The author is grateful for the assistance of Mrs. Sharon Spana (University of Sydney) in rodent monitoring, handling and experimentation. The authorwould like to thank Prof. Jonathan Stone and Dr. Dan Johnstone for the assistance in the preparation of this manuscript. PhD funding support has been provided by University of Sydney and Australian Center for Excellence in Vision.

Affermazione Etica: Il protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell&#39;Università di Sydney, AEC # 5657. Anestesia è stato approvato dal comitato etico degli animali (Università di Sydney, AEC # 5657). 1. apparecchiature Preparazione <ol><li> Utilizzare in tempo reale il monitoraggio della temperatura della pelle. Accendere computer e hardware di acquisizione dati. </li><li> Software di registrazione della temperatura aperta e regolare impostazione temperatura tra 30-35 ° C e la frequenza di campionamento per ogni 100 msec. </li><li> Opzionale: Inserire termometro rettale per garantire la temperatura interna rimane stabile a 37,5 ° C. </li></ol> 2. Taratura del sfigmomanometro manuale <ol><li> Collegare neonatale bracciale a sphygmomanometer.Use un bracciale formato 2 per un 250-550 g topo. Un adattatore può essere necessario collegare il tubo del manicotto al sfigmomanometro. </li><li> Sgonfiare la cuffia da una allentando la valvola di sfiato o scollegare il tubo del bracciale dal adattarsio. Assicurarsi nessuna pressione rimane nel tubo e l&#39;ago del manometro poggia a zero all&#39;interno dell&#39;ovale / rettangolo. </li><li> Controllare la pressione tra tubi, manometro e bracciale. Gonfiare la cuffia con pompe dolci del bulbo inflazione fino a quando si legge 100 mmHg sul manometro. Assicurarsi che la pressione rimane costante. Sgonfiare il bracciale aprendo lentamente il valore di cessione d&#39;aria. </li></ol> 3. Preparazione degli animali Nota: Gli animali che devono subire lesioni luce richiede adattamento scuro la sera prima dell&#39;ischemia a distanza. Animali sottoposti a danno luce richiedono allevamento (luce 12 ore: Ciclo scuro (5 lux)) scuro <ol><li> Eseguire ischemia a distanza sia in roditori svegli o anestetizzati. Assicurarsi che gli animali hanno un tono muscolare sano. Garantire questo pizzicando dell&#39;arto posteriore superiore per confermare che vi sia adeguata presente muscolare. Protezione RIP indotto da lesioni luce è stato testato nei ratti sedentari fino a 6 mesi di età. </li><li> Preparazione anestetizzati per RIP <ol><li> Iniettare ratti con una iniezione intraperitoneale di 60 mg / kg di ketamina e 5 mg / kg xilazina. Controllare la profondità dell&#39;anestesia estendendo la gamba e pizzicando la pelle sulla parte inferiore del piede. L&#39;animale non ha riflesso se è profondamente anestetizzati. Applicare lacrime artificiali per evitare secchezza della cornea mentre sotto anestesia. </li><li> Posizionare ratti sia su un pad di calore o tubi di riscaldamento acqua circolante per mantenere una temperatura costante di 37,5 ° C corpo. Posizionare il topo in posizione prona con rilievi del piede degli arti inferiori verso l&#39;alto. Sia a destra oa sinistra arto possono essere sottoposti a ischemia a distanza. </li></ol></li><li> Preparazione Awake per RIP Nota: Awake sperimentazione animale sono necessarie due persone. Una persona trattiene l&#39;animale e la seconda persona gestisce il sfigmomanometro manuale. Gli sperimentatori devono essere sicuri per eseguire la procedura di ritenuta aumenta il rischio di lesioni per i gestori. I ratti sottoposti a ischemia a distanza devono essere condizionati to moderazione manuale. A seconda delle indicazioni intuitive moderazione manuale dovrebbe essere progresso da 30 secondi a un massimo di 5 minuti per un certo numero di settimane. Animali timidi che non riescono ad acclimatarsi a moderazione manuale dovrebbero essere esclusi dalla sperimentazione sveglio. Infine, moderazione manuale può causare lo stress (e potenzialmente introdurre confonde allo studio) per gli animali e una coorte finzione (il posizionamento del bracciale senza infiammazione) deve essere utilizzato per interpretare con precisione i risultati dello studio RIP. <ol><li> Tagliare un asciugamano in 15 cm x 30-50 cm pezzo e posizionare il bordo corto perpendicolarmente alla colonna vertebrale del ratto, che copre la testa verso l&#39;alto degli arti posteriori. </li><li> Tuck il lato corto sotto il torso del ratto strettamente e cominciare ad avvolgere il topo con il lato lungo rimanente asciugamano. Fissare l&#39;animale avvolto sotto il braccio in posizione supina. Se il ratto si svolge sotto il braccio sinistro, liberare arto destro del ratto dal telo. </li></ol></li></ol> 4. Applicazione of Sonda temperatura cutanea <ol><li> Estendere la gamba del ratto che deve subire ischemia e posizionare la sonda pelle sulla zampa. Posizionare la sonda pelle a massimizzare il contatto tra la sonda di temperatura e la pelle. Spingere la sonda nel zampa e apporre la sonda con nastro di carta. </li><li> Controllare la posizione della sonda pelle con il tracciamento della temperatura sul software di registrazione della temperatura. Assicurarsi che la temperatura della pelle è tra i 30-34 ° C e rimane stabile. Traccia la temperatura della pelle per 1-2 min. Regolare la sonda pelle se la temperatura è instabile o inferiore a 30 ° C. </li></ol> 5. Ischemia Remote <ol><li> Sgonfiare il bracciale e garantire la valvola dell&#39;aria viene chiusa. Estendere la gamba e vagamente circondare il bracciale sul arto posteriore superiore. Utilizzare l&#39;indice e pollice per estendere la gamba e le cifre inferiori per mantenere il bracciale in posizione allentata. </li><li> Aumentare pressione della cuffia dell&#39;animale anestetizzati a 160 mmHg, e in animali svegli increase la pressione del bracciale a 180 mmHg. Nota: La pressione sanguigna dei ratti anestetizzati varia 120-140 mmHg e sale a 160 mmHg se cosciente. Iniziare le registrazioni con il timer e temperatura del piede una volta raggiunta la pressione corretta. Nota: La temperatura piede dovrebbe cadere da 2 ° C dopo 5 min di pressione costante. </li><li> Mantenere la posizione del bracciale sopra &quot;ginocchio&quot; dell&#39;animale tutto il ischemia. La pressione del bracciale inizierà a cadere dopo pochi minuti, o se l&#39;arto del ratto è in movimento. </li><li> Pompare ripetutamente il bulbo di inflazione in brevi raffiche di mantenere la pressione del bracciale desiderata breve scoppio ripetuto di pompaggio </li><li> Ischemia remota può essere consegnato in continuo tra il 5 e 15 min. Il protocollo ischemia riperfusione comprende 2 periodi di 5 minuti ischemia con un intervento 5 min di riperfusione. </li><li> Sgonfiare la pressione del bracciale svitando la valvola dell&#39;aria. Controllare la variazione di temperatura nel corso della pro ischemiaprotocollo. Rilasciare il bracciale. </li><li> Continuare con la ferita sperimentazione. Animali sotto l&#39;effetto dell&#39;anestesia dovrà essere collocato su un pad termico. Continuare a monitorare gli animali fino ambulatoriale. Gli animali non possono essere restituiti alla casa fino a quando si cammina. </li></ol> 6. Luce Pregiudizio - Retina Degenerazione Modello <ol><li> Scuro adattare gli animali durante la notte (12-15 h). Subito dopo ischemia condizionata a distanza o ischemia remota sham (moderazione animale) posto animali in perspex alloggiamento con cibo e acqua. </li><li> Accendere lampade fluorescenti (1.000 lux) situato sopra Perspex abitazioni alle 9 del mattino per 24 ore. Dopo l&#39;esposizione alla luce, rispedire gli animali dim illuminazione ciclica per 7 giorni. </li></ol> Procedure Ischemia 7. Post-remote <ol><li> Valutazione Vision con Elettroretinogramma (ERG): Nota: Il ERG set-up e il protocollo del flash seguiti Brandli e Stone 26. <ol><li> Scuro adattare gli animali durante la notte (12-15 ore). Sottodim illuminazione rossa anestetizzare gli animali mediante iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina (60 mg / kg e 5 mg / kg, rispettivamente). Midriatico (solfato di atropina 1,0%), anestesia corneale (proximetacaina 0,5%). </li><li> Applicare l&#39;idratazione corneale (Carbomero polimero) collirio subito alla cornea. Applicare gel oftalmico ad intervalli di 20 min per mantenere l&#39;idratazione corneale. </li><li> Disegnare un filo vagamente legato intorno al bulbo oculare per aiutare le registrazioni stabili ERG. Temperature Monitor utilizzando una sonda rettale e mantenere la temperatura corporea dell&#39;animale a 37-37,5 ° C. </li><li> Posizionare la testa all&#39;interno di una sfera di integrazione Ganzfeld. Nota: Il Ganzfeld è uno stimolo leggero completamente programmabile che fornisce uniformi briciolo lampi da LED per l&#39;occhio. </li><li> Registrare il elettroretinogramma utilizzando 4 mm platino elettrodo positivo misura sfiorando cornea e un diametro Ag / AgCl elettrodo pellet 2 millimetri inserito in bocca. Riferimento entrambi gli elettrodi ad ago in acciaio inossidabileinserito per via sottocutanea in groppa. </li><li> Segnali di registrazione con gli impostazione passa-banda di 0.3-1,000 Hz (-3 dB), con un tasso di acquisizione 2 kHz (strumenti ad). Dopo una registrazione stabile ERG è stabilito soggetto l&#39;animale a un 10 minuti adattamento al buio prima di iniziare le registrazioni. </li><li> Seguire il protocollo flash come precedentemente descritto da Brandli e Stone 26. <ol><li> Programmare la durata del flash (abbiamo usato lampeggia 1-2 msec in durata), e impostare l&#39;intensità di -4.4 a 2.0 log scotto cd.sm -2. Utilizzare lampi (log 2.0 scotto cd.sm -2, 1 ms) per misurare la funzione retinica. In questo studio è il confronto tra il controllo, infortunio leggero e lesioni leggero con RIP. </li></ol></li></ol></li></ol> 8. TUNEL Assay <ol><li> Eutanasia animali mediante iniezione intraperitoneale di sovradosaggio fenobarbital (100 mg / kg). Enucleare gli occhi e fissare nel 4% paraformaldeide. </li><li> Lavare gli occhi in PBS prima cyroprotectingocchi notte in saccarosio al 30% (w / v). Incorpora gli occhi in OCT e tagliare in 20 sezioni micron sagittali con un criostato. </li><li> Eseguire il test TUNEL su sezioni retiniche con colorazione DAPI seguendo il protocollo di Maslim et al. 27 </li><li> Utilizzare la microscopia a fluorescenza per TUNEL conteggi della retina. Cellule TUNEL sono stati registrati dallo strato nucleare esterno (ONL); lo strato più esterno della retina, che contiene nuclei fotorecettori. In questo studio, i conteggi TUNEL stati effettuati in triplicato per ogni occhio, con 5 occhi per ciascun gruppo di trattamento. </li><li> Utilizzare ANOVA per gruppo statistico confrontare gli strumenti di controllo, lesioni luce, e del pregiudizio + RIP luce ratti. </li></ol>

The author has nothing to disclose.

Roditore ischemia degli arti posteriori è stata indotta con successo con uno sfigmomanometro manuale e cuff fornire neuroprotezione ai fotorecettori della retina. Un risultato in linea con ischemico condizionata indotto la protezione dei fotorecettori da un infortunio leggero 9,28. In sostanza, l&#39;ischemia a distanza provoca breve ossigeno privazione ai tessuti. Quindi, a distanza precondizionamento ischemico ha molte somiglianze con condizionata ischemica o tolleranza ischemi...

La sopravvivenza di più, forse tutti, i tessuti a fronte di stress metabolico può essere migliorata prima condizionata con un periodo di ischemia subletale 1,2. Precondizionamento ischemico (IP) in termini pratici è l&#39;esposizione del tessuto di ischemia subletali, prima che le esperienze tessuto stressanti più gravi, ad esempio un successivo insulto ischemico. In modelli animali, IP fornisce una protezione notevole al cervello, retina, cuore e polmoni 3-6. Di conseguenza, le osservazioni in pazienti colpiti da ictus hanno mostrato un legame tra precedenti attacchi ischemici transitori e migliori risultati clinici 7,8. IP protegge anche fotorecettori retinici di infortuni non ischemiche 9. L&#39;efficacia di IP in diversi tessuti e lesioni suggerisce che sta attivando un meccanismo innato della sopravvivenza cellulare presente in tutti i tessuti. Precondizionamento ischemica del miocardio è stato suggerito di avere effetti protettivi attraverso upregulationdell&#39;ipossia fattore inducibile (HIF), noto per regolare molte vie metaboliche attraverso il rilascio di adenosina o attraverso l&#39;apertura di canali del potassio ATP mitocondriale 10,11. Canali di rilascio di adenosina e ATP potassio sono implicati in ischemia cerebrale ma, le indagini sui meccanismi neuroprotettivi di condizionamento ischemico fino ad oggi si sono concentrati su modifiche anti-eccitotossicità, anti-apoptotici e anti-infiammatori percorsi 12,13. Nel complesso, la comprensione del processo molecolare di condizionamento ischemico per proteggere i neuroni è limitata. Remote tentativi ischemici precondizionamento per condizionare organi lontani criticamente importanti (cuore, cervello, polmoni) generando ischemia nei tessuti meno critiche. Precondizionamento ischemico remoto (RIP) utilizzando l&#39;arto posteriore è stato dimostrato di essere neuroprotettivi in modelli di roditori di ictus 14-17. Il metodo descritto da noi fornisce un prot semplice, affidabile e non invasivaocol per indurre RIP. La stragrande maggioranza dei protocolli RIP comporta dell&#39;arto posteriore, presumibilmente perché l&#39;arteria femorale trova nella arto posteriore superiore può essere facilmente individuabile ed accessibile per il bloccaggio chirurgici e applicazione del laccio. In arto invasiva studi ischemici per lo studio di cervello e protezione della pelle, ischemia viene indotta separando l&#39;arteria femorale dai legamenti all&#39;inguine e bloccaggio dell&#39;arteria femorale 2,15,18. L&#39;ischemia derivante sia cuffing arto o femorale serraggio è stata confermata dai cambiamenti al lembo compresa una perdita di impulso, diminuzione della ossigenazione e un calo della temperatura cutanea. Ischemia remota può essere confermata dalla perdita del polso utilizzando laser Doppler o ultrasuoni Doppler 17-19. La temperatura cutanea può essere utilizzata come alternativa al Doppler sebbene la relazione non è lineare 20,21. Registrazioni accurate di temperatura sono comuni in laboratori e lattinaessere facilmente incorporato in studi ischemiche remoti. Un&#39;alternativa alla femorale serraggio chirurgia è l&#39;induzione di ischemia utilizzando un laccio emostatico. Applicazione Tourniquet produce ischemia paragonabile a quella ottenuta con vaso di bloccaggio; Kutchner et al. rispetto invasiva arteria femorale di bloccaggio ad un laccio emostatico non invasiva e trovarono entrambi i metodi fermarono il flusso di sangue all&#39;arto e danni alla pelle ridotta in un modello di chirurgia plastica del lembo cutaneo ischemia 18. Ammanettamento o la gamba o il braccio e di aumentare la pressione del bracciale sopra la pressione sistolica è stato trovato per essere protettivo contro il danno ischemico nei suini e nell&#39;uomo 17,19,22. Diverso laccio emostatico approcci per indurre a distanza ischemico include l&#39;uso di un bracciale per la pressione arteriosa o una fascia elastica 17,22,23. Tuttavia, l&#39;uso di un elastico per indurre ischemia è un metodo sicuro, potenzialmente dando luogo a un importo non regolata di pressione nelarto, con aumenti pressione superiori a 500 mmHg in fase di registrazione negli esseri umani 24. Inoltre, ischemia utilizzando un elastico porta a danno muscolare nei ratti dopo la rimozione del gruppo 23, come valutato da Evans Blu Dye, un marcatore in vivo delle miofibre permeabilità 25. Al contrario, la consegna di una pressione controllata per il laccio può essere raggiunto utilizzando una pressione sanguigna bracciale collegato ad un 17,19,22,26 sfigmomanometro. In questo studio, un modello di lesione luce fotorecettori degenerazione è stato utilizzato per dimostrare l&#39;efficacia neuroprotettiva di distanza precondizionamento ischemico. Ischemia a distanza è stato indotto subito prima infortunio leggero, e ha impedito la successiva degenerazione dei fotorecettori, come confermato da test di funzionalità della retina. Il video che accompagna dimostrerà l&#39;applicazione di ischemia a distanza non invasivo.

<table><tbody><tr><td>Gold series DuraShock hand aneroid sphygmomanometer</td><td>Welch Allyn</td><td>DS56</td><td>Manual Sphygmomanometer</td></tr><tr><td>Neonate [size 2] 1 tube, 10 pack</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-102-1</td><td>Limb blood pressure cuff</td></tr><tr><td>Luer lock adaptor</td><td>Welch Allyn</td><td>5082-178</td><td>Adaptor for neonatal cuff</td></tr><tr><td>Thermistor pod</td><td>AD Instruments</td><td>ML 309</td><td>skin tempertature unit</td></tr><tr><td>Skin temperture probe</td><td>AD Instruments</td><td>MLT 422/A</td><td></td></tr><tr><td>Powerlab, 4 channel acquistion hardware</td><td>AD Instruments</td><td>PL 35044</td><td></td></tr><tr><td>Homeothermic blanket system with flexible probe</td><td>Harvard Appartus</td><td>507222F</td><td></td></tr><tr><td>Towel</td><td></td><td></td><td>optional: awake remote ischemia</td></tr><tr><td>Isoflo - 100% Isoflurane (250 ml)</td><td>Abbot Animal Health</td><td>05260-05</td><td>optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia</td></tr><tr><td>Ketamil - ketamine 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>optional: injectable anaesthetic remote ischemia</td></tr><tr><td>Xylium - Xylazine 100 mg/ml (50 ml)</td><td>Troy Laboratories Pty Ltd</td><td></td><td>optional: injectable anaesthetic remote ischemia</td></tr></tbody></table>

remote limb ischemic preconditioning:  a neuroprotective technique in rodents

Ischemia subletali protegge i tessuti contro successiva, ischemia più gravi attraverso la aumenta i meccanismi endogeni nel tessuto colpito. Ischemia subletali è stato anche dimostrato di upregulate meccanismi protettivi nei tessuti remoti. Un breve periodo di ischemia (5-10 minuti) nella arto posteriore dei mammiferi induce risposte auto-protettivo nel cervello, polmoni, cuore e retina. L&#39;effetto è noto come precondizionamento ischemico remota (RIP). E &#39;un modo terapeutico promettente per proteggere organi vitali, ed è già in fase di sperimentazione clinica per il cuore e il cervello lesioni. Questa pubblicazione illustra un metodo minimamente invasivo controllato di fare un arto - specificamente dell&#39;arto posteriore di un ratto - ischemico. Un sfigmomanometro sviluppato per l&#39;uso nei neonati umani è collegato ad un misuratore di pressione manuale e utilizzato per applicare pressione 160 mmHg attorno alla parte superiore degli arti posteriori. Una sonda progettato per rilevare la temperatura della pelle è utilizzato per verificare l&#39;ischemia, registrando il calo della temperatura della pelle causata da occlusione indotta pressione delle arterie delle gambe, e l&#39;aumento della temperatura che segue rilascio del bracciale. Questo metodo di RIP offre protezione alla retina topo contro i danni indotti luce brillante e degenerazione.

Un bracciale di pressione sanguigna elevata sopra 160 mmHg blocca il flusso di sangue al arto posteriore come si vede chiaramente nella figura 1B. La mancanza di ossigenazione dei tessuti determinato una riduzione temperatura del piede dell&#39;animale per un protocollo ischemia-riperfusione (Figura 2). La temperatura del piede (33 ° C) è stata inferiore a quella temperatura interna ed affidabile ridotta durante l&#39;elevazione pressione della cuffia (31 ° C), che sorge quando il br...

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Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Precondizionamento ischemico remoto (RIP) è un metodo di tessuti condizionamento contro lo stress dannoso. Abbiamo stabilito un metodo di ischemia telecomando verso l&#39;arto posteriore, gonfiando un bracciale sfigmomanometro per 5-10 min. Le capacità neuroprotettive del RIP sono stati dimostrati in un modello di degenerazione retinica nei roditori.

Arto Remote ischemica precondizionamento: una tecnica neuroprotettivo nei roditori

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

remote-limb-ischemic-preconditioning-neuroprotective-technique

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

11.0K Views.  University of Sydney.  Precondizionamento ischemico remoto (RIP) è un metodo di tessuti condizionamento contro lo stress dannoso. Abbiamo stabilito un metodo di ischemia telecomando verso l'arto posteriore, gonfiando un bracciale sfigmomanometro per 5-10 min. Le capacità neuroprotettive del RIP sono stati dimostrati in un modello di degenerazione retinica nei roditori. 

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Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by development of effective, easy to administer and safe preconditioning treatments. We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. Low-level pro-inflammatory mediator signaling changes over time are essential for cold-preconditioning neuroprotection. This signaling is consistent with the basic tenets of physiological conditioning hormesis, which require that irritative stimuli reach a threshold magnitude with sufficient time for adaptation to the stimuli for protection to become evident.
Accordingly, delineation of the immune signaling involved in cold-preconditioning neuroprotection requires that biological systems and experimental manipulations plus technical capacities are highly reproducible and sensitive. Our approach is to use hippocampal slice cultures as an in vitro model that closely reflects their in vivo counterparts with multi-synaptic neural networks influenced by mature and quiescent macroglia / microglia. This glial state is particularly important for microglia since they are the principal source of cytokines, which are operative in the femtomolar range. Also, slice cultures can be maintained in vitro for several weeks, which is sufficient time to evoke activating stimuli and assess adaptive responses. Finally, environmental conditions can be accurately controlled using slice cultures so that cytokine signaling of cold-preconditioning can be measured, mimicked, and modulated to dissect the critical node aspects. Cytokine signaling system analyses require the use of sensitive and reproducible multiplexed techniques. We use quantitative PCR for TNF-&alpha; to screen for microglial activation followed by quantitative real-time qPCR array screening to assess tissue-wide cytokine changes. The latter is a most sensitive and reproducible means to measure multiple cytokine system signaling changes simultaneously. Significant changes are confirmed with targeted qPCR and then protein detection. We probe for tissue-based cytokine protein changes using multiplexed microsphere flow cytometric assays using Luminex technology. Cell-specific cytokine production is determined with double-label immunohistochemistry. Taken together, this brain tissue preparation and style of use, coupled to the suggested investigative strategies, may be an optimal approach for identifying potential targets for the development of novel therapeutics that could mimic the advantages of cold-preconditioning.

We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. We present strategies for such work that require biological systems, experimental manipulations plus technical capacities that are highly reproducible and sensitive.

Strategie per lo Studio delle Neuroprotezione dal freddo precondizionamento

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by ...

Ricerca

Neuroscienze

Bilateral Common Carotid Artery Occlusion as an Adequate Preconditioning Stimulus to Induce Early Ischemic Tolerance to Focal Cerebral Ischemia

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We have established bilateral common carotid artery occlusion as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance to transient focal cerebral ischemia in C57Bl6/J mice. In this video, we will demonstrate the methodology used for this study.

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning (PC) &#x2013; a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a subsequent damaging ischemic insult. We established bilateral common carotid artery occlusion (BCCAO) as a preconditioning stimulus to induce early ischemic tolerance (IT) to transient focal cerebral ischemia (induced by middle cerebral artery occlusion, MCAO) in C57Bl6/J mice.

Bilaterale occlusione comune Arteria carotide come uno stimolo precondizionamento in grado di indurre tolleranza ischemica precoce di focale Ischemia Cerebrale

There is accumulating evidence, that ischemic preconditioning - a non-damaging ischemic challenge to the brain - confers a transient protection to a ...

Medicina

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide. Medical therapies for symptomatic relief are limited. Surgical or endovascular interventions are useful for some individuals, but long-term results are often disappointing. As a result, there is a need for developing new therapies to treat PAD. The murine hindlimb ischemia preparation is a model of PAD, and is useful for testing new therapies. When compared to other models of tissue ischemia such as coronary or cerebral artery ligation, femoral artery ligation provides for a simpler model of ischemic tissue. Other advantages of this model are the ease of access to the femoral artery and low mortality rate. 
In this video, we demonstrate the methodology for the murine model of unilateral hindimb ischemia. The specific materials and procedures for creating and evaluating the model will be described, including the assessment of limb perfusion by laser Doppler imaging. This protocol can also be utilized for the transplantation and non-invasive tracking of cells, which is demonstrated by Huang et al.1.

Murine Model of Hindlimb Ischemia

The surgical procedure for induction of unilateral hindlimb ischemia is demonstrated, with confirmation of ischemia by laser Doppler perfusion imaging.

Modello murino di ischemia degli arti posteriori

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Biologia

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

Background 
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered advancements to decrease the occurrence this injury.&#160;The current model demonstrates reproducible lower&#160;extremity paralysis following thoracic aortic occlusion.
Methods 
Adult male C57BL6 mice were anesthetized with isoflurane. Through a cervicosternal incision the aorta was exposed. The descending thoracic aorta and left subclavian arteries were identified without entrance into pleural space. Skeletonization of these arteries was followed by immediate closure (Sham) or occlusion for 4 min (moderate ischemia) or 8 min (prolonged ischemia). The sternotomy and skin were closed and the mouse was transferred to warming bed for recovery.&#160; Following recovery, functional analysis was obtained at 12 hr intervals until 48 hr.
Results 
Mice that underwent sham surgery showed no observable hind&#160;limb deficit. Mice subjected to moderate ischemia for 4 min had minimal functional deficit at 12 hr followed by progression to complete paralysis at 48 hr. Mice subjected to prolonged ischemia had an immediate paralysis with no observable hind-limb movement at any point in the postoperative period. There was no observed intraoperative or post&#160;operative mortality.
Conclusion 
Reproducible lower extremity paralysis whether immediate or delayed can be achieved in a murine model. Additionally, by using a median sternotomy and careful dissection, high survival rates, and reproducibility can be achieved.

The lack of mechanistic understanding of spinal cord ischemia-reperfusion injury has hindered further adjuncts to prevent paraplegia following high risk aortic operations. Thus, the development of animal models is imperative. This manuscript demonstrates reproducible lower extremity paralysis following thoracic aortic occlusion in a murine model.

Riproducibile Paraplegia da Toracica aortica occlusione in un modello murino di Spinal Cord ischemia-riperfusione

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the retina. The ERG is a sensitive measure of changes in retinal function that are pan-retinal, but is less effective for detecting damage confined to a small area of retina. In the present work we describe how to record the &#8216;flash&#8217; ERG, which is the potential generated when the retina is exposed to a brief light flash. We describe methods of anaesthesia, mydriasis and corneal management during recording; how to keep the retina dark adapted; electrode materials and placement; the range and calibration of stimulus energy; recording parameters and the extraction of data. We also describe a method of inducing ischemia in one limb, and how to use the ERG to assess the effects of this remote-from-the-retina ischemia on retinal function after light damage. A two-flash protocol is described which allows isolation of the cone-driven component of the dark-adapted ERG, and thereby the separation of the rod and cone components. Because it can be recorded with techniques that are minimally invasive, the ERG has been widely used in studies of the physiology, pharmacology and toxicology of the retina. We describe one example of this usefulness, in which the ERG is used to assess the function of the light-damaged retina, with and without a neuroprotective intervention; preconditioning by remote ischemia.

The electroretinogram (ERG) is an electrical potential generated by the retina in response to light. This paper describes how to use the ERG to assess retinal function, in dark-adapted rats, and how it can be can be used to assess a neuroprotective intervention, in the present case remote ischemic preconditioning.

Utilizzando il Elettroretinogramma per valutare la funzione in roditori Retina e gli effetti protettivi del Remote Limb ischemico precondizionamento

The ERG is the sum of all retinal activity. The ERG is usually recorded from the cornea, which acts as an antenna that collects and sums signals from the ...

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

Quantificazione della Protezione Neurovascular seguito ripetitivo ipossico precondizionamento e transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media nei topi

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for myocardial infarction and cardiac complications of thoracic surgery. The ability of certain drugs to precondition the myocardium against ischemia reperfusion injury has led to multiple clinical trials, with little success. The isolated heart model allows acute observation of the functional effects of ischemia reperfusion injury in real time, including the effects of various pharmacological interventions administered at any time-point before or within the ischemia-reperfusion injury window. Since brief periods of ischemia can precondition the heart against ischemic injury, in situ aortic cannulation is performed to allow for functional assessment of non-preconditioned myocardium. A saline filled balloon is placed into the left ventricle to allow for real-time measurement of pressure generation. Ischemic injury is simulated by the cessation of perfusion buffer flow, followed by reperfusion. The duration of both ischemia and reperfusion can be modulated to examine biochemical events at any given time-point. Although the Langendorff isolated heart model does not allow for the consideration of systemic events affecting ischemia and reperfusion, it is an excellent model for the examination of acute functional and biochemical events within the window of ischemia reperfusion injury as well as the effect of pharmacological intervention on cardiac pre- and postconditioning. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform in situ aortic cannulation and heart excision followed by ischemia/reperfusion injury in the Langendorff model.

The isolated rat heart is an enduring model for ischemia reperfusion injury. Here, we describe the process of harvesting the beating heart from a rat via in situ aortic cannulation, Langendorff perfusion of the heart, simulated ischemia-reperfusion injury, and infarct staining to confirm the extent of ischemic insult.

Induzione e valutazione di ischemia-riperfusione Injury in Langendorff-perfusi Hearts Rat

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably reproduce the human disease are necessary to develop new therapies for this disease. The mouse hindlimb ischemia model has been widely used for this purpose, but the standard practice of inducing acute limb ischemia by ligation of the femoral artery can result in substantial tissue necrosis, compromising investigators&#39; ability to study the vascular and skeletal muscle tissue responses to ischemia. An alternative approach to femoral artery ligation is the induction of gradual femoral artery occlusion through the use of ameroid constrictors. When placed around the femoral artery in the same or different locations as the sites of femoral artery ligation, these devices occlude the artery over 1 - 3 days, resulting in more gradual, subacute ischemia. This results in less substantial skeletal muscle tissue necrosis, which may more closely mimic the responses seen in human PAD. Because genetic background influences outcomes in both the acute and subacute ischemia models, consideration of the mouse strain being studied is important in choosing the best model. This paper describes the proper procedure and anatomical placement of ligatures or ameroid constrictors on the mouse femoral artery to induce subacute or acute hindlimb ischemia in the mouse.

Surgical induction of hindlimb ischemia in the mouse is useful to examine angiogenesis, however this is compromised in certain inbred mouse strains that display marked ischemia-induced tissue necrosis. Methods are described to induce subacute limb ischemia using ameroid constrictors to circumvent this problem through the induction of gradual arterial occlusion.

Metodi di acuta e subacuta murino arti posteriori ischemia

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura dei neuroni del midollo spinale da topi neonatali

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Experimental Models to Study the Neuroprotection of Acidic Postconditioning Against Cerebral Ischemia

Stroke is one of the leading causes of mortality and disability worldwide, with limited therapeutic approaches. As an endogenous strategy for neuroprotection, postconditioning treatments have proven to be promising therapies against cerebral ischemia. However, complicated procedures and potential safety issues limit their clinical application. To overcome these disadvantages, we have developed acidic postconditioning (APC) as a therapy for experimental focal cerebral ischemia. APC refers to the mild acidosis treatment by inhaling CO2 during reperfusion following ischemia. Here we present two models to execute APC in vitro and in vivo, respectively. The oxygen-glucose deprivation (OGD) treatment of mice and the corticostriatal occlusion and middle cerebral artery occlusion (MCAO) of mice were employed to mimic cerebral ischemia. APC can be simply achieved by transferring brain slices to acidic buffer bubbled with 20% CO2, or by mice inhaling 20% CO2. APC showed significant protective effects against cerebral ischemia, as reflected by tissue viability and brain infarct volume.

Acidic postconditioning protects against cerebral ischemia. Here we present two models to execute APC. They are achieved respectively by transferring corticostriatal slices to acidic buffer after oxygen-glucose deprivation in vitro and by inhaling 20% CO2 after middle cerebral artery occlusion in vivo.

Arto Remote ischemica precondizionamento: una tecnica neuroprotettivo nei roditori

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