Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health di Grant R01 AI088209 (a KAH). Ringraziamo anche l&#39;Università del Minnesota Citometria a flusso di risorse.

In questo studio, adulto - sono stati utilizzati (6 8 settimane) femmina C57Bl / 6 topi. I topi sono stati acquistati dal National Cancer Institute e mantenuti in particolari condizioni di libero patogeni. L&#39;Università del Minnesota Istituzionale Cura e uso Comitato degli animali (IACUC) ha approvato tutti sperimentazione animale. 1 Preparazione degli strumenti e tamponi <ol><li> Preparare la soluzione enzimatica (media RPMI1640 con il 0,05% [w / v] di Liberase TH e 100 U / ml di DNasi I), tampone ricchi di albumina (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -free] con 0,5% di siero bovino albumina e 2 mM acido Etilendiammina tetraacetico [EDTA]), tampone di FACS (1X PBS [Ca 2 + / Mg 2 + -free] siero fetale bovino 1% contenente [FBS] e il 0,02% NaN 3), FACS ordinamento tampone (PBS 1X [Ca 2 + / Mg 2 + -free] contenente il 2% FBS), e media RP10 (media RPMI-1640 fornito con 10% FBS). </li><li> Preparare 10 piatti panning. Preparare la soluzione di rivestimento 40 ml (0,01 mg / ml Gavena contro Rat-IgG in 0.1 M NaHCO3 Buffer), e aggiungere 4 ml di soluzione di rivestimento in ciascuna 100 x 15 mm piastra, turbolenza e incubare a 4 ° CO / N. Eliminare la soluzione di anticorpi e lavare la piastra con 5 ml di PBS 1x per 2 volte, agitare vigorosamente tra risciacqui. Conservare le piastre preparate a 4 ° C. </li></ol> 2 Raccolta di Timo Tissue <ol><li> Euthanize del mouse in una camera di CO 2. Mettere l&#39;animale sulla schiena su una stuoia di dissezione, appuntare i piedi sul tappetino e bagnare la pelliccia a spruzzo con il 70% di etanolo. </li><li> Eseguire un&#39;incisione mediana attraverso la pelle, partendo da sopra l&#39;apertura uretrale dritto fino alla mascella inferiore con le forbici ed estendere l&#39;incisione verso il basso per le ginocchia su entrambi i lati. L&#39;incisione sembra un testa in giù &quot;Y&quot;. Tirare la pelle flaccida indietro sui lati, e il pin al tappeto dissezione. </li><li> Forare la membrana dalla xifoide, tagliare le costole su entrambi i lati fino a circa la clavicola, quindi sollevare le costole conpinza e il pin al tappeto dissezione. Il timo è appena sotto le costole, e si presenta come due lobi bianchi sottili sovrapposti cuore (Figura 1). Tessuto connettivo che circonda Scollegare il timo, tirare delicatamente e rimuovere la coppia di lobi del timo con pinze dentellate curve. Lobi Luogo timo in una piastra da 6 pozzetti contenenti 5 ml di RPMI-1640. </li></ol> 3 Preparazione di cellule stromali timica <ol><li> Tagliare qualsiasi tessuto adiposo e connettivo circostante e trasferire i lobi del timo ad un nuovo pozzo della piastra 6 pozzetti contenenti 5 ml di fresco preparano soluzione enzimatica. Fare piccole incisioni nei lobi del timo con le forbici sottili, e incubare la piastra a 37 ° C per 20 min. </li><li> Pipettare delicatamente digerire il tessuto del timo su e giù 2 - 3 volte con 5 ml pipetta per la dissociazione dei tessuti. Raccogliere il surnatante in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di tampone ricchi di albumina freddo per neutralizzare gli enzimi. Tenere il tubo di raccolta sul ghiaccio. Aggiungere 2.5soluzione enzimatica ml al tessuto rimanente e incubare la piastra a 37 ° C per 15 min. </li><li> Eseguire agitazione meccanica con una siringa da 3 ml e ago da 18 G per rompere gli aggregati. Pool surnatante nel tubo di raccolta. Aggiungere 2,5 ml della soluzione enzimatica al tessuto rimanente e incubare la piastra a 37 ° C per 15 min. </li><li> Ripetere agitazione meccanica con una siringa da 3 ml e un ago da 25 G, e incubare la piastra supplementare di 5 - 10 min. </li><li> Dopo aver completato la digestione, piscina il surnatante nel tubo di raccolta. Centrifugare la provetta di prelievo a 400 xg, a 4 ° C per 8 minuti per raccogliere le cellule. Aspirare il liquido e sospendere le cellule pellet in 10 ml di tampone ricchi di albumina e filtrare il campione attraverso maglie di mm 100. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Quindi eseguire il flusso cytometic analisi (sezione 4) o TEC arricchimento (sezione 5). </li></ol> 4 Identificazione delle TEC da Citometria a flusso </p&gt; <ol><li> Preparare le cellule ad una concentrazione finale di 4 x 10 6 cellule per 100 microlitri di buffer di FACS per la colorazione in una piastra di prova ben a fondo rotondo da 96 e tenere la piastra su ghiaccio. Aggiungere 20 microlitri soluzione di blocco Fc (anti-CD16 / CD32 anticorpo a 10 mg / ml in tampone per FACS) alle cellule e incubare le cellule per 10 minuti in ghiaccio. Gira la piastra a 400 xg, a 4 ° C per 3 min. Eliminare il liquido dai pozzi muovendo la faccia piastra giù in un lavandino. </li><li> Sospendere le cellule pellet in 100 ml di cocktail di anticorpi (anti-CD45, -EpCAM, classe -MHC II, e -Ly51 anticorpi, e la UEA-1 lectina marcato con fluorocromi diversi a produttori raccomandati o testato concentrazioni ottimali di ciascun anticorpo in tampone FACS ), e incubare le cellule in ghiaccio per 20 minuti al buio. Per compensazione, macchiare 1 x 10 6 cellule con ogni singolo fluorocromo. </li><li> Aggiungere 100 ml di tampone FACS a ciascun bene e far girare la piastra a 400 xg, a 4 ° C per 3 min. Ripetere una fase di lavaggiotempo, e poi risospendere le cellule in 100 microlitri di buffer FACS. Trasferire le cellule di un fondo rotondo tubo FACS 12 x 15 mm riempita con 300 ml FACS buffer. Acquisire campioni sul citofluorimetro e analizzare i dati utilizzando il software di analisi FACS. Strategia di gating TEC è mostrato nella Figura 2. </li></ol> 5. Arricchimento della TEC da Panoramica <ol><li> Centrifugare le cellule del timo (preparati nella Sezione 3) a 400 xg, a 4 ° C per 5 min. Aspirare il liquido e sospendere le cellule pellet nel tampone FACS ordinamento ad una concentrazione di 2 x 10 8 cellule per ml in una provetta conica da 15 ml o 50 ml. Aggiungere anticorpo anti-CD90.2 (clone H12-30) (o anti-CD45) ad una concentrazione finale di 2,5 mg / ml di sospensione cellulare e incubare le cellule delicatamente su un agitatore rotante a 4 ° C per 30 min. Dopo l&#39;incubazione, lavare con un 5 - 10 volte il volume di RP10 medie e centrifugare la provetta a 400 xg, a 4 ° C per 5 min. </li><li> Aspirare il liquido e risospendere le cellule in pelletMezzo RP10 ad una concentrazione di 1 x 10 7 per ml. Aggiungere 5 ml di sospensione cellulare per ogni piastra rivestita panning (preparata al punto 1.3), turbolenza e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Agitare vigorosamente; trasferire il surnatante in una provetta conica. Sciacquare la piastra due volte utilizzando medie RP10 e piscina surnatanti nel tubo di raccolta. </li><li> Centrifugare la provetta di raccolta a 400 xg, a 4 ° C per 5 min. Aspirare il liquido e risospendere le cellule pellet in 5 ml di mezzo RP10. Aggiungere la sospensione cellulare di una nuova piastra panning, agitare ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Raccogliere le cellule lavare il piatto e piscina in un tubo conico. Una volta TEC sono arricchiti, centrifugare le cellule a 400 xg, a 4 ° C per 5 minuti e sospendere le cellule in 5 ml FACS buffer di smistamento. </li></ol> 6. Purificazione di TEC di classificare cellulare <ol><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare sospensione cellulare ad una concentrazione di 4 x 10 7 cellule in tampone FACS ordinamento. Aggiungi anticorpi desCribed nella Sezione 4.4 nella soluzione di cellule e incubare le cellule delicatamente su un agitatore rotante a 4 ° C per 30 min. Dopo la colorazione, lavare e sospendere le cellule ad una concentrazione di 10 x 10 6 cellule per ml di tampone FACS ordinamento. </li><li> Ordina sottoinsiemi TEC attraverso un ugello 100 micron utilizzando la fluorescenza attivato l&#39;ordinamento delle cellule. Cella ordine sono raccolti in 30% (v / v) di FBS in RPMI-1640). Una volta che l&#39;ordinamento delle cellule è fatto, le cellule centrifugare a 400 xg, a 4 ° C per 5 minuti e prepararsi per l&#39;analisi a valle. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Nel protocollo, punti critici sono la preparazione di cellule stromali del timo (sezione 3) e l&#39;arricchimento di TEC (sezione 4). Si raccomanda vivamente che la soluzione enzimatica fresca viene preparata ogni volta e il tessuto viene trattato il più presto possibile. Per thymi studiata, ottimizzando il volume della soluzione enzimatica è richiesta a seconda del numero di thymi. Se eventuali residui di tessuto viene lasciato dopo l&#39;elaborazione, aggiungendo più soluzione enzimatica e l&#39;estensione del temp...

All&#39;inizio lo sviluppo delle cellule T, midollo osseo di cellule staminali ematopoietiche derivate da progenitori multipotenti sono reclutati alla corteccia del timo, sottoposto impegno a T lignaggio e diventare precursori delle cellule T 1. Nella corteccia, precursori delle cellule T CD4 e CD8 doppio negativi (DN) timociti espandersi e differenziarsi in immaturo CD4 e CD8 doppio positivi (DP) timociti, formando una grande piscina di progenitori ai ricettori cellulari altamente variabile T 1. Solo una select sottoinsieme MHC-ristretto di cellule DP diventerà singolo positivi (SP) timociti CD4 o CD8, migrare verso il midollo del timo, e differenziarsi in cellule funzionalmente competenti T maturi, un evento che si riferisce alla selezione come positivo 2 6. Al contrario, cloni di timociti auto-reattivi sottoposti a selezione negativa e vengono rimossi tramite apoptosi, convertito in cellule T regolatorie per l&#39;auto-tolleranza, o deviato verso linfociti intraepiteliali per scopi che non sono ancora chiare 3,7-10. Nel timo, cellule stromali del timo formano un microambiente unico che fornisce segnali per questi diversi destini di sviluppo delle cellule T 5,11,12. Cellule stromali del timo sono composti da cellule epiteliali timiche (TEC) - tra cui TEC corticali (CTEC) e TEC midollari (mTECs), cellule dendritiche, macrofagi, fibroblasti, cellule endoteliali, periciti derivati ​​dalla cresta neurale e di altre cellule mesenchimali 13-15. Tra questi, TEC sono cruciali nelle varie fasi di sviluppo delle cellule T 1,2,16,17. Tuttavia, la mancanza di un modo affidabile per isolare TEC ha impedito una comprensione globale delle loro funzioni 16. In particolare, CTEC, che formano una rete tridimensionale progenitori nella corteccia circostante, sono essenziali per la selezione positiva 13,18,19, per ragioni che non sono ancora chiare. Studi precedenti fornito indizi utili a capire l&#39;eterogeneità e il ruolo di TEC, per lo più basandosi su strumenti morfologici e istologici 13 </sup&gt;. Recentemente i ruoli unici di sottoinsiemi TEC sono state affrontate con approcci genetici in modelli murini 12,20. Un modo affidabile e riproducibile per isolare TEC è fondamentale per raggiungere la caratterizzazione imparziale di sottoinsiemi TEC, valutazione quantitativa e qualitativa delle funzioni TEC, e chiarimento dei meccanismi come CTEC supportano la selezione positiva. A causa della rarità della TEC in timo e le interazioni strette formano nell&#39;organo intatto, l&#39;isolamento di TEC è stato impegnativo. Il protocollo qui descritto è basato sulle scoperte precedenti, attualmente reagenti disponibili, le tecniche e la conoscenza della struttura del timo e della composizione stromale. Quasi due decenni fa, sono stati segnalati diverse procedure di disaggregare i tessuti timo 21-27, in cui i diversi enzimi sono stati usati durante la digestione, tra cui tripsina, Collagenase e dispasi. Grigio et al. comparano questi enzimi nella loro precedure 28, e ha registrato un miglioramento method una digestione più fasi di cocktail di enzimi 29 che si sono resi ampiamente utilizzato 20,30. Tuttavia, questo metodo richiede un lungo tempo di preparazione e mineralizzazione complessi e risultati in variabile finale numero di cellule e proporzioni di TEC anche nella stessa coorte murino 29,30. Diversi anni fa, Liberase grado di ricerca enzima, contenenti altamente purificato Collagenase e proteasi neutra cominciò ad essere utilizzato nel tessuto del timo dissociazione 30. Qui, descriviamo un protocollo basato digestione Liberase, con procedure di separazione meccanica ottimizzate, che produce un elevato numero di TEC vitali dai tessuti del mouse timo. . Per arricchire cellule stromali dissociate, studi precedenti hanno utilizzato sia gradienti di densità o di separazione tallone magnetica 21,29. Tuttavia, entrambi i metodi causano grave perdita di alcune popolazioni di cellule stromali del timo, in particolare la popolazione di CTEC 29. Eliminazione citotossici e tecniche di panning <sup&gt; 31,32 sono stati ampiamente utilizzati per esaurimento o separazione dei linfociti nel campo immunologica 12,31. Dopo il confronto di queste tecniche, abbiamo stabilito il protocollo panning attuale per l&#39;arricchimento della TEC. La condizione delicata durante la procedura di arricchimento porta a meno morte cellulare e imparziale e maggiore recupero TEC. La sospensione di cellule isolate timo descritto nella Sezione 3 può essere applicato direttamente alle analisi citofluorimetrica per l&#39;identificazione e la caratterizzazione dei sottoinsiemi TEC e cellule dendritiche. Sezione 4 descrive un modo semplice e utile per identificare sottoinsiemi TEC utilizzando il flusso multiparametrica citometro. Per gli esperimenti che cercano di ottenere CTEC purificate o mTECs, TEC arricchimento e cell sorting procedure può essere trovato nella sezione 5 e 6.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse EpCAM</td><td>eBioscience</td><td>XX-5791-YY*</td><td>Clone G8.8</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC II</td><td>eBioscience</td><td>XX-5321-YY*</td><td>Clone M5/114.15.2</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly51</td><td>eBioscience</td><td>XX-5891-YY*</td><td>Clone 6C3</td></tr><tr><td>UEA-1</td><td>Vector Laboratory</td><td>FL-1061</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Flow cell sorter</td><td>BD Biosciences&amp;nbsp;</td><td>FACSAria</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry analysis software</td><td>TreeStar - Flowjo</td><td>FlowJo v7/9</td><td></td></tr><tr><td>*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells

Il timo è un organo vitale per lo sviluppo dei linfociti T. Di cellule stromali del timo, le cellule epiteliali timiche (TEC) sono particolarmente cruciali in più stadi di sviluppo delle cellule T: l&#39;impegno delle cellule T, selezione positiva e selezione negativa. Tuttavia, la funzione del TEC nel timo rimane completamente compresa. Nell&#39;articolo, mettiamo a disposizione un metodo per isolare sottoinsiemi TEC da topo fresco timo utilizzando una combinazione di perturbazione meccanica e digestione enzimatica. Il metodo permette di cellule stromali timiche e timociti per essere efficacemente rilasciato dalla cellula-cellula e connessioni cellula-matrice e per formare una cella singola sospensione. Usando le cellule isolate, citometria a flusso multiparametrica può essere applicato alla identificazione e caratterizzazione di TEC e cellule dendritiche. Perché TEC sono una rara popolazione di cellule nel timo, anche noi descriviamo un modo efficace per arricchire e purificare TEC mediante deplezione timociti, il tipo cellulare più abbondante nel timo. Folloala l&#39;arricchimento, cell sorting tempo può essere ridotto in modo che la perdita di vitalità cellulare può essere minimizzato durante la purificazione della TEC. Cellule purificate sono adatti per varie analisi a valle come Real Time-PCR, Western blot e profilo di espressione genica. Il protocollo promuoverà la ricerca della funzione TCE e così come lo sviluppo di ricostituzione in vitro di cellule T.

Usando questo protocollo, un organo del timo è stato rimosso da un topo adulto (sezione 2) e una sospensione di cellule del timo è stata preparata come descritto nella Sezione 3 La sospensione cellulare ottenuta consisteva di timociti, cellule stromali ematopoietiche derivate da cellule stromali e non-ematopoietiche. CD45 è una ematopoietiche pan-marcatore espresso su entrambi i timociti e cellule stromali ematopoietiche come i macrofagi e le cellule dendritiche. Al contrario, TEC non sono di origine emopoietica e no...

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Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Qui si descrive un metodo efficace per l&#39;isolamento, l&#39;identificazione e la purificazione delle cellule epiteliali del timo topo (TEC). Il protocollo può essere utilizzato per gli studi di funzione del timo per il normale sviluppo delle cellule T, la disfunzione del timo, e la ricostituzione delle cellule T.

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

isolation-identification-purification-murine-thymic-epithelial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.0K Views.  University of Minnesota.  Qui si descrive un metodo efficace per l'isolamento, l'identificazione e la purificazione delle cellule epiteliali del timo topo (TEC). Il protocollo può essere utilizzato per gli studi di funzione del timo per il normale sviluppo delle cellule T, la disfunzione del timo, e la ricostituzione delle cellule T. 

Video: Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell&#39;embrione mouse Uso<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Saggi

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several organisms including humans, non-human primates, rat and, as we describe here, mice. Magnetic bead-based cell separation allows for either positive selection (or cell depletion) as well as negative selection. Here, we demonstrate negative selection of untouched or na ve CD4+ helper T cells. Using this standard protocol we typically purify cells that are &#8805; 96% pure CD4+/CD3+. This protocol is used in conjunction with the protocol Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice published in issue 7 of JoVE, for purification of T cells and other cell types to adoptively transfer for imaging purposes. Although we did not demonstrate FACS analysis in this protocol video, it is highly recommended to check the overall purity of isolated cells using the appropriate antibodies via FACS. In addition, we demonstrate the non-sterile method of T cell isolation. If sterile cells are needed for your particular end-user application, be sure to do all of the demonstrated procedures in the tissue culture hood under standard sterile conditions. Thank you for watching and good luck with your own experiments!

Isolation of lymphocytes using the Miltenyi MACs kit is a reliable way to purify cells from whole lymphoid tissue homogenates. Cells purified using the Miltenyi system are typically &#8805; 96% pure. Here, we demonstrate the steps taken to isolate CD4+ T cells, one of the many kits offered by Miltenyi.

Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biologia

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Immunologia e infezioni

Isolation and Transplantation of Different Aged Murine Thymic Grafts.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and selection of T cells specific for self and foreign antigens. The approach entails implantation of thymic grafts derived from various aged mice into immunodeficient scid recipients. Over a relatively short period of time the recipients are fully reconstituted with T cells derived from the implanted thymus graft. Only thymocytes seeding the thymus at the time of isolation undergo selection and develop into mature T cells. As such, changes in the nature and specificity of the engrafted T cells as a function of age-dependent thymic events can be assessed. Although technical expertise is required for successful thymic transplantation, this method provides a unique strategy to study in vivo a wide range of pathologies that are due to or a result of aberrant thymic function and/or homeostasis.

This report provides a detailed description of transplanting murine thymi from different aged donor mice under the kidney capsule of immunodeficient mouse recipients. The goal of this approach is to model T cell development and thymic selection events in vivo.

Isolamento e Trapianto di diversi invecchiato murini del timo innesti.

The mechanisms that regulate the efficacy of thymic selection remain ill-defined. The method presented here allows in vivo analyses of the development and ...

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

La promozione 3-D di aggregazione delle cellule FACS purificata timica epiteliali con EAK 16-II / EAKIIH6 autoassemblanti idrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

Isolation and Activation of Murine Lymphocytes

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading pathogen1,2. Understandably, such intricate abilities are controlled by a large number of molecules involved in various cellular processes to ensure timely and spatially regulated immune responses3. Here, we describe experimental procedures that allow rapid isolation of highly purified murine lymphocytes using magnetic cell sorting technology. The resulting purified lymphocytes can then be subjected to various in vitro or in vivo functional assays, such as the determination of lymphocyte signaling capacity upon stimulation by immunoblotting4 and the investigation of proliferative abilities by 3H-thymidine incorporation or carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) labeling5-7. In addition to comparing the functional capacities of control and genetically modified lymphocytes, we can also determine the T cell stimulatory capacity of antigen-presenting cells (APCs) in vivo, as shown in our representative results using transplanted CFSE-labeled OT-I T cells.

Lymphocytes are the major players in adaptive immune responses. Here, we present a lymphocyte purification protocol to determine the physiological functions of the desired molecules in lymphocyte activation in vitro and in vivo. The described experimental procedures are suitable for comparing functional capacities between control and genetically modified lymphocytes.

L&#39;isolamento e l&#39;attivazione di linfociti murini

B and T cells, with their extremely diverse antigen-receptor repertoires, have the ability to mount specific immune responses against almost any invading ...

Ottimizzazione dell'isolamento delle cellule stromali dal timo e dal midollo osseo

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca ematopoietica utilizzando l'isolamento delle cellule stromali per il sequenziamento di singole cellule

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Preparing Mouse Thymic Epithelial Cells for Analysis of Intracellular Molecules

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the thymic cortex induce early T cell development and positive selection of cortical thymocytes. In contrast, medullary TECs (mTECs) in the thymic medulla attract positively selected thymocytes from the cortex and establish self-tolerance in T cells. A variety of molecules, including DLL4 and beta5t expressed in cTECs, as well as Aire and CCL21 expressed in mTECs, contribute to thymus function supporting T cell development and selection. Flow cytometric analysis of functionally relevant molecules in cTECs and mTECs is useful to improve our understanding of the biology of TECs, even though current methods for the preparation of single-cell suspensions of TECs can retrieve only a small fraction of TECs (approximately 1% for cTECs and approximately 10% for mTECs) from young adult mouse thymus. Because many of these functionally relevant molecules in TECs are localized within the cells, we describe our protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse TECs and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric AnalysisMechanisms

We describe protocols for the preparation of single-cell suspension of mouse thymic epithelial cells and the staining of intracellular molecules for flow cytometric analysis.

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the ...

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Caratterizzazione di timica assestamento Progenitori nell'embrione mouse Uso

Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

Isolamento di cellule dendritiche mieloidi e cellule epiteliali di timo umano

Isolamento e Trapianto di diversi invecchiato murini del timo innesti.

La promozione 3-D di aggregazione delle cellule FACS purificata timica epiteliali con EAK 16-II / EAKIIH6 autoassemblanti idrogel

L'isolamento e l'attivazione di linfociti murini

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis