisi (linee rosse che formano una scatola sull&#39;immagine video) sono stati fissati proprio attorno un bordo del segmento tessuti anziché intorno all&#39;intero segmento. Si tratta di un importante utilizzo delle linee guida nel software. Regolazione precisa di queste linee guida è fondamentale per una corretta analisi del video come ulteriormente analizzati nella sezione di discussione. Questo permette la generazione di un STmap che visualizza miogeniche contrazioni ondulazione 24. Queste contrazioni sono miogenico di origine e non cambiano diametro luminale notevolmente. Inoltre, dir diversoriflessioni di propagazione (ortograda o retrogradi), che sono comuni per increspature, possono essere analizzati utilizzando questa tecnica (Figura 3). Come mostrato in figura 2 la durata della contrazione può variare nelle diverse regioni del segmento tissue. Analisi corretta di STmaps Un potenziale problema con la creazione di STmaps è possibile generazione artefatto dovuto alla metodologia sperimentale. Per esempio, mesentere lasciato all&#39;esterno del tessuto aumenta il diametro lettura per quel segmento del tessuto creando una linea nera verticale sulla STmap (figure 1, 2B). La presenza di mesentere anche amplia artificialmente mappa scala di grigi aumentando la misura più larga lume, che si traduce in un&#39;attenuazione delle misure di contrasto della scala. Per questo motivo è utile per rimuovere il mesentere più completamente possibile dal segmento senza perforare il tessuto. Un<html> altra possibile artefatto STmap è una linea verticale bianca a causa di bolle all&#39;interno del fluido luminale che non può essere contrapposta al nero (Figura 4B). Queste bolle possono rendere il diametro luminale sembrare più piccolo al software di analisi o sovrapporre regioni bianco / luce sugli schemi di motilità del STmap. Pertanto, l&#39;installazione del segmento del tessuto e proprio contrasto della registrazione video prima analisi sono assolutamente cruciale per il successo nella costruzione STmaps (Figura 4). Configurazioni contrastanti corretta e non sono mostrati in Figura 4. È importante notare che la regolazione video sia la calibrazione della camera di pre-esperimento e finestra di analisi post-esperimento sono cruciali per la generazione STmap corretta ed analisi. Calibrazione dell&#39;immagine non corretta può portare a STmaps con dati inutilizzabili (Figura 4A). 700 &quot;/&gt; Figura 1. onde che si propagano nel colon prossimale. (A) Una curva distensione-risposta (eseguita nella cavia colon prossimale) è stata utilizzata per determinare il volume di fluido intraluminale opportuno avviare propagazione delle onde in questo segmento (bande bianche orizzontali). Frecce nere illustrano esempi di onde di propagazione full-length. Frecce bianche illustrano l&#39;artefatto linea causato dalla rimozione mesentere incompleta. (B) Una visione più ravvicinata di moltiplicazione contrazioni raggiunti dalla generazione STmap da un esperimento simile a Pannello A, ma un video di durata più breve. È facile notare che le contrazioni progrediscono in direzione orale anale e per identificare il rilassamento aboral precedente rappresentato come un&#39;area scura avanti della banda bianca rispetto al pannello A. Questa mappa fornisce anche un&#39;altra vista di manufatti mesentere. La scatola rossa identifica la regione di questo STmap ampliato nel Pannello C. (C) Questo pannello mostra una visione ancora più vicina of lo stesso video e la mappa come nel pannello frecce B. Bianchi etichettati punto &#39;Distensione Fluid&#39; di pixel scuri che sono dovuti a luminale distensione da aborale fluido l&#39;onda di propagazione. Si tratta di regioni in cui si verifica il rilassamento muscolare circolare aborale alla contrazione muscolare circolare. Si noti che le contrazioni si propagano sembrano linee completamente orizzontali nel pannello A causa della lunga scala temporale della mappa. Nei pannelli B e C il tempo di scale sono graduale diminuzione in modo che l&#39;onda contrattile ha una pendenza che può essere misurato e riportato come la velocità del movimento delle onde. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53263/53263fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Determinazione della contrazione durata per STmap. (A) Cavia prossimale del colon shOWS un modello motilità miscelazione / segmentale in risposta alla perfusione endoluminale di acidi grassi a catena corta (butirrato). Linee rosse verticali sono state elaborate attraverso i periodi di contrazione per determinare la durata contrazione utilizzando immagine J e il plugin GIMMProcessor. La freccia nera indica la direzione di propagazione aboral delle contrazioni stazionari. (B) contrazioni moltiplicazione in topo ileo spesso mostrano regioni di contrazione sostenuta. Frecce verticali disegnate su questa mappa mostra che le regioni più orali rimasti contratti per una durata più lunga. In questa preparazione, la fine anale della preparazione venne chiuso per evitare fluido di lasciare il sistema chiuso durante le contrazioni del tessuto. L&#39;immagine in alto del pannello mostra un momento in cui l&#39;intera parte orale del tessuto è contratta (bianco su STmap), mentre l&#39;intera parte anale è distesa da fluido (nera STmap). Il movimento orizzontale / laterale del nero verticale nel centro del pannello B STmap mostra il movimento delstrato muscolare longitudinale. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" width="400" /> Figura 3. Schemi bidirezionale motilità. Propagazione onde possono muoversi in entrambe ortogrado (orale anale) e retrograda (anale orali) direzioni. Frecce nere indicano Solid normale propagazione ortograda e frecce nere tratteggiate mostrano propagazione retrograda. La velocità di propagazione sia orthograde e contrazioni retrogrado in questo STmap stati determinati mediante analisi ImageJ ed erano ~ 0.25 mm / sec. Linee di analisi delle immagini (linee rosse che formano una scatola dell&#39;immagine video qui sopra la STmap su) sono stati posti a distanza ravvicinata un bordo del tessuto di visualizzare contrazioni ripple miogenici che sono bassa ampiezza, contrazioni poco profondi spesso orientati in ortograda, retrograde, o entrambe le direzioni. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4. L&#39;importanza del contrasto delle immagini per STmap generazione. (A) mostra un&#39;immagine impropriamente contrastato e STmap, mentre riquadro B mostra un&#39;immagine adeguatamente contrastata e STmap. In (A) le bande orizzontali bianche generato dall&#39;immagine correttamente contrastata (B) non sono così evidenti e ci sono più artefatti (ombreggiamento bianco) a causa l&#39;immagine iniziale di essere in scala di grigi. Nella STmap generato dalla corretta contrastata immagine (B) i manufatti di ombreggiatura bianchi della scala di grigi scompaiono e onde di propagazione sono più pronunciate. Inoltre, l&#39;ombreggiatura nero che rappresenta il rilassamento ahead della propagazione dell&#39;onda contrattile può essere visto nel fine anale del STmap con ogni onda di contrazione. Nel pannello B frecce bianche illustrano un artefatto STmap generato da una regione dell&#39;immagine che non possono essere adeguatamente contrastata. Questo tipo di artefatto è in gran parte dovuto alle bolle intraluminali che ogni tanto si verificano nella preparazione durante il corso del protocollo sperimentale. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Mappatura spazio-temporale di motilità in<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Preparazioni di intestini

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

spatiotemporal-mapping-motility-ex-vivo-preparations

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

10.3K Views.  Virginia Commonwealth University. Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Video: Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the complex cellular and molecular of intestinal pathology. Although the tunica mucosa is often the organ of interest in many inflammatory diseases, recent works demonstrated that the muscularis externa (ME) is also a highly immunocompetent organ that harbours a dense network of resident immunocytes.1,2 These works were performed within the standardized model of intestinal manipulation (IM) that leads to inflammation of the bowel wall, mainly limited to the ME. Clinically this inflammation leads to prolonged intestinal dysmotility, known as postoperative ileus (POI) which is a frequent and unavoidable complication after abdominal surgery.3 The inflammation is characterized by liberation of proinflammatory mediators such as IL-64 or IL-1&beta; or inhibitory neurotransmitters like nitric oxide (NO).5 Subsequently, tremendous numbers of immunocytes extravasate into the ME, dominated by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes and finally maintain POI.2 Lasting for days, this intestinal paralysis leads to an increased risk of aspiration, bacterial translocation and infectious complications up to sepsis and multi organ failure and causes a high economic burden.6
In this manuscript we demonstrate the standardized model of IM and in vivo assessment of gastrointestinal transit (GIT) and colonic transit. Furthermore we demonstrate a method for separation of the ME from the tunica mucosa followed by immunological analysis, which is crucial to distinguish between the inflammatory responses in these both highly immunoactive bowel wall compartments. All analyses are easily transferable to any other research models, affecting gastrointestinal function.

Postoperative ileus (POI) is a complication of abdominal surgery leading to increased morbidity and a prolonged hospital stay. Because prophylactic or therapeutic strategies are lacking intensified research is necessary. Therefore we established a standardized and feasible mouse model to investigate the pathophysiology of POI and to study potential therapeutic options.

Valutazione funzionale della motilità intestinale e Wall infiammazione intestinale nei roditori: Analisi in un modello standardizzato di manipolazione intestinale

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Ricerca

Medicina

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Biologia dello sviluppo

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale tumori da Spinning Disk Microscopia confocale

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Immunologia e infezioni

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervoso enterico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Neuroscienze

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

Monitor motilità gastrointestinale (Gimm)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Biologia

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central nervous system. Changes in ENS function are a major cause of GI symptoms and disease and may contribute to GI symptoms reported in neuropsychiatric disorders including autism. It is well established that isolated colon segments generate spontaneous, rhythmic contractions known as Colonic Migrating Motor Complexes (CMMCs). A procedure to analyze the enteric neural regulation of CMMCs in ex vivo preparations of mouse colon is described. The colon is dissected from the animal and flushed to remove fecal content prior to being cannulated in an organ bath. Data is acquired via a video camera positioned above the organ bath and converted to high-resolution spatiotemporal maps via an in-house software package. Using this technique, baseline contractile patterns and pharmacological effects on ENS function in colon segments can be compared over 3-4 hr. In addition, propagation length and speed of CMMCs can be recorded as well as changes in gut diameter and contraction frequency. This technique is useful for characterizing gastrointestinal motility patterns in transgenic mouse models (and in other species including rat and guinea pig). In this way, pharmacologically induced changes in CMMCs are recorded in wild type mice and in the Neuroligin-3R451C mouse model of autism. Furthermore, this technique can be applied to other regions of the GI tract including the duodenum, jejunum and ileum and at different developmental ages in mice.

This article describes a video imaging technique and high-resolution spatiotemporal mapping to identify changes in the neural regulation of colonic motility in adult mice. Subtle effects on gastrointestinal (GI) function can be detected using this approach in isolated tissue preparations to advance our understanding of GI disease.

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Studying Murine Small Bowel Mechanosensing of Luminal Particulates

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion and absorption. For this reason, some of the motility patterns in the small bowel include segmentation for mixing of luminal contents and peristalsis for their propulsion. Physical properties of luminal contents modulate the patterns of small bowel motility. The mechanical stimulation of GI mechanosensory circuits by transiting luminal contents and underlying gut motility initiate and modulate complex GI motor patterns. Yet, the mechanosensory mechanisms that drive this process remain poorly understood. This is primarily due to a lack of tools to dissect how the small bowel handles materials of different physical properties. To study how the small bowel handles particulates of varying sizes, we have modified an established in vivo method to determine small bowel transit. We gavage live mice with fluorescent liquid or tiny fluorescent beads. After 30 minutes, we dissect out the bowels to image the distribution of fluorescent contents across the entirety of the GI tract. In addition to high-resolution measurements of the geometric center, we use variable size binning and spectral analysis to determine how different materials affect small bowel transit. We have explored how a recently discovered "gut touch" mechanism affects small bowel motility using this approach.

To study how the small bowel handles particulates of varying sizes, we have modified an established in vivo method to determine small bowel transit.

Studio del meccanorilevamento murino dell'intestino tenue del particolato luminale

Gastrointestinal (GI) motility is critical for normal digestion and absorption. In the small bowel, which absorbs nutrients, motility optimizes digestion ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Applicazioni di mappatura spazio-temporale e tecniche di analisi delle particelle per quantificare la segnalazione intracellulare Ca2 + In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo per lo studio della dinamica gastrointestinale e degli effetti dei farmaci sulla motilità

Using An In Vitro Tissue Perfusion System to Detect the Functional Activities of Isolated Intestinal Tubes in Real Time

Gastrointestinal diseases, which have a high incidence, pose considerable challenges for humans. The small intestine is integral to food and drug digestion and absorption and plays a crucial role in treating these diseases. The intestinal tube movement experiment, a common and essential in vitro method, is utilized to study gastrointestinal dynamics. This includes the preparation of the isolated intestinal tube, as well as the suspension of the prepared intestinal tube in the bath and its connection to a signal detector. This is followed by the recording and analysis of a series of parameters, such as tension, which can be used to assess intestinal motor function, as well as considerations for keeping the intestinal tube active in vitro. The standardized program from sampling to data collection greatly improves the repeatability of the experimental data and ensures the authenticity of the recording of intestinal tension after physiological, pathological, and drug intervention. Here we present the key problems in experimental operation and a valuable reference experimental protocol for studying drugs that regulate gastrointestinal motility.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Valutazione in vitro affidabile e riproducibile dell'impatto dei farmaci sui tubi intestinali di ratto

We present a method for isolating rat intestinal tubes and assessing the impact of drugs on their tension, frequency, and amplitude in vitro. This method offers a valuable approach for researchers investigating intestinal tubes.

Mappatura spazio-temporale di motilità in

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Valutazione funzionale della motilità intestinale e Wall infiammazione intestinale nei roditori: Analisi in un modello standardizzato di manipolazione intestinale

Il c. elegans intestino come un modello per intercellulare Lumen morfogenesi e biogenesi di membrana polarizzata In Vivo a livello di singola cellula: etichettatura da macchiatura dell'anticorpo, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

In tempo reale Imaging di cellule mieloidi Dynamics in

In Situ Ca ²⁺ Imaging del sistema nervoso enterico

Monitor motilità gastrointestinale (Gimm)

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

Studio del meccanorilevamento murino dell'intestino tenue del particolato luminale

Applicazioni di mappatura spazio-temporale e tecniche di analisi delle particelle per quantificare la segnalazione intracellulare Ca^{2 +} In Situ

Utilizzo di un sistema di perfusione tissutale in vitro per rilevare le attività funzionali dei tubi intestinali isolati in tempo reale